专利名称：用于核酸递送系统的可释放聚合脂质的制作方法
用于核酸递送系统的可释放聚合脂质引用的相关申请本申请要求了 2008年12月17日提交的美国临时专利申请Nos. 61/115，371和 61/115，379的优先权，它们的内容引入本文作为参考。
背景技术：
使用核酸的治疗已被提议用于治疗多种疾病。这种提议的核酸治疗之一是反义治疗，其中治疗基因可选择性地调控与疾病相关基因的表达并能使与治疗疾病的其他治疗途径相关的副作用最小化。然而由于与这种治疗核酸的递送和稳定性相关的难题，使用核酸的治疗至今仍受限制。已提出过几种基因递送系统来克服上述难题以有效地将治疗基因导入目标区域，例如在体外或体内的癌细胞或其他细胞或组织。因此，本文提供了所需要的用于治疗目的的递送核酸的新递送系统和方法。发明概述本发明提供了含有酸可变性链接基的可释放聚合脂质以及含有其的用于核酸递送的纳米微粒组合物。聚核酸例如寡核苷酸被包封在纳米微粒复合物之内，该纳米微粒复合物含有本文所述的可释放聚合脂质、阳离子脂质和致融脂质的混合物。根据本发明的这个方面，用于递送核酸(即寡核苷酸)的可释放聚合脂质具有式 ⑴R——(L1)a——M——(L2)b——Q其中R是非抗原性聚合物；L1^2独立地选自双功能链接基；M是酸可变性链接基；Q是取代或非取代饱和或非饱和的含C4-30的基部；(a)是零或正整数；和(b)是零或正整数，其中目标基团任选地与非抗原性聚合物连接。本发明也提供了用于核酸递送的纳米微粒组合物。根据本发明，用于递送核酸 (即寡核苷酸)的纳米微粒组合物包括⑴阳离子脂质；(ii)致融脂质；和(iii)式(I)的化合物。本发明的另一方面，提供了在体内或体外将核酸(优选寡核苷酸)递送至细胞或组织的方法。通过本文所述方法导入的寡核苷酸可调控目标基因的表达。在更多方面，本发明提供了抑制目标基因表达的方法，即哺乳动物优选人的癌基因和与炎症疾病相关的基因。该方法包括将细胞例如癌细胞或组织与由本文所述的纳米微粒组合物制备的纳米微粒接触。包封在纳米微粒之内的寡核苷酸被释放并介导要治疗细胞或组织中的mRNA或蛋白的下调。纳米微粒的治疗实现了目标基因表达的调控和疾病治疗伴随相关的其他益处，例如抑制癌细胞的生长。这种治疗可作为单独治疗或作为与一种或多种可用和/或被认可的治疗联合治疗的一部分而执行。更多方面包括制备式(I)化合物以及含有其的纳米微粒的方法。本文所述的可释放聚合脂质包括酸可变性链接基。当含有生物活性基部的纳米微粒达到目标位点如酸PH的胞内或胞外环境，可释放聚合脂质开始降解，裂解纳米微粒，并在目标位点上或之内释放治疗剂。通过采用含缩酮或缩醛的基部或含亚胺的基部，纳米微粒可在中性或弱碱性条件下保持稳定。但是，在通常的低PH目标位点，例如癌细胞，缩酮和缩醛基部会降解，从而释放包封的治疗剂如寡核苷酸。当纳米微粒进入细胞并到达酸性细胞隔室例如内涵体时，含有可释放聚合脂质的纳米微粒帮助解离和释放包封在其中的核酸。不受任何理论的限制，这种特征部分归功于酸可变性链接基。缩酮或亚胺链接基是酸可变性的，在酸性环境例如内涵体中会水解。这些链接基促使了纳米微粒和内涵体的裂解，从而实现核酸的胞内释放。本发明的一个优势是含有本发明所述可释放聚合脂质的纳米微粒组合物提供了在体外递送核酸，以及在体内给予核酸的方式。这种递送技术实现了在体内治疗剂寡核苷酸的稳定性，转染效率，和生物利用度的增强。可释放聚合脂质扩展了纳米微粒的循环并防止了纳米微粒过早地从体内排泄。该聚合脂质也降低了免疫原性。本文所述可释放聚合脂质在生物流体中稳定了纳米微粒复合物和其中的核酸。不受任何理论的限制，据信，纳米微粒复合物增强了被包封的核酸的稳定性，并为核酸屏蔽了至少部分核酸酶，从而保护包封核酸在如血液或组织存在下免受降解。