利用土壤杆菌制作转化植物的方法

专利名称：：利用土壤杆菌制作转化植物的方法
技术领域：
：本申请要求2008年3月31日提出的日本国专利申请2008-094049的优先权。本发明涉及新的利用土壤杆菌(Agrobacterium)制作转化植物的方法。
背景技术：
：作为主要谷类即玉米、稻等单子叶植物的转化方法，传统上已知有电穿孔法、粒子枪法等。但是，这些物理基因导入方法存在如下问题导入了多拷贝的基因，基因的插入不是完好形式，转化植物多见畸形、不育，等等。利用土壤杆菌属细菌的基因导入法作为双子叶植物的转化法有着普遍的应用。土壤杆菌属细菌的宿主仅限于双子叶植物，认为其不能寄生在单子叶植物中(DeCleeneandDeLey1976)，但正在尝试用土壤杆菌转化单子叶植物。Grimsley等人报告称在土壤杆菌的T-DNA中插入玉米条纹病毒(Maizestreakvirus)的DNA，再将其接种至玉米生长点，确认了玉米条纹病毒的感染，而在仅接种玉米条纹病毒的DNA时，不能确认上述感染症状。这可以解释成以上现象表明土壤杆菌能够向玉米中导入DNA(Grimsley等，1987)。但是，病毒在未整合入核基因组的情况下仍具有增殖可能性，该结果并不能说明T-DNA整合到核上。Grimsley等人进一步揭示感染效率以接种至玉米的茎顶部生长点时为最高(Grimsley等，1988)，感染需要土壤杆菌的质粒的VirC基因(Grimsley等，1989)。Gould等人用针损伤玉米的生长点后，接种带有卡那霉素抗性基因和GUS基因的强病原性土壤杆菌EHA1，用卡那霉素选择处理后的生长点，结果得到了显示抗性的植物。为了确认其子代的种子中具有导入的基因而进行了Southern分析，结果对于一部分种子确认了导入基因(Gould等，1991)。这提示在用卡那霉素对经土壤杆菌处理的生长点进行选择而得到的植物体中，混合存在有转化细胞和非转化细胞(嵌合现象)。Mooney等人尝试了使用土壤杆菌对小麦的胚导入卡那霉素抗性基因。首先，通过用酶处理胚使其细胞壁损伤，然后接种土壤杆菌。处理后的愈伤组织中增殖出极少数的认为具有卡那霉素抗性的愈伤组织，但这些愈伤组织不能再生成植物体。此外，在通过Southern分析来确认卡那霉素抗性基因的存在时，在所有抗性愈伤组织中均观察到导入基因的结构突变(Mooney等，1991)。Raineri等人在损伤稻的胚盘后，用强病原性的土壤杆菌A281(pTiBo542)处理了稻的8个品种，在日本晴、藤坂5号这2个品种中观察到肿瘤状组织的增殖。而且，将带有下述质粒的土壤杆菌接种于稻胚，观察到卡那霉素抗性愈伤组织的增殖，所述质粒是在从T-DNA中除去激素合成基因而得的Ti质粒中插入卡那霉素抗性基因和GUS基因而得到的。在该抗性愈伤组织中，确认到了⑶S基因的表达，但不能获得转化植物。这些可以解释为土壤杆菌的T-DNA被导入到稻的细胞中(Raineri等，1990)。如上述，有研究报告揭示在稻、玉米、小麦等稻科作物中也能够利用土壤杆菌进行基因导入。然而，其都存在再现性的问题，此外，关于导入基因的确认是不完全的、没有给3出有说服力的结果(Potrykus1990)。Chan等人报告将在2，4_D共存下培养了2天的稻未成熟胚损伤后，在含马铃薯悬浮培养细胞的培养基中对其接种了带有nptII基因和GUS基因的土壤杆菌。在含G418培养基上培养经过处理的未成熟胚，结果由诱导产生的愈伤组织得到了再分化植物体。在通过Southern分析确认再分化植物体及其子代植物体中的GUS基因的存在时，确认了无论是再分化本代还是子代植物体中均存在导入基因(Chan等，1993)。该结果支持用土壤杆菌转化稻，但转化效率非常低，仅为1.6%，相对于供试的250个未成熟胚，显示正常生长的再生植物体只有1个个体。为了摘出稻的未成熟胚，需要大量劳力，因此很难说这样的低转化效率达到了实用水平。近年来，有报告称通过利用具有强病原性土壤杆菌的一部分病原性基因的超级二元载体，即使在稻、玉米等单子叶植物中，也能够进行稳定、高效率的转化(Hiei等，1994，Ishida等，1996)。这些报告认为，利用土壤杆菌进行的转化除了能够实现稳定、高效率的转化之外，还具有下述优点所得转化植物的突变少，导入基因的拷贝数少、且多为完好形式。继在稻、玉米中取得成功之后，还有报告称在主要谷类即小麦(Cheng等，1997)、大麦(Tingay等，1997)和蜀黍(Zhao等，2000)中利用土壤杆菌进行了转化。作为改善利用土壤杆菌转化玉米的效率的尝试，除上述之外还有在N6基本培养基中选择转化细胞(Zhao等，2001)、在培养基中添加AgNO3和羧苄西林(Zhao等，2001、Ishida等，2003)、在共存培养基中添加半胱氨酸(Frame等，2002)，等等。这样，通过改变培养基组成、选择标记基因，实现了利用土壤杆菌转化稻或玉米的效率的提高。就目前报导的利用土壤杆菌转化稻、玉米的方法而言，基本上都是经由下述步骤来获得转化植物针对接种了土壤杆菌的胚盘来源愈伤组织、或者从接种了土壤杆菌的未成熟胚诱导得到的愈伤组织，使用含除草剂成分、抗生素的培养基选择性增殖转化愈伤组织，并将所得转化细胞块着床于再分化培养基使其再分化(Deji等，2000；Negrotto等，2000；Nomura等，2000a；Nomura等，2000b；Taniguchi等，2000；Frame等，2002；Zhang等，2003；Frame等，2006)。在植物的转化方法方面，转化细胞的选择对于转化植物的制作而言是不可或缺的，没有该步骤，植物的转化就不可能成功(Potrykus等，1998；Erikson等，2005Joersbo等，2001)。多数情况下，转化细胞的选择利用下述方法进行将对抑制非转化细胞增殖的药物显示抗性的基因导入植物材料的，并用含该药物的培养基培养植物材料，从而仅选择性地增殖药物抗性基因重组入植物细胞基因组并表达的转化细胞。在用于转化细胞的选择的基因(选择标记基因)中，最常用的基因是赋予对除草剂或抗生素的抗性的基因(Kuiper等，2001)。作为赋予对除草剂的抗性的基因，bar基因、EPSP基因(DeBlock等，1987;Comai等，1985)是经常作为植物转化的选择标记基因使用的，而作为赋予对抗生素的抗性的基因，NPTII基因、HPT基因(Bevan等，1983；Waldron等，1985)是经常作为植物转化的选择标记基因使用的。此外，近年来有报告称，利用了特定糖代谢能力的PMI基因、XylA基因(Joersbo等，1998；Haldrup等，1998)等作为选择标记基因也是有效的。作为利用选择性增殖转化细胞的机制的选择标记基因，除了上述基因以外，还报导了许多基因。而且，可以认为，在使用这些基因的转化方法中，选择性增殖转化细胞的选择步骤是必须的。4在采用减压浸润法对花芽组织实施转化的Inplanta(7>^)转化方法中，可以不经由选择步骤而获得转化的种子(Bent，2000)。但是，为了从混有许多非转化种子的种子之中得到作为目标的转化种子，利用抗生素抗性基因等的选择步骤则是必要的。已经报导了下述方法导入GFP基因，以紫外线照射下发射荧光的细胞为指标可视地选择转化部位，从而获得转化植物(Elliott等，1998；Zhu等，2004)。在该方法中，虽然无需根据增殖方面的差异将转化细胞从混在的非转化细胞中选择出来，但根据有无GFP基因表达来区别转化细胞与非转化细胞并进一步将它们分开的选择步骤则是必要的。作为从转化植物除去选择标记基因的技术，已经报导的有共转化系统(Komari等，1996)、MAT载体系统(Ebinuma等，1997)和CreLox系统(Gleave等，1999；Zhang等，2003)。通过使用这些系统，能够获得不含选择标记基因的转化植物。但是，在制作无选择标记的转化植物的过程中，传统上采用的、使用药物抗性基因、植物激素合成基因等区别并选择转化细胞与非转化细胞的步骤是必要的。如上述，在植物转化方面的至今为止的方法中，分选转化细胞与非转化细胞的选择步骤是不可或缺的。在该选择步骤中，如上述，除了目的基因(G0I基因)以外还必须要有用于进行选择的选择标记基因。利用因该选择标记基因表达所产生的蛋白质、酶的功能而发生的反应例如除草剂抗性、抗生素抗性或荧光发光等，可以区别出多数非转化细胞中的很少一部分转化细胞，然后使之增殖，即可获得转化植物。但是，选择标记基因是制作出的转化植物所不需要的，而且，如果任由转化植物包含选择标记基因，则不能说不存在除草剂抗性基因、抗生素抗性基因通过转化体转播到一般非重组植物的危险，这样对转化植物的应用抱有不安心态的一般消费者也很多。此外，虽然报告了多种选择标记基因，选择标记基因受到所适应的植物种类的限制，在分多个基因进行导入时会出现问题。