本文所述纳米微粒也有利地提供了如更高的转染效率。本文所述纳米微粒实现了在体外和体内没有转染剂辅助下细胞的转染。纳米微粒是安全的因为它们没有与现有已知的需要转染剂的纳米微粒相同的毒性作用。纳米微粒的高转染效率也提供了将治疗剂核酸递送至细胞的胞质和核的改善方式。本文所述纳米微粒也有利地提供了在纳米微粒制备中的稳定性和灵活性。纳米微粒可在宽范围的PH内制备，例如约2-约12。本文所述的纳米微粒也可在期望生理pH例如约7. 2-约7. 6下用于临床。本文所述的纳米递送系统也实现了足够量的治疗剂寡核苷酸选择性地用于期望的目标区域，例如经EPR(增强的穿透和保持)作用的癌细胞。因而纳米微粒组合物改善了在癌细胞或组织中特定mRNA下调。另一优势是被本文所述可释放聚合脂质实现了制备均勻大小的纳米微粒。含有本文所述可释放聚合脂质的纳米微粒复合物在缓冲条件下是稳定的。另一优势是本文所述的纳米微粒实现了生物活性分子的递送，例如一种或多种不同目标寡核苷酸的小分子化学治疗剂，从而在疾病治疗中实现协调作用。在以下描述中将显现出其他和更多优势。为了本发明的目的，术语“残基”应理解为表示化合物在经过与其他化合物的置换反应之后仍保留的部分，如聚乙二醇等。
为了本发明的目的，术语“烷基”是指饱和脂族烃，包括直链，支链，和环状烷基。术语“烷基”也包括烷硫基烷基，烷氧基烷基，环烷基烷基，杂环烷基，和C^6烷酰基烷基。优选地，烷基具有1-12个碳。更优选地，它是约1-7个碳，还更优选约1-4个碳的低级烷基。 烷基可以是取代或非取代的。当被取代时，取代基团优选包括卤素，氧，叠氮，硝基，氰基，烷基，烷氧基，烷硫基，烷硫基烷基，烷氧基烷基，烷氨基，三商素甲基，羟基，巯基，羟基，氰基， 烷矽基，环烷基，环烷基烷基，杂环烷基，杂芳基，烯基，炔基，C1^6烃酰基，芳基，和氨基。为了本发明的目的，术语“取代”是指功能基团或化合物内所含的一个或多个原子被下组中的基部之一添加或替代商素，氧，叠氮，硝基，氰基，烷基，烷氧基，烷硫基，烷硫基烷基，烷氧基烷基，烷氨基，三商素甲基，羟基，巯基，羟基，氰基，烷矽基，环烷基，环烷基烷基，杂环烷基，杂芳基，烯基，炔基，C1^6烷酰基烷基，芳基，和氨基。为了本发明的目的，术语“烯基”是指含有至少一个碳碳双键的基团，包括直链，支链，和环状基团。优选地，烯基具有2-12个碳。更优选地，它是约2-7个碳，还更优选约2-4 个碳的低级烯基。烯基可以是取代或非取代的。当被取代时，取代基团优选包括卤素，氧，叠
氮，硝基，氰基，烷基，烷氧基，烷硫基，烷硫基烷基，烷氧基烷基，烷氨基，三商素甲基，羟基， 巯基，羟基，氰基，烷矽基，环烷基，环烷基烷基，杂环烷基，杂芳基，烯基，炔基，CV6烃酰基， 芳基，和氨基。为了本发明的目的，术语“炔基”是指含有至少一个碳碳三键的基团，包括直链，支链，和环状基团。优选地，炔基具有2-12个碳。更优选地，它是约2-7个碳，还更优选约2-4 个碳的低级炔基。炔基可以是取代或非取代的。当被取代时，取代基团优选包括卤素，氧，叠氮，硝基，氰基，烷基，烷氧基，烷硫基，烷硫基烷基，烷氧基烷基，烷氨基，三商素甲基，羟基， 巯基，羟基，氰基，烷矽基，环烷基，环烷基烷基，杂环烷基，杂芳基，烯基，炔基，CV6烃酰基， 芳基，和氨基。“炔基”的示例包括丙炔基，丙炔，和3-己炔。为了本发明的目的，术语“芳基”是指含有至少一个芳族环的芳族烃环体系。芳族环可任选地与其他芳族烃环或非芳族烃环融合或附着在其上。芳基的示例包括例如苯基， 萘基，1，2，3，4_四氢化萘和联苯。芳基的优选示例包括苯基和萘基。为了本发明的目的，术语“环烷基”是指C3_8环状烃。环烷基的示例包括环丙基，环丁基，环戊基，环己基，环庚基和环辛基。为了本发明的目的，术语“环烯基”是指含有至少一个碳碳双键的C3_8环状烃。环烯基的示例包括环戊烯基，环戊二烯基，环己烯基，1，3-环己二烯基，环庚烯基，环庚三烯基和环辛烯基。为了本发明的目的，术语“环烷基烷基”是指被C3_8环烷基取代的烷基。环烷基烷基的示例包括环丙基甲基和环戊基乙基。为了本发明的目的，术语“烷氧基”是指通过氧桥附着在母分子基部上的指定数量碳原子的烷基。烷氧基的示例包括例如甲氧基，乙氧基，丙氧基和异丙氧基。为了本发明的目的，术语“烷芳基”是指被烷基取代的芳基。为了本发明的目的，术语“芳烷基”是指被芳基取代的烷基。为了本发明的目的，术语“烷氧基烷基”是指被烷氧基取代的烷基。 为了本发明的目的，术语“烷硫基烷基，，是指烷基-S-烷基硫醚，例如甲基硫代甲基或甲基硫代乙基。
为了本发明的目的，术语“氨基”是指本领域已知的通过用有机基团替代一个或多个氢残基由氨衍生的含氮基团。例如，术语“酰胺基”和“烷氨基”是指分别具有酰基和烷基取代基的特定N取代有机基团。为了本发明的目的，术语“烷酰基”是指被烷基取代的碳酰基。为了本发明的目的，术语“卤素”或“卤”是指氟，氯，溴和碘。为了本发明的目的，术语“杂环烷基”是指含有至少一个选自氮，氧，和硫的杂原子的非芳族环体系。杂环烷基环可任选地与其他杂环烷基环和/或非芳族烃环融合或附着在其上。优选的杂环烷基具有3-7个环原子。杂环烷基的示例包括例如哌嗪，吗啉，哌啶，四氢呋喃，吡咯烷，和吡唑。优选的杂环烷基包括哌啶基，哌啶基，吗啉基，和吡咯烷基。为了本发明的目的，术语“杂芳基”是指含有至少一个选自氮，氧和硫的杂原子的芳族环体系。杂芳基可与一个或多个杂芳环，芳族或非芳族烃环或杂环烷基环融合或附着在其上。杂芳基的示例包括例如吡啶，呋喃，噻吩，5，6，7，8-四氢异喹啉和嘧啶。杂芳基的优选示例包括噻吩基，苯并噻吩基，吡啶基，喹啉基，吡嗪基，嘧啶基，咪唑基，苯并咪唑基， 呋喃基，噻唑基，苯并噻唑，异恶唑基，恶二唑基，异噻唑基，苯并异噻唑基，三唑基，三唑基， 吡咯基，吲哚基，吡唑基和苯并吡唑基。为了本发明的目的，术语“杂原子”是指氮，氧和硫。在一些实施方式中，取代烷基包括羧烷基，氨烷基，二烷氨基，羟烷基和巯烷基；取代烯基包括羧烯基，氨烯基，二烯氨基，羟烯基和巯烯基；取代炔基包括羧炔基，氨炔基，二炔氨基，羟炔基和巯炔基；取代环烷基包括基部例如4-氯环己基；芳基包括基部例如萘基； 取代芳基包括基部例如3-溴苯基；芳烷基包括基部例如甲苯基；杂烷基包括基部例如乙基噻吩；取代杂芳基包括基部例如3-甲氧基噻吩；烷氧基包括基部例如甲氧基；和苯氧基包括基部例如3-硝基苯氧基。卤素应该理解为包括氟，氯，碘和溴。为了本发明的目的，术语“正整数”应该理解为包括等于或大于1的整数，并处于普通技术人员理解的合理范围之内。为了本发明的目的，术语“连接”应该理解为包括一个基团与另一个的共价(优选)或非共价附着，即化学反应的结果。为了本发明的目的，术语“有效量”和“足够量”应该表示实现本领域普通技术人员所理解的期望效果或治疗效果的量。使用本文所述纳米微粒组合物形成的术语“纳米微粒”和/或“纳米微粒复合物” 是指脂质基的纳米复合物。纳米微粒含有包封在阳离子脂质，致融脂质和PEG脂质混合物中的核酸例如寡核苷酸。可选地，可形成无核酸的纳米微粒。为了本发明的目的，术语“治疗剂寡核苷酸”是指用作药物或诊断剂的寡核苷酸。为了本发明的目的，“基因表达的调控”应该理解为广义地包括任何类型基因优选与癌症和炎症相关基因相对于未用本文所述纳米微粒治疗所观察到的基因表达的下调或上调，无论给予途径与否。为了本发明的目的，术语“抑制目标基因的表达”应该理解为表示mRNA的表达或翻译的蛋白量相对于未用本文所述纳米微粒治疗所观察的降低或衰减。