而且，关于从转化体除去选择标记基因的技术虽有报导，但这些方法需要耗费相当大的劳力，例如与常规转化方法相比培养期间长，需要从后代植物中选择无选择标记的个体等。如上述，尽管目前为止在转化植物的制作方面已有许多相关报导，但是关于不经由未转化的细胞、组织、器官或者个体分选出转化的细胞、组织、器官或者个体的选择步骤而获得转化体的方法尚未有报导。即，可以说截至目前，仅导入GOI(GeneofInterest)基因来获得转化植物是不可能的。专利文献1:W098/54961专利文献2:W002/12520专利文献3:W002/12521专利文献4:W02005/017169专利文献5:W02005/017152专利文献6:W02007/069643非专利文献1:DeCleene,Μ.andgall.Bot.Rev.42:389_466.非专禾U文献2=Grimsley,NAgrobacterium—mediateddeliveryofmaizeplants.Nature325:177-179.非专禾U文献3=Grimsley,NDeLey,J.(1976)Thehostrangeofcrown.，Horn,T.，Davis,J.W.andHorn,B.(1987)infectiousmaizestreakvirusinto.H.,Ramos,C.,Hein,T.andHorn,B.(1988)5MeristematictissuesofmaizeplantsaremostsusceptibletoAgroinfectionwithmaizestreakvirus.Bio/tecnology6:185-189·非专禾Ij文献4:Grimsley,N.，Horn，B.，Ramos，C.，Kado,C.andRogowsky,P.(1989)DNAtransferfromAgrobacteriumtoZeamaysorBrassicabyagroinfectionisdependentonbacterialvirulencefunctions.Mol.Gen.Genet.217:309-316.非专利文献5Gould,J.，Devey,Μ.，Hasegawa，0.，Ulian，Ε.C.，Peterson，G.andSmith，R.H.(1991)TransformationofZeamaysLusingAgrobacteriumtumefaciensandshootapex.PlantPhysiol.95:426-434.非专禾U文献6:Mooney,P.Α.，Goodwin,P.B.，Dennis，E.S.andLlewellyn,D.J.(1991)Agrobacteriumtumefaciens-genetransferintowheattissues.PlantCell,TissuesandOrganCulture25:209-218.非专利文献7RaineriiD.Μ.,BottinoiP.，Gordon，Μ·Ρ·andNesteriE.W.(1990)Agrobacterium-mediatedtransformationofrice(OryzasativaL.).Bio/technology8:33-38.非专利文献8:Potrycus,I(1990)Genetransfertocereals:anasses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发明内容发明所要解决的问题在传统的利用土壤杆菌属细菌的针对单子叶植物的基因导入方法中，利用选择标记基因导入进行的转化细胞、组织、器官或者个体的选择步骤是不可或缺的。本发明的目的是开发并提供不经由这样的选择步骤的获得转化植物的方法。解决问题的方法本发明人等为解决上述课题进行了深入研究，结果发现通过对单子叶植物进行转化效率提高处理，可以无需导入选择标记基因而以实用效率得到转化植物。具体地，本发明人等注意到一般来说在植物的转化步骤中，重组了外源基因的植物细胞的数量非常少，可以认为如果能够大幅提高转化效率，提高非转化细胞中转化细胞所占的比例，并将其保持到植物体再分化，那么就可以获得转化植物，而无需经由利用选择标记基因的选择步骤。进行深入研究的结果发现通过适宜地进行转化提高处理，能够以充分实用的效率获得转化植物，从而完成了本发明。并非意欲限定本发明，但本发明包括下述实施方式作为优选实施方式。[实施方式1]—种转化植物的制作方法，该制作方法是使用土壤杆菌的转化植物的生产方法，该使用土壤杆菌的转化植物的生产方法包括9(i)用共存培养基培养接种了土壤杆菌的植物材料的共存步骤；以及(ii)对于(i)中得到的组织，不进行愈伤组织增殖培养或者在进行愈伤组织增殖培养后，用再分化培养基进行培养，使其再分化成植物体的步骤；其中，所述转化植物的制作方法中，1)进行转化提高处理；以及2)在从共存直至再分化的任何步骤中，均不进行使用选择药物的转化细胞的选择。[实施方式2]实施方式1所述的转化植物的制作方法，其中，3)在共存步骤与再分化步骤之间不包括用愈伤组织增殖培养基培养共存培养后的组织的步骤。[实施方式3]实施方式1或2所述的转化植物的制作方法，其中，通过土壤杆菌导入的核酸不包括针对选择药物的抗性基因。[实施方式4]实施方式13中任一项所述的转化植物的制作方法，其中，1)转化提高处理是提高将目的基因导入植物细胞的效率的处理、提高始于未成熟胚等的愈伤组织诱导率的处理、或者提高始于转化愈伤组织的再分化效率的处理。[实施方式5]实施方式14中任一项所述的转化植物的制作方法，其中，1)转化提高处理选自下组热处理；离心处理；热和离心处理；加压处理；在共存培养基中添加硝酸银和/或硫酸铜；在粉末存在下接种土壤杆菌的处理；在共存步骤后的、愈伤组织增殖和/或再分化步骤中的培养基中添加羧苄西林；在愈伤组织增殖培养基中添加N6无机盐的处理；以及在共存培养基中添加半胱氨酸的处理。[实施方式6]实施方式15所述的转化植物的制作方法，其中，共存步骤包括添加属于苯甲酸类除草剂的化合物。[实施方式7]实施方式6所述的转化植物的制作方法，其中，属于苯甲酸类除草剂的化合物是苯甲酸型、水杨酸型或吡啶羧酸型。[实施方式8]实施方式6或7所述的转化植物的制作方法，其中，属于苯甲酸类除草剂的化合物是3，6-二氯-2-甲氧基苯甲酸(3，6-夕夕口口-ο-7二;y>酸，3，6-Dichloro-o-anisic10acid)或4-氨基-3，5，6-三氯吡啶羧酸。[实施方式9]实施方式18所述的转化植物的制作方法，其中，植物是单子叶植物。[实施方式10]实施方式19所述的转化植物的制作方法，其中，植物是玉米或稻。[用于实施本发明的优选实施方式]本发明提供利用土壤杆菌的转化植物的制作方法。本发明基于下述发现在利用土壤杆菌属细菌进行针对植物的基因导入的方法中，通过进行转化效率提高处理，不需要选择标记基因的导入。本发明的方法是利用土壤杆菌进行的转化植物的生产方法，该转化植物的生产方法包括(i)用共存培养基培养接种了土壤杆菌的植物材料的共存步骤，以及(ii)对于(i)中所得的组织，不进行愈伤组织增殖培养或者在进行愈伤组织增殖培养后，用再分化培养基进行培养，使其再分化成植物体的步骤；本发明的方法的特征是1)进行转化提高处理，以及2)在从共存直至再分化的全部步骤中，均不进行使用选择药物的转化细胞的选择。转化提高处理本发明的特征之一是进行转化提高处理。在本发明的方法中，“转化提高处理”是指通过进行该处理，所得转化植物的比例提高的处理。并非进行限定，具体地可以列举出提高目的基因针对植物细胞的导入效率的处理、提高未成熟胚等的愈伤组织诱导率的处理、提高转化愈伤组织的再分化效率的处理等。作为这样的转化提高处理，不受限制，包含例如以下的处理或者它们的组合。热处理(参照W098/54961)、离心处理(参照W002/12520)、热和离心处理(参照W002/12521)、加压处理(参照TO2005/017169)、在共存培养基中添加硝酸银和/或硫酸铜(参照AgNO3(Zhac)等，2001、Ishida等，2003；CuSO4(W02005/017152)、在粉末的存在下接种土壤杆菌的处理(参照W02007/069643)、在共存步骤后的、愈伤组织增殖和/或再分化步骤中的培养基中添加羧苄西林(参照Zhao等，2001、Ishida等，2003)、在愈伤组织增殖培养基中添加N6无机盐(Chu1978)的处理(Zhao等，2001)、以及在共存培养基中添加半胱氨酸的处理(Frame等，2002)。这其中，热处理、离心处理、热和离心处理、加压处理、粉末的添加均是提高基因导入效率的处理，而硝酸银、硫酸铜、羧苄西林的添加具有提高愈伤组织诱导率的效果。此外，在再分化培养基中添加硫酸铜，可以提高再分化效率。并非进行限定，热处理可以采用例如W098/54961所述的方法来进行。例如，在使11植物材料与土壤杆菌接触前，于33°C60°C、优选37°C52°C处理5秒24小时、优选1分钟24小时。离心处理可以采用例如W002/12520所述的方法来进行。例如，在使植物材料与土壤杆菌接触之前，以100G25万G、优选500G20万G、更优选1000G15万G的离心加速度处理1秒4小时、更优选1秒2小时。热和离心处理可以采用例如W002/12521所述的方法来进行。热处理以及离心处理的条件可以采用例如上述条件。加压处理可以采用例如W02005/017169所述的方法来进行。并非进行限定，加压处理优选在1.7个大气压10个大气压的范围、更优选2.4个大气压8个大气压的范围进行。在共存培养基中添加硝酸银和/或硫酸铜，记载于例如Zhao等，2001、Ishida等，2003、W02005/017152。硝酸银和/或硫酸铜可以以例如1μM50μM、优选1μM10μM的浓度添加到共存培养基中。在粉末存在下接种土壤杆菌的处理，可以采用例如W02007/069643所述的方法。具体地，可以采用例如下述方法来进行将土壤杆菌悬浊液与粉末混合来接种植物材料，或者，将植物与粉末混合，并用土壤杆菌对其进行接种。对于粉末没有限制，可以是多孔质粉末、玻璃棉或活性炭，优选多孔性陶瓷、玻璃棉或活性炭，更优选羟基磷灰石、硅胶、玻璃棉。在愈伤组织增殖培养基中添加Ν6无机盐的处理(Zhao等，2001)，可以通过向愈伤组织增殖培养基中添加N6无机盐(Chu1978)来进行。在共存培养基中添加半胱氨酸的处理，可以以10mg/Llg/L、优选50mg/L750mg/L、更优选100mg/L500mg/L在共存培养基中添加半胱氨酸。在共存步骤后的、愈伤组织增殖和/或再分化步骤中的培养基中添加羧苄西林，可以采用Zhao等，2001或Ishida等，2003所述的方法来进行。羧苄西林可以在愈伤组织增殖用培养基和/或再分化步骤中以例如50mg/L500mg/L、优选100mg/L300mg/L的浓度添加。而且，羧苄西林虽是抗生素，但其对植物基本上无毒性，可以利用它达到防止培养基中的微生物增殖的目的。本领域技术人员可以在适宜的时机/条件下进行这些处理。此外，从提高转化效率的角度出发，更加优选对它们进行适宜组合。此外，例如，对于玉米而言，优选组合热和离心处理、粉末处理、向共存培养基中添加AgNO3和/或CuSO4的处理、向愈伤组织增殖培养基和/或再分化培养基中添加羧苄西林作为抗生素的处理中的2种以上处理。而对于稻，优选包含热处理和/或离心处理，最优选组合向愈伤组织增殖培养基和/或再分化培养基中添加羧苄西林作为抗生素的处理。因此，优选的转化提高处理是热处理、离心处理、热和离心处理、加压处理、在共存培养基中添加AgNO3和/或CuSO4的处理、或在粉末的存在下接种土壤杆菌的处理、以羧苄西林作为愈伤组织增殖培养基和/或再分化培养基中的抗生素的处理，或者所述处理的组合O本发明人等通过进行这些处理，在充分增加最终获得的再分化个体中的转化个体数方面取得了成功，发现即使不进行转化细胞的选择处理，也能够获得充分的转化个体，从而确立了达到实用要求的无选择转化方法。可以通过采用PCR等方法确认导入基因的有无，此外，如果是后代个体，还可以通过确认导入基因的表型，容易地获得所述转化个体。转化细胞的诜择本发明的特点是在从共存直至再分化的用于植物转化的任何步骤中，均不进行利用通过土壤杆菌导入的核酸的特性的转化细胞的选择。作为利用通过土壤杆菌导入的核酸的特性的转化细胞的选择的例子，可以列举出使用选择药物抗性基因与选择药物的转化细胞的选择。“使用选择药物抗性基因与选择药物的转化细胞的选择”是指在从共存直至再分化的用于植物转化的任何步骤中，用添加了用于选择转化植物的药物的培养基进行培养，通过对选择药物的抗性的有无来选择转化的细胞。本发明完全不包含这样的步骤。传统技术中使用的选择药物的例子是抗生素和/或除草剂。作为抗生素，使用对植物有毒性的抗生素，例如潮霉素(〃4夕‘π4*>，Hygromycin)、卡那霉素(力t”)或杀稻瘟菌素S(义，7卜寸4夕>S，BlasticidinS)等；作为除草剂，使用例如草胺膦(7才77477，>，phosphinothricin)、双丙氨膦(匕·7，7才7，bialaphos)或草甘膦(夕'J'于、七一卜，glyphosate)等。为了进行本步骤，插入土壤杆菌中的T-DNA中的DNA，不仅要包含希望在植物中表达的基因，还必须包含选择药物抗性基因。这样的选择药物抗性基因在本
技术领域：
是公知的。例如，对于在含潮霉素作为选择药物的再分化培养基中进行再分化步骤的情况，植物中必须由土壤杆菌导入潮霉素抗性基因。在本发明中，不进行使用药物的选择步骤，因此不需要具有如下的核酸，所述核酸是通过土壤杆菌导入了选择药物抗性基因、即选择标记基因的核酸。因而，并非进行限定，在优选的实施方式中，本发明中不包含这样的核酸。或者，作为传统方法，转化植物的选择也可以基于植物细胞的“营养缺陷性(要求性)选择”、例如“糖营养缺陷性(糖要求性)”来进行。关于糖营养缺陷性，已知植物细胞能够利用的糖有蔗糖(一夕口一7)、葡萄糖等，但不能利用甘露糖。因此，用仅含甘露糖作为碳源的培养基培养植物组织时，由于没有可利用的糖，植物组织会枯死。基于糖营养缺陷性的选择正是利用了这一原理。在基于糖营养缺陷性进行转化植物的选择时，在植物组织中由土壤杆菌导入使通常植物细胞不能利用的糖类能够得以利用的基因。这样的基因是本
技术领域：
公知的，可以使用例如PMI基因、木糖异构酶基因等。本发明中，导入的核酸中不必包含这样的基因。或者，作为传统方法，还可以导入容易检测的基因作为筛选的指标，并通过有无该基因的表达进行选择。作为这样的筛选的指标的基因可以列举出GFP基因等。本发明中，导入的核酸中不必包含这样的基因。在本发明的方法中，选择标记基因是指需要转化的目的基因(G0I基因)之外的其它导入到植物中的基因，导入选择标记基因的目的是选择处于大量非转化细胞中的转化细胞。对于选择标记基因没有限制，作为该选择标记基因的例子，可以列举出除草剂抗性基因、抗生素抗性基因、荧光基因等。转化植物的制作方法利用土壤杆菌的转化植物的制作方法一般包含以下IV的步骤的全部或一部13分。I.植物材料的制备步骤II.土壤杆菌的制备和接种步骤III.共存步骤IV.愈伤组织增殖步骤V.再分化步骤I.棺物材料的制备步骤本发明的对象植物是可以适用利用土壤杆菌的转化导入方法的植物。优选为单子叶植物。用于本发明的方法的单子叶植物优选为稻科植物，其中包含稻、玉米、大麦、小麦、蜀黍等，但不限于此。用于本发明的方法的最优选植物为稻或玉米。在本发明的方法中，“植物材料”包括用于供试于利用土壤杆菌法的植物的转化的该植物的细胞、叶、根、茎、芽、花(包括雄蕊、雌蕊等)、果实、种子、发芽种子或其它任何部位的植物组织、成长点、外植片、未成熟胚、愈伤组织或不定胚样组织(以下，在本说明书中称为愈伤组织等，或简称为愈伤组织)或完全植物体等的植物的所有形态。作为本发明的方法中使用的植物材料的形态，优选的是未成熟胚或愈伤组织，最优选的是未成熟胚。在本说明书中，植物的细胞、组织、完全植物体这样的表述具有本
技术领域：
中通常采用的含义。在本说明书中，未成熟胚是指处于受粉后的成熟过程中的未成熟种子的胚和胚盘。此外，对于用于本发明的方法的未成熟胚的时期(熟期)没有特殊限制，可以在受粉后的任何时期采集。最优选受粉后2日以后的未成熟胚。优选使用未成熟胚胚盘，所述未成熟胚胚盘能够在后述的转化后通过后述的方法增殖、并可以诱导出具有再生出正常个体能力的愈伤组织。此外，未成熟胚优选自交体(inbred)、自交体之间的F1、自交体与自然受粉品种间的F1、市售Fl品种的未成熟胚。在本说明书中，愈伤组织是指无序增殖的未分化状态的细胞块。为了获得愈伤组织，可以将植物组织的分化后的细胞在包含生长素(例如2，4-D)或细胞分裂素等植物成长调节物质的培养基(称为脱分化培养基)中进行培养而获得。该为了获得愈伤组织而进行的处理称为脱分化处理，此外，该过程称为脱分化过程。在本步骤中，视需要，将植物组织、未成熟胚等从植物体、种子等中取出，制备适于转化的植物材料。植物材料的制备可以按照公知方法来进行。此外，根据需要，也可以在使植物材料被土壤杆菌感染之前进行培养。II.土壤杆菌的制备和接种步骤对本发明中使用的植物材料接种土壤杆菌。本说明书中使用的“接种”是指使土壤杆菌与植物材料接触，本
技术领域：
中各种接种土壤杆菌的方法是公知的。作为本方法，可以列举出例如在将土壤杆菌悬浮在液体培养基中而得到的悬浊液中加入植物材料的方法、将土壤杆菌的悬浊液直接滴加到共存培养基上的植物材料上的方法、向植物材料中注入土壤杆菌悬浊液的方法、和将植物材料浸渍在土壤杆菌悬浊液中并减压的方法等。然而，本发明中使用的接种了土壤杆菌的植物材料并不限于采用这些方法接种了土壤杆菌的植物材料。在该土壤杆菌的接种步骤中，为了改善利用土壤杆菌的转化效率，可以使土壤杆菌的悬浊液中包含例如乙酰丁香酮(acetosyringone)、表面活性剂、多孔性陶瓷等各种添加剂。本发明中可使用的土壤杆菌可以是公知的任何土壤杆菌属细菌，但优选为根瘤土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)或毛根土壤杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)。在本发明的优选实施方式中，土壤杆菌是例如LBA4404、EHAlOl和AGL1、C58C1等，但不限于此。很早就已知土壤细菌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens，根瘤土壤杆菌)能够引发多种双子叶植物的冠瘿病(crowngalldisease)，在二十世纪70年代，发现Ti质粒与病原性相关，而且作为Ti质粒的一部分的T-DNA被重组到植物基因组。此后明白了该T-DNA上存在与合成诱发肿瘤所必要的激素(细胞分裂素和生长素)相关的基因，其尽管是细菌基因却在植物中表达。在切除T-DNA与向植物的传递方面，在Ti质粒上的毒力(Virulence)区域(vir区域)中存在的基因群是必要的，此外，为了使T-DNA可被切出，T-DNA两端上存在的边界序列(#一夕‘一配列)是必要的。作为其他土壤杆菌属细菌的毛根土壤杆菌也具有基于Ri质粒的同样的系统(例如日本特开2000-342256的图3和图4)。由于土壤杆菌的感染，T-DNA可以重组到植物染色体组中，因此，在T-DNA上插入期望的基因的话，可以预见该基因也重组到植物基因组中。然而，因为Ti质粒非常大，有190kb以上，用标准的基因工程方法在质粒上的T-DNA上插入基因是困难的。因此，开发了用于在T-DNA上插入外源基因的方法。首先，制备了LBA4404(参照Hoekema,A.，等，(1983)，Nature,Vol.303,p.179-180)、C58C1(pGV3850)、GV3TillSE等从肿瘤性Ti质粒的T-DNA上去除了激素合成基因而得到的解除型菌株(disarmedstrains)0通过使用这些，开发了将期望的基因导入到土壤杆菌的Ti质粒T-DNA中或者将具有期望基因的T-DNA导入到土壤杆菌中的2种方法。其中的一种是进行容易的基因操作就可能插入期望的基因的方法，该方法通过三系杂交法(triparentalmating)，通过同源重组，将在大肠杆菌中能够复制的中间载体导入到土壤杆菌的解除型Ti质粒的T-DNA区域中，其称作中间载体法。还有一种是称作二元载体(binaryvector)法，该方法是基于下述结果在将T-DNA重组到植物中时，需要有vir区域，但发挥功能时却没有必要存在于相同质粒上。在该vir区域中存在有virA、virB、virC、virD、virE以及virG，(植物广4才歹夕7口夕一事典(工>夕7°，4夂株式会社发行(1989)))，所谓vir区域，是指包含virA、virB、virC、virD,virE以及virG中的全部。因此，二元载体是将T-DNA重组到可在土壤杆菌和大肠菌双方中复制的小质粒中而得到的，可以将其导入到具有解除型Ti质粒的土壤杆菌中来使用。在向土壤杆菌导入二元载体时，可以通过电穿孔法和三系杂交法等公知的方法进行。在二元载体中，有pBIN19、pBI121、pGA482等，以这些为基础，构建了大量的新型二元载体用于转化。此外，在Ri质粒系统中，也构建了同样的载体用于转化。土壤杆菌A281是强病原性(super-virulent)菌株，其宿主范围广，转化效率比其他菌株高。该特性是由于A281具有的Ti质粒-PTiBo542。到目前，已经使用PTiBo542开发了2种新系统。一种使用了具有PTiBo542解除型Ti质粒的菌株EHA101以及EHA105，由于适用于上述二元载体系统，这些作为转化能力高的系统而在各种植物的转化中被利用。另一种使用了超级二元载体系统。超级二元载体(’super-binary'vector)记载15于例如本说明书中引用的以下文献中。Hiei，Y·，等，(1994)，ThePlantJournal,Vol.6,p.271-282；Ishida，Y·，等，(1996),NatureBiotechnology,Vol.4,p.745-750；Komari,Τ.andKuboΤ.,(1999),MethodsofGeneticTransformationAgrobacteriumtumefaciens.InVasil,I.K.(ed.)Molecularimprovementofcerealcrops.,KluwerAcademicPublishers,Dordrecht,p.43-82；禾口国际公开第95/06722号小册子，关于超级二元载体系统，记载于例如特开2000-342256的图4。该系统由具有vir区域(virA、virB、virC、virD、virE以及virG(以下也分别称做“vir片段区域”))的解除型Ti质粒以及具有T-DNA的质粒组成，因此是二元载体系统的一种。但在使用超级二元载体这点上是不同的，超级二元载体是在具有T-DNA的侧的质粒上，即在二元载体上，重组了基本上去除vir片段区域中的至少一种vir片段区域而得到的vir区域的片段(其中，优选至少含有virB或virG的片段，更优选含有virB和virG的片段)。此外，在具有超级二元载体的土壤杆菌中导入重组了期望基因的T-DNA区域时，利用三系杂交法的同源重组可作为容易的方法来使用。在本发明方法中，对于作为宿主的土壤杆菌属细菌，没有特殊限制，可以优选使用根瘤土壤杆菌(例如上述的根瘤土壤杆菌LBA4404(参照H0ekema，A.，等，(1983),Nature,Vol.303,p.179-180)以及EHA101)。根据本发明的方法，只要是基于土壤杆菌属细菌中病原性(vir)区域的基因群的表达的基因导入系统，则没有特殊限制，均能够获得本发明的效果。例如，对于上述的中间载体、二元载体、强病原性二元载体、超级二元载体等中的任何载体系统都可以使用，并可以获得本发明的效果。但从进一步提高转化效率的观点出发，优选强病原性的二元载体、超级二元载体(特别在导入针对的植物是玉米时，优选使用超级二元载体)。在使用将这些载体修饰而得到的不同载体系统时，也是同样的(例如将土壤杆菌属细菌vir区域的一部分或者全部切除，然后附加性地重组到质粒中，将vir区域的一部分或者全部切除，作为新的质粒的一部分导入到土壤杆菌中等)。期望向植物中导入的基因可以通过常规方法重组到上述质粒的T-DNA区域中的限制酶部位中。对于大型且具有多个限制部位的情况，有时以常规亚克隆方法将期望的DNA导入到T-DNA区域内并非易事。在这样的情况下，可以通过三系杂交法，利用土壤杆菌属细菌细胞内的同源重组，将目的DNA导入。尽管是非限定性的，但被导入的基因的大小优选是大约IOObp200kbp。此外，将质粒导入到根瘤土壤杆菌等土壤杆菌属细菌中的操作可以通过现有方法进行，可以列举出上述的三系杂交法、电穿孔法、电注射法以及基于PEG等化学处理的方法。要导入到植物中的基因，与现有技术一样，基本上是配置在T-DNA的左右边界序列之间的。然而，因为质粒是环状的，边界序列的数可以是1，在要将多个的基因配置在不同部位上时，边界序列也可以是3个以上。此外，在土壤杆菌属细菌中，可以配置在Ti或Ri质粒上，或者也可以配置在其他质粒上。甚至，也可以配置在多种质粒上。将土壤杆菌属细菌接种于植物材料，例如可以通过使植物材料与土壤杆菌属细菌简单接触来进行。接种可以通过常规接种来进行，此外，也可以通过滴加接种来进行。常规接种是通过下述方式进行接种的方法将植物材料与土壤杆菌属细菌悬浊液(接种源)混合，将植物材料浸渍在该悬浊液中，取出浸渍后的植物材料，将其着床于培养基上，进行共存培养。例如可以这样进行制备IO6IO11CfuAil左右细胞浓度的土壤杆菌属细菌悬浊液，将植物材料在该悬浊液中浸渍310分钟左右后，在固体培养基上进行数日的共存培养。滴加接种是通过下述方式进行接种的方法在着床于培养基上的植物材料上滴加土壤杆菌属细菌悬浊液，待滴加的悬浊液干燥后，将植物材料着床于培养基的其它位置或者其它培养基上，进行共存培养。III.共存步骤本步骤中，通过在土壤杆菌的共存下用含生长素类的培养基培养如上述地接种了土壤杆菌的植物细胞，来将DNA从土壤杆菌确实地导入植物细胞。优选地，在使植物材料感染土壤杆菌的同时或者感染后、除去土壤杆菌之前，将植物材料与土壤杆菌进行共存培养。本步骤中使用的培养基在本说明书中称为“共存培养基”。在共存培养中可以使用公知的培养基。已知有例如LS-AS培养基、riN6-AS培养基、或者还有N6S3-AS培养基、2N6-AS培养基(参照Hiei，Y.，等，(1994)，ThePlantJournal,Vol.6，p.271-282)等培养基。在本发明中，优选在共存培养基中添加生长素类。生长素类通常具有使植物材料脱分化的作用，在本步骤中，基本上所有植物材料的一部分或全部成为脱分化组织(愈伤组织)。做为生长素类，可以列举出例如3，6_二氯-2-甲氧基苯甲酸(麦草畏)、4_氨基-3，5，6-三氯吡啶羧酸(毒莠定)、2，4_二氯苯氧基乙酸(2，4-D)、2，4，5-三氯苯氧基乙酸(2，4,5-T)和/或三碘苯甲酸(ΤΙΒΑ)。在本发明的优选实施方式中，共存培养基中不含有麦草畏、毒莠定、2，4-D、2，4，5-T以外的生长素类。并非进行限定，麦草畏、毒莠定、2，4-D、2，4，5_T等生长素类在共存培养基中的总量优选为0.1-5.Omg/L、更优选0.5-3.Omg/L、更优选1.0-2.Omg/L、最优选1.5mg/L。本发明人等发现当植物材料为玉米时，通过在共存培养基中添加显示生长素类中的特别是属于苯甲酸类除草剂的生长素的活性的物质，转化效率进一步提高，能够在不导入选择标记基因的情况下，获得转化植物。苯甲酸类除草剂按其基本结构可以分为(i)苯甲酸型、(ii)水杨酸型、(iii)吡啶羧酸型、(iv)对苯二甲酸型(TakematSu、1982)。然而，(iv)对苯二甲酸型不显示生长素活性，因而优选属于(i)苯甲酸型、(ii)水杨酸型、(iii)吡啶羧酸型中任何一种类型的除草剂，更优选为(ii)水杨酸型、(iii)吡啶羧酸型中的任何一种类型。更优选为麦草畏(Dicamba)(3,6-dichloro-o-anisicacid)或者毒莠定(Picloram)(4-amino_3,5,6-trichloropicolinicacid)。因此，对于玉米而言，最优选在共存培养基中添加显示属于苯甲酸类除草剂的生长素的活性的物质。或者，对于植物材料为稻的情况，优选添加2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)。本步骤中“培养”是指使植物组织着床(置床)于固体化的共存培养基上或液态共存培养基中，使之在合适的温度、明暗条件和时间(期間)内生长繁育。共存培养基的固体化可以通过添加本
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公知的固体化剂来进行，作为这样的固体化剂，已知有例如琼脂糖等。本步骤中的培养温度可以适宜地选择，优选在20°C_35°C、更优选在25°C进行。此外，本步骤的培养优选在暗处进行，但不限于此。本步骤的培养时间也可以适宜选择，优17选为1天-10天、更优选为7天。IV.愈伤组织增殖步骤在利用土壤杆菌的植物转化方法中，一般认为愈伤组织增殖步骤是必要的。通过转移至愈伤组织增殖培养基上并使愈伤组织增殖，能够获得“包含转化了的细胞的集团的细胞块”。愈伤组织增殖培养基是指包含适于使脱分化状态的细胞分裂、增殖的植物激素和营养素的培养基，在通常的转化试验中，也用作添加抑制未转化的细胞增殖的药物(选择压力)、使转化细胞选择性增殖的“选择培养基”。因而，该愈伤组织增殖步骤通常是将经过了上述共存步骤的植物材料用含生长素类的培养基进行培养，通过有无基因导入来选择转化体的步骤。本步骤中使用的培养基在本说明书中称作“选择培养基”，其中为了通过有无基因导入进行选择而包含选择药物等。本步骤是在传统方法中变更培养基的成分组成，并反复进行多次。例如，在多次的选择步骤中，通过在各选择步骤中提高选择药物的浓度，能够增加药物选择的切实性，提高获得转化植物体的可能性。本选择步骤优选进行至少2次、更优选3次。在将本步骤进行多次时，本步骤进行1次需要10天-3星期左右的时间，进行多次选择步骤总共需要5-10星期左右。因此，在利用土壤杆菌进行植物的转化方法中，本步骤是最需要时间的步骤。在传统的利用土壤杆菌的植物转化方法中，可以认为本步骤是必需的步骤。然而，本发明人等首次发现通过“转化提高处理”，可以在包括愈伤组织增殖步骤在内的、从共存直至再分化的任何一个步骤中均不进行使用选择药物的转化细胞的选择，而高效地进行转化，从而想到了本发明。因此，在本发明中优选可以省略本步骤。即，在共存步骤与再分化步骤之间不包含将共存培养后的组织用愈伤组织增殖培养基进行培养的步骤。发现由此可以进一步提高作业效率，且能在更短时间内进行转化步骤，从而更有效地获得转化植物。在本说明书中的实施例1-4、6-7中，记载了特别是对玉米而言，省略愈伤组织增殖步骤而获得植物转化成功的例子。或者，可以不在愈伤组织增殖培养基中添加选择药物，而进行愈伤组织增殖步骤。这种情况下，虽然发生愈伤组织增殖，但未进行转化体的“选择”。V.再分化步骤本步骤是进行所得细胞块的再分化、使再分化个体生长繁育、并根据需要获得完全植物体的步骤。为了从所得转化细胞再生完全植物体，可以按照公知方法(例如，Hiei,Y·，等，(1994)，ThePlantJournal，Vol.6，ρ·271-282；和Ishida，Y.，等，(1996)，NatureBiotechnology,Vol.14，p.745—750)进行。本步骤在传统方法和本发明中均是必需步骤。传统上，可以认为即使在再分化步骤中，利用选择药物进行转化体的选择也是必要的。转化植物的选择可以通过用含选择药物的再分化培养基培养经过了共存步骤的植物材料，并根据有无对选择药物的抗性来进行。然而，本发明的特征是在从共存至再分化的植物转化的任何步骤中，均不使用选择药物选择转化细胞。因此，在本发明中，即使在再分化步骤中，也不使用选择药物进行选择。本步骤中使用的培养基在本说明书中称作“再分化培养基”，作为再分化培养基的特征，可以列举出不含生长素类。可以作为再分化培养基使用的培养基可以列举出例如以LS无机盐类、N6无机盐类为基本成分的培养基，具体可以使用例如LSZ培养基等。但是，“再分化培养基”中不含选择药物。18本发明中“再分化”是指全部或部分脱分化的植物材料重新获得原植物材料或植物体的性质。通过提供给再分化步骤，脱分化组织发生再分化，可以得到完全的转化植物体。植物是否发生了再分化，可以通过观察植物的形态容易地确定。例如，可以通过是否从脱分化组织中出现了茎、叶这样的特定分化植物器官来确定。在本说明书中，“活力(vigor)”是指再分化出的植物的生长旺盛程度。植物的活力可以采用本
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通行的公知测定方法来测定。例如，对于玉米而言，可以通过进行评分并计算全部转化植物组织的平均值来求出，其中，再分化步骤后未见再分化的转化植物组织为0分，再分化出的茎叶的最大长度小于5mm的转化植物组织为1分，再分化出的茎叶的最大长度为5mm以上且小于2cm的转化植物组织为2分，再分化出的茎叶的最大长度为2cm以上的转化植物组织为3分。但是，活力的评价方法并不限于此，可以根据评价对象等，对公知方法进行适当修正。本步骤中“培养”是指使植物组织着床于固体化的再分化培养基上或液体再分化培养基中，使之在合适的温度、明暗条件和时间(期間)内生长繁育。再分化培养基的固体化可以诸如上述地利用琼脂等进行。本步骤中的培养温度可以适宜地选择，优选在200C-35°C、更优选25°C进行。此外，本步骤的培养优选在16-24小时/天的照明下进行，但不限于此。本步骤的培养时间也可以适宜选择，优选7天-21天，更优选14天。在进行本步骤之后，可以通过本
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公知的方法容易地得到完全的转化植物体。这是对于所得的再分化个体，确认有无导入基因，确定转化个体的步骤。并非限定，但优选可以采用PCR、Southern分析等。此外，通过确认导入基因的表型，可以容易地进行选择。发明的效果通过本发明，可以在单子叶植物的转化方法中稳定且有效地对期望的植物进行转化，而无需导入植物选择标记基因。[图1]图1显示了通过无选择转化获得的雪光再分化植物体的Southern印迹分析结果。从用土壤杆菌LBA4404(pSB134)进行转化、并由无选择获得的再分化植物体中抽提基因组DNA，并用限制酶HindIII进行了消化。将消化得到的DNA进行琼脂糖凝胶电泳，并与GUS探针进行了杂交。种子来源雪光(对照)(泳道C)，GUS阳性表达(均勻表达GUS)再分化植物体(泳道1-11)、⑶S点状表达再分化植物体(泳道12-17)。[图2]图2显示了通过无选择转化获得的A188再分化植物体的Southern印迹分析的结果。从用土壤杆菌LBA4404(pSB124)进行转化、并无选择获得的再分化植物体(玉米)中抽提基因组DNA，并用限制酶BamHI进行了消化。将消化得到的DNA进行琼脂糖凝胶电泳，并与⑶S探针进行了杂交。种子来源A188(对照)(泳道C)，⑶S阳性表达(均勻表达⑶S)再分化植物体(泳道1-13)。[图3]图3显示了通过无选择转化获得的A188再分化当代植物体和Tl后代植物体的Southern印迹分析的结果。将用土壤杆菌LBA4404(pSB124)进行转化、并无选择获得的再分化当代植物体(玉米)与未转化的A188植物的花粉进行交配，从所得Tl后代植物体中抽提基因组DNA，并用限制酶BamHI进行了消化。将消化所得的DNA进行琼脂糖凝胶电泳，然后与GUS探针进行了杂交。品系编号195当代(TO)植物体(泳道1)，品系编号195的⑶S阳性表达的后代(Tl)植物体(泳道2-6)，品系编号195的GUS阴性的后代(Tl)植物体(泳道7)。品系编号169当代(TO)植物体(泳道8)，品系编号169的⑶S阳性表达的后代(Tl)植物体(泳道9-13)，品系编号195的⑶S阴性的后代(Tl)植物体(泳道14)。实施例以下，基于实施例对本发明进行具体说明，但本发明不受这些实施例的限定。实施例1从采用常规方法接种的玉米未成熟胚无诜择地再分化出的棺物体中的基因表汰1.材料和方法无菌采集受粉后第714天的玉米(品种A188)的未成熟胚(大小1.0-1.5mm)，用LS-inf液体培养基(Ishida等，1996)洗涤1次。作为转化提高处理，进行了用于提高基因导入效率的前处理(46°C、3分钟的热处理和20，OOOxgUO分钟的离心处理)(Hiei等，2006)。在含100μM乙酰丁香酮的LS-inf液体培养基中以约1.0xl09cfu/ml悬浮土壤杆菌株LBA4404(pSB134)(HieiandKomari，2006)作为接种源。向经过了热/离心处理的未成熟胚中加入接种源，搅拌30秒后，室温静置5分钟。在除了包含2，4-D(2,4-dichlorophenoxy-aceticacid)、还包含5μMAgNO3和5μMCuSO4的LS-AS培养基(Ishida等，1996，固体化剂为8g/L琼脂糖)中以1.5mg/L的浓度添加麦草畏(Dicamba)(3，6-dichloro-o-anisicacid)，从而得到了共存培养基，将接种了土壤杆菌的未成熟胚着床于该共存培养基上，并使得胚盘在上。将25°C、黑暗条件下培养7天而得到的未成熟胚着床于含10μMCuSO4WLSZ培养基(Ishida等，1996)，25°C、照明条件下培养约2星期。切取观察到再分化的植物体的叶的一部分，浸渍于含0.的TritonX-100的0.IM磷酸缓冲液(pH6.8)中，37°C静置1小时。除去磷酸缓冲液后，添加了包含1.OmM5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖醛酸(X_gluc)和20%甲醇的磷酸缓冲液。37°C处理24小时后，考察了⑶S基因的表达。以下总结了实施例1的条件。材料玉米未成熟胚方法常规方法进行土壤杆菌接种转化提高处理热和离心处理、培养基中添加Ag+、Cu2+离子的处理在共存培养基中添加的生长素麦草畏共存培养后，不经过愈伤组织增殖步骤，直接进入再分化步骤。载体具有pSB134⑶S基因、潮霉素抗性基因(选择标记基因)以及部分强病原性菌株的病原性基因的超级二元载体选择处理全程无2.结果对于着床于LSZ培养基的16个未成熟胚，均观察到了植物体的再分化。从由各未20成熟胚再分化出来的植物采集413片叶片，考察了GUS基因的表达。其中的2个未成熟胚来源的叶片全部为GUS阴性。从余下的14个未成熟胚采集的叶片中，有至少1片叶片能够观察到GUS基因的表达。在5个未成熟胚中观察到了显示点状表达的叶片。在6个未成熟胚中观察到了条纹状表达GUS基因的叶片。发现有2个未成熟胚同时具有点状表达的叶片和条纹状表达的叶片。这里，条纹状表达的叶片可以认为是转化细胞与非转化细胞的嵌合体，而点状表达的叶片可以认为是一部分转化细胞中发生了基因沉默。由1个未成熟胚，获得了切口被均勻染色成蓝色的GUS阳性的叶片。本实施例的结果显示获得了玉米植物，所述玉米植物是在从共存直至再分化的任何步骤中均不进行使用抗生素等的选择步骤的条件下用GUS基因转化而得到的。实施例2从采用滴加法接种的玉米未成熟胚无诜择地再分化出的棺物体中的基因表汰1.材料和方法向按照实施例1的方法制备的土壤杆菌株LBA4404(pSB134)的接种源Iml中添加约80mg的羟基磷灰石(Bio-Rad)。作为转化提高处理，进行了用于提高基因导入效率的前处理(46°C、3分钟的热处理和20，OOOxgUO分钟的离心处理)。将上述处理后的未成熟胚(品种A188)着床于共存培养基，并使得胚盘在上，所述共存培养基在是除了包含2，4-D、还包含5μMAgNO3和5μMCuSO4的LS-AS培养基(Ishida等，1996，固体化剂为8g/L琼脂糖)中以1.5mg/L的浓度添加麦草畏而得到的。用漩涡混合器(VortexMixer)进行搅拌，使得接种源中的羟基磷灰石均勻分散，然后将5μ1的接种源滴加到未成熟胚上。滴加的接种源干燥后，将未成熟胚移动到同一培养基上的其它位置。将培养器密封后，25°C、黑暗条件下进行7天的共存培养。采用以实施例1相同的方法培养共存培养后的未成熟胚，获得再分化植物，并且考察了再分化植物的叶的⑶S基因表达。以下总结了实施例2的条件。材料玉米未成熟胚方法采用滴加法进行土壤杆菌接种转化提高处理粉末处理、热和离心处理、在培养基中添加Ag+、Cu2+离子的处理在共存步骤中添加的生长素麦草畏共存培养后，不经过愈伤组织增殖步骤，直接进入再分化步骤。载体具有PSB134GUS基因、潮霉素抗性基因(选择标记基因)以及部分强病原性菌株的病原性基因的超级二元载体选择处理全程无2.结果对于着床于LSZ培养基的12个未成熟胚均观察到了植物体的再分化。从由各未成熟胚再分化出的植物采集317片叶片，考察了GUS基因的表达。有3个未成熟胚来源的叶片全部为GUS阴性。对于从余下的9个未成熟胚采集的叶片，在至少1片叶片中观察到了GUS基因的表达。在3个未成熟胚中，观察到了显示点状表达的叶片。在4个未成熟胚中，观察到了其同时具有点状表达的叶片和条纹状表达的叶片。由2个未成熟胚，获得了切口被均勻染色成蓝色的⑶S阳性的叶片。本实施例的结果显示获得了玉米植物，所述玉米植物是在从共存直至再分化的任何步骤中均不进行使用抗生素等的选择步骤的条件下用GUS基因转化而得到的。棚列3白姓綠謹地屏體__体中的某因表汰的效果1.材料以及方法无菌采集受粉后第714天的玉米(品种A188)的未成熟胚(大小1.0-1.5mm)，用LS-inf液体培养基洗涤1次。作为转化提高处理，进行了能够用于提高基因导入效率的前处理(46°C、3分钟的热处理)。在含100μM乙酰丁香酮的LS-inf液体培养基中悬浮土壤杆菌株LBA4404(pSB124)(Komari等，1996)作为接种源。在经热处理的未成熟胚中加入接种源，搅拌30秒后，室温静置5分钟。在共存培养基上着床接种了土壤杆菌的未成熟胚，并使得胚盘向上，共着床了24个未成熟胚，所述共存培养基是在除了包含2，4-D(2,4-dichlorophenoxy-aceticacid)、还包含5μMAgNO3禾口5μMCuSO4的LS-AS培养基(Ishida等，1996，固体化剂为8g/L琼脂糖)中以6.8μM的浓度添加麦草畏(3，6-dichloro-o-anisicacid)或者毒莠定(Picloram)(4-amino_3，5，6-trichloropicolinicacid)而得至丨J的。另一方面，还使用在含5μMAgNO3和5μMCuSO4的LS-AS培养基中包含1.5mg/L(6.8yM)的2，4-D作为生长素的培养基进行了实验。着床了24个未成熟胚。将25°C、黑暗条件下培养7天而得到的未成熟胚着床于含10μMCuSO4WLSZ培养基(Ishida等，1996)，25°C、照明条件下培养约2星期。切取观察到再分化的植物体的叶的一部分，浸渍于含0.的TritonX-100的0.IM磷酸缓冲液(pH6.8)中，37°C静置1小时。除去磷酸缓冲液后，添加了包含1.OmM5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖醛酸(X_gluc)和20%甲醇的磷酸缓冲液。37°C处理24小时后，考察了⑶S基因的表达。以下总结了实施例3的条件。材料玉米未成熟胚方法采用常规方法进行土壤杆菌接种转化提高处理热处理、在培养基中添加Ag+、Cu2+离子的处理在共存培养基中添加的生长素麦草畏、毒莠定或2，4_D共存培养后，不经过愈伤组织增殖步骤，直接进入再分化步骤。载体具有pSB124⑶S基因、但不具有选择标记基因、且具有强病原性菌株的病原性基因的一部分的超级二元载体选择处理全程无2.结果对于用含麦草畏的共存培养基培养的未成熟胚，着床于LSZ培养基上的24个未成熟胚均观察到了植物体的再分化。从由各未成熟胚再分化出的植物采集叶，考察了GUS基因的表达。有13个未成熟胚来源的叶片全部为GUS阴性。从余下的11个未成熟胚采集的叶片中，有至少1片叶片能够观察到GUS基因的表达。对于点状表达、条纹状表达等不完全表达的个体也进行了计数。对于用含毒莠定的共存培养基培养出的未成熟胚，也全部在LSZ培养基上观察到了植物体的再分化。有15个未成熟胚来源的叶片全部为GUS阴性。对于从余下的9个未成熟胚采集的叶片，有至少1片叶片中能够观察到⑶S基因的表达。在用含2，4_D的培养基进行共存培养的24个未成熟胚中，有3个未成熟胚未在LSZ培养基上观察到植物的再分化。在观察到再分化的21个未成熟胚中，有4个未成熟胚能够在至少1片叶片中观察到⑶S基因的表达。这样，特别是在用含麦草畏和毒莠定的培养基进行了共存培养的未成熟胚中，观察到了高效率的植物体再分化，且所得再分化植物显示导入基因表达的比例高。而对于用含2，4_D的培养基进行了共存培养的未成熟胚，虽然也能观察到导入基因的表达，但程度稍低。本实施例的结果显示获得了玉米植物，所述玉米植物是在从共存直至再分化的任何步骤中均不进行使用抗生素等的选择步骤的条件下用GUS基因转化而得到的。2，4-D、麦草畏和毒莠定均是具有除草活性的有机化合物中显示生长素活性的物质。差别在于，2，4-D属于苯氧基类除草剂，而麦草畏和毒莠定属于苯甲酸类除草剂(竹松、1982)。以上结果显示，对于玉米而言，为了从未成熟胚以无选择的方式高效地获得转化植物，在对接种了土壤杆菌的未成熟胚进行共存培养的培养基中所包含的生长素方面，与属于苯氧基类除草剂的物质相比，属于苯甲酸类除草剂的物质更为合适。_仿丨丨4寸減心处麵碰価导至__体中的某因表汰的效果1.材料和方法无菌采集受粉后第714天的玉米(品种A188)的未成熟胚(大小1.0-1.5mm)，用LS-inf液体培养基洗涤1次。作为转化提高处理，进行了用于提高基因导入效率的前处理(461、3分钟的热处理和20，000秘、41、10分钟的离心处理)。作为对照，提供未进行上述前处理的未成熟胚。在含100μM乙酰丁香酮的LS-inf液体培养基中悬浮土壤杆菌株LBA4404(pSB124)作为接种源。在经过了热和离心前处理的未成熟胚以及作为对照的未经过前处理的未成熟胚中分别加入接种源，搅拌30秒后，室温静置5分钟。将接种了土壤杆菌的未成熟胚着床于共存培养基，并使得胚盘向上，所述共存培养基是在除了包含2，4-D(2，4-dichlorophenoxy-aceticacid)、还包含5μΜAgNO3禾口5μMCuSO4的LS-AS培养基(Ishida等，1996，固体化剂为8g/L琼脂糖)中以6.8μM的浓度添加麦草畏(3，6-dichloro-o-anisicacid)而得到的。进行了前处理的未成熟胚与未进行前处理的未成熟胚分别提供75个。试验进行了2次。将25°C、黑暗条件下培养7天而得到的未成熟胚着床于含10μMCuSO4WLSZ培养基(Ishida等，1996)，25°C、照明条件下培养约2星期。切取观察到再分化的植物体的叶的一部分，浸渍于含0.的TritonX-100的0.IM磷酸缓冲液(pH6.8)中，37°C静置1小时。除去磷酸缓冲液后，添加了包含1.OmM5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖醛酸(X_gluc)和20%甲醇的磷酸缓冲液。37°C处理24小时后，考察了⑶S基因的表达。以下，总结了实施例4的条件。材料玉米未成熟胚方法采用常规方法进行土壤杆菌接种转化提高处理(1)热和离心处理、在培养基中添加Ag+、Cu2+离子的处理(2)未进行热和离心处理，但进行了在培养基中添加Ag+、Cu2+离子的处理在共存培养基中添加的生长素麦草畏共存培养后，不经过愈伤组织增殖步骤，直接进入再分化步骤。载体具有pSB124⑶S基因、但不具有选择标记基因、且具有强病原性菌株的病原性基因的一部分的超级二元载体选择处理全程无2.结果在第1次试验中，从进行了热和离心处理的75个未成熟胚中再分化出了296个苗(shoot)。这其中，叶的组织整体显示出⑶S基因表达的有5个个体。与此相对，从未进行前处理的75个未成熟胚观察到再分化出了291个苗，其中，叶的组织整体显示出⑶S基因表达的个体为0。在第2次试验中，从进行了热/离心处理的未成熟胚再分化出了243个苗，其中，获得了4个叶的组织整体显示GUS基因表达的GUS阳性个体。对于未进行热/离心处理的前处理的未成熟胚，观察到再分化出了266个苗，这其中，叶的组织整体显示出GUS基因表达的GUS阳性个体为1个个体。这些结果显示，特别是通过对接种土壤杆菌前的未成熟胚进行热/离心处理，能够高效地获得无选择地再分化出的在植物的组织整体中表达导入基因的个体。只是，获得仅有1个个体的基因导入的结果的原因可以认为是在共存培养基中添加硝酸银和硫酸铜的效果。实施例5稻的无诜择转化1.材料和方法使开花后812天的稻(品种雪光)未成熟种子脱颖，用70%乙醇处理数秒，再用含1滴Tween20(注册商标)的次氯酸钠处理5分钟。将未成熟种子用灭菌水洗涤数次，收集1.3-1.8mm长的未成熟胚。接着，作为转化提高处理，为提高基因导入效率，对未成熟胚进行了20，OOOxgUO分钟的离心处理(Hiei等，2006)。在含100μM乙酰丁香酮的AA-inf液体培养基(HieiandKomari,2006)中以约1.0xl09cfu/ml的浓度悬浮土壤杆菌LBA4404(pSB134)(HieiandKomari,2006)作为接种源。将经过了离心处理的未成熟胚以胚盘侧向上的方式着床于nN6-As培养基(Hiei等，2006)上。向各未成熟胚分别滴加接种源5μ1，25黑暗条件下进行了7天的共存培养。共存培养后，将各未成熟胚用手术刀分割成45份。将分割后的未成熟胚以胚盘侧向上的方式着床于含250mg/L头孢噻肟(cefotaxime)与100mg/L羧苄西林的nN6培养基(Hiei等，2006)，30°C、明条件下培养约10天。对于主要因胚盘细胞的增殖而肥大起来的切片，分别将其再分割成45份。在该阶段，相对于每个未成熟胚，获得了18-25个切片。将切片以胚盘侧向上的方式着床于含250mg/L头孢噻肟和100mg/L羧苄西林的nN6培养基(Hiei等，2006)，30°C、明条件下培养约2星期。共存培养后，通过2次培养使愈伤组织增殖，每个胚盘的细胞约增殖了140倍，切片被愈伤组织覆盖。而且，细胞的增殖比率可以从各切片的大小来推定。从形成于切片的愈伤组织中，每个切片仅取1个愈伤组织(O.5-lmm大)，着床于N6R再分化培养基(Hiei等，2006)，30°C、明条件下培养2星期。从各切片仅取1个愈伤组织着床于再分化培养基的原因是为了获得来源于随机且独立的细胞的植物体。将从各愈伤组织再分化出的丛生芽(Shoot24clump)移植于N6F生根培养基(Hiei等，2006)，30°C、明条件下培养约10天，得到了完全的再分化植物体。而且，上述培养基中一概不含潮霉素、双丙氨膦(bialaphos)等选择药物。切取所得植物体的叶的一部分，将其浸渍于含0.的TritonX_100(注册商标)的0.IM磷酸缓冲液(pH6.8)中，37°C静置1小时。除去磷酸缓冲液后，添加含1.OmM5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖醛酸(X-gluc)和20%甲醇的磷酸缓冲液。37°C处理24小时后，考察了⑶S基因的表达。而且，⑶S基因表达的考察是在来自于由1个切片产生的最大的1个植物体的1片叶中实施的。转化效率采用显示GUS阳性(均勻表达GUS)的植物体数/考察GUS基因表达的植物数的比例，来进行评价。此外，为了确认导入基因是否重组到再分化植物体的基因组中，通过以下方法进行了Southern印迹分析。采用Komari(1989)的方法从再分化植物体的叶抽提DNA，对于各植物体，用限制酶Hindi11消化7μg的DNA。对于消化得到的DNA，进行0.7%琼脂糖凝胶电泳(1.5￥/11、15小时)。Southern杂交按照Sambrook等(1989)的方法实施。而且，探针使用的是作为GUS基因片段的pGL2-IG(Hiei等，1994)的SalI-SacI(1.9kb)片段。以下总结了实施例5的条件。材料稻未成熟胚方法采用常规方法进行土壤杆菌接种转化提高处理离心处理、在培养基中添加头孢噻肟、羧苄西林的处理共存步骤中添加的生长素2，4_D共存培养后，经过愈伤组织增殖步骤，然后进入再分化步骤。载体具有pSB134⑶S基因、潮霉素抗性基因(选择标记基因)以及强病原性菌株的病原性基因的一部分的超级二元载体选择处理全程无2.结果试验进行了2次(试验1和2)。试验1的结果示于表1。在试验1中，从5个未成熟胚获得了100个分割切片，并由此分别将100个愈伤组织着床于再分化培养基，从而得到了92个植物体。对于其中的73个植物体，分别取1片叶考察了GUS基因的表达，结果其中的9个植物体是在叶的组织整体中均勻表达⑶S的(⑶S阳性)转化体。转化效率相对于再分化植物体为12.3%。试验2的结果示于表2。在试验2中，从5个未成熟胚获得了107个分割切片，并由此分别将107个愈伤组织着床于再分化培养基，从而得到了100个植物体。这其中，对于95个植物体分别取1片叶考察了GUS基因的表达，结果有16个植物体是以均勻表达GUS的转化体。其转化效率相对于再分化植物体为16.8%。如上述，完全不经过选择步骤，而以相对于再分化植物体为10%以上的非常高的效率获得了转化体。试验1和试验2中均有数个植物体的叶片中GUS基因的表达呈点状(表1和表2)。该异常表达可以认为是由基因沉默引起的。而且，该显示点状表达的植物体不视为转化体。Southern印迹分析的结果如图1所示。在⑶S基因表达显示阳性的再分化植物体中，所考察的11个体全部确认了导入GUS基因的存在(图1)。对于GUS基因表达显示点状的再分化植物体，所考察的6个体也全部确认了GUS基因的存在，但任何一个个体中均存在25导入基因的拷贝数多的倾向(图1)。此外，对于⑶S基因表达为阴性的再分化植物体，也实施了Southern印迹分析，但在供试的7个植物体中均未检测出与GUS探针杂交的条带。在本实施例中，使基因导入后的未成熟胚的胚盘细胞增殖，并由从其中随机选取得愈伤组织获得了再分化植物体。这其中，有10%以上是转化了的植物体。该事实表明，通过土壤杆菌感染未成熟胚的胚盘细胞的10%以上发生了转化。[表1]使用稻未成熟胚利用土壤杆菌LBA4404(pSB134)制作无选择转化体(试验1)供试未着床于再分化得到再分化植物体数转化率成熟胚培养基的愈伤组织数(=分割切片数)植物体的愈伤组织数GUS表达GUS阳性考察(a)(均匀表达Xb)GUS点状表达GUS阴性“(b/a%)1201816201412.52201913301023.Λ3201814101317.14201818201611.1520191211108.3合计1009273916412.3[表2]使用稻未成熟胚利用土壤杆菌LBA4404(pSB134)制作无选择转化体(试验2)供试未着床于再分化得到再分化_植物体数_转化率成熟胚培养基的愈伤植物体的GUS表达GUS阳性~GUSGUS(b/a%)组织数(=分割愈伤组织数考察⑷(均匀点状表达阴性切片数)表达)(b)12321931845252220181724211818172121332261216.33231212171216.711.79.528.6合计101009516146516.8mm^^Amtm^Southern分析261.材料和方法将实施例3和4中获得的转化玉米(品种A188)于温室进行栽培。采用Komari等的方法(Komari等，(1989))从这些植物的叶提取DNA，对于各植物体，将10μg的DNA用限制酶BamHI进行消化。对于消化得到的DNA，进行0.7%琼脂糖凝胶电泳(1.5V/cm、15小时)。Southern杂交按照Sambrook等的方法(Sambrook，J.，等，(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual,2nded.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork.)实施。而且，探针使用的是作为⑶S基因片段的pGL2_IG(Hiei等，1994)的SalI-SacId.9kb)片段。2.结果任何一个转化体均显示出与⑶S探针杂交的条带。该图案因转化体而异，这表明导入基因随机插入到植物的染色体上。由此，通过分子水平的方法确认了采用无选择方法获得的玉米植物是转化体(图2)。实施例7无诜择获得的转化玉米中的导入基因向后代棺物的遗传1.材料和方法将实施例3和4中获得的转化玉米(品种A188)于温室进行栽培。采集未转化的AlSS植物的花粉，与转化植物的绒毛(絹糸)进行交配，得到了后代种子(Tl代)。将所得种子播种在加入了培养土的乙烯钵中。取播种后第11日幼苗的叶，将其浸渍于含0.的TritonX-100的0.IM磷酸缓冲液(pH6.8)中，37°C静置1小时。除去磷酸缓冲液后，添加含1.OmM5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖醛酸(X-gluc)和20%甲醇的磷酸缓冲液。37°C处理24小时后，考察了⑶S基因的表达。采用Komari(1989)的方法从转化当代植物和上述的Tl植物的叶抽提DNA，对于各植物体，将10μg的DNA用限制酶BamHI消化。对于消化得到的DNA，进行0.7%琼脂糖凝胶电泳(1.5￥/11、15小时)。Southern杂交按照Sambrook等(1989)的方法实施。而且，探针使用的是作为GUS基因片段的pGL2-IG(Hiei等，1994)的SalI-SacI(1.9kb)片段。2.结果表3显示了对通过无选择转化获得的玉米转化植物的后代植物中的GUS基因的分离进行考察的结果。[表3]通过无选择转化获得的玉米转化植物的后代植物中的⑶S基因的分离权利要求一种转化植物的制作方法，其利用土壤杆菌来生产转化植物，该方法包括(i)用共存培养基培养接种了土壤杆菌的植物材料的共存步骤；以及(ii)对于(i)中得到的组织，不进行愈伤组织增殖培养，用再分化培养基进行培养，使其再分化成植物体的步骤，或者对于(i)中得到的组织，在进行愈伤组织增殖培养后，用再分化培养基进行培养，使其再分化成植物体的步骤；其中，在所述转化植物的制作方法中，1)进行转化提高处理，以及2)在从共存直至再分化的任何步骤中，均不利用通过土壤杆菌导入的核酸的特性来选择转化细胞。2.根据权利要求1所述的转化植物的制作方法，其中，在该转化植物的制作方法中，3)在共存步骤与再分化步骤之间不包括用愈伤组织增殖培养基培养共存培养后的组织的步骤。3.根据权利要求1或2所述的转化植物的制作方法，其中，利用通过土壤杆菌所导入核酸的特性选择转化细胞是利用选择药物抗性基因与选择药物进行选择的。4.根据权利要求13中任一项所述的转化植物的制作方法，其中，1)转化提高处理是提高向植物细胞导入目的基因的效率的处理、提高针对未成熟胚等的愈伤组织诱导率的处理、或者提高针对转化愈伤组织的再分化效率的处理。5.根据权利要求14中任一项所述的转化植物的制作方法，其中，1)转化提高处理选自热处理；离心处理；热和离心处理；加压处理；在共存培养基中添加硝酸银和/或硫酸铜；在粉末存在下接种土壤杆菌的处理；在共存步骤后的、愈伤组织增殖和/或再分化步骤中的培养基中添加羧苄西林；在愈伤组织增殖培养基中添加N6无机盐的处理；以及在共存培养基中添加半胱氨酸的处理。6.根据权利要求15所述的转化植物的制作方法，其中，共存步骤包括添加属于苯甲酸类除草剂的化合物。7.根据权利要求6所述的转化植物的制作方法，其中，属于苯甲酸类除草剂的化合物是苯甲酸型、水杨酸型或吡啶羧酸型。8.根据权利要求6或7所述的转化植物的制作方法，其中，属于苯甲酸类除草剂的化合物是3，6-二氯-2-甲氧基苯甲酸或4-氨基-3，5，6-三氯吡啶羧酸。9.根据权利要求18所述的转化植物的制作方法，其中，植物是单子叶植物。10.根据权利要求19所述的转化植物的制作方法，其中，植物是玉米或稻。全文摘要本发明的目的是提供新的利用土壤杆菌的转化植物的制作方法。本发明的制作方法是利用土壤杆菌生产转化植物的方法，该方法包括(i)用共存培养基培养接种了土壤杆菌的植物材料的共存步骤；以及(ii)对于(i)中得到的组织，不进行愈伤组织增殖培养，用再分化培养基进行培养，使其再分化成植物体的步骤，或者，对于(i)中得到的组织，在进行愈伤组织增殖培养后，用再分化培养基进行培养，使其再分化成植物体的步骤；其中，所述转化植物的制作方法中，1)进行转化提高处理，以及2)在从共存直至再分化的任何步骤中，均不利用通过土壤杆菌导入的核酸的特性选择转化细胞。文档编号A01H1/00GK101983007SQ200980112149公开日2011年3月2日申请日期2009年3月24日优先权日2008年3月31日发明者樋江井佑弘,石田佑二申请人:日本烟草产业株式会社