这种抑制的适宜试验包括例如使用本领域技术人员已知的技术检查蛋白或mRNA水平例如点印染，northern 印染，原位杂交，ELISA，免疫沉淀，酶功能，以及本领域技术人员已知的表型试验。治疗条件可通过例如细胞优选癌细胞或组织中mRNA水平降低所证实。广义而言，应该认为当获得期望反应时即视为发生了成功的抑制或治疗。例如成功抑制或治疗可通过获得如10%或更高(即20^,30^,40% )的肿瘤生长抑制相关基因的下调来确定。可选地，相对于未用本文所述纳米微粒治疗所观察的，成功的治疗可通过获得癌细胞或组织中癌基因mRNA水平包括本领域技术人员预期的其他临床标记降低至少 20%或优选30%，更优选40%或更高(级50%或80%)来确定。而且，在说明中使用单数术语并不表示仅限于此。因而，例如提及含有寡核苷酸， 胆固醇类似物，阳离子脂质，致融脂质，式(I)的可释放聚合脂质，PEG脂质等的组合物是指一个或多个分子的寡核苷酸，胆固醇类似物，阳离子脂质，致融脂质，式(I)的可释放聚合脂质，PEG脂质等。也预期了寡核苷酸可以是相同或不同类型的基因。也应理解本发明不限于本文公开的特定结构，工艺步骤，及物质，这些结构，工艺步骤和物质都可有所改变。也应理解本文所采用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，而不会对其造成限制，因为本发明的范围由所附权利要求及其同义物所限定。附图简要说明
图1图示了制备化合物3的反应流程，如实施例6-8所述的。图2图示了制备化合物10的反应流程，如实施例9-14所述的。图3图示了制备化合物17的反应流程，如实施例15-21所述的。图4图示了制备化合物22的反应流程，如实施例2246所述的。图5图示了制备化合物沈的反应流程，如实施例27- 所述的。图6图示了制备化合物30的反应流程，如实施例四-30所述的。图7图示了制备化合物32的反应流程，如实施例31-32所述的。图8图示了制备化合物38的反应流程，如实施例33-37所述的。图9图示了制备化合物44的反应流程，如实施例38-43所述的。
图10图示了制备化合物46的反应流程，如实施例44-45所述的。
图11图示了制备化合物52的反应流程，如实施例46-50所述的。
图12描述了 pH7. 4纳米微粒大小的变化，如实施例52所述的。每个制剂中Oh是左柱；池是中柱；和1 是右柱。
图13A描述了 pH6. 5和5. 5纳米微粒大小的变化，如实施例53所述的。
图1 描述了 pH 5. 5缓冲液中纳米微粒的稳定性，是纳米微粒大小的函数。
图14描述了小鼠血浆中纳米微粒的稳定性，如实施例M所述的。
图15描述了证实荧光核酸的细胞摄入和胞质定位的细胞光显微图像，如实施例阳所述的。
图16描述了可释放聚合脂质量的增加对于目标基因表达调控的影响，如实施例 56所述的。从左到右，每个实验组(NP4，NP5，NP6，NP7)内的柱分别标记为600nM，300nM， 150nM，75nM ；在最右边，单柱是UTC。
图17描述了在15PC3细胞中用包封在本文所述纳米微粒内的siRNA敲除 BCLanRNA，如实施例57所述的。柱标记如下空白NP 左柱是200η，右柱是IOOnM ；2% rPEG 从左到右200nM，IOOnM, 50nM, 25nM ；0090]5% rPEG 从左到右200nM，IOOnM, 50nM, 25nM ；
0091] 8% rPEG 从左到右200nM，IOOnM, 50nM, 25nM ；
0092] 混杂的从左到右200nM，IOOnM, 50nM, 25nM ；
0093]模仿的，如所指示的；
0094] UTC，如所指示的；和
0095]Bcl2_Tfx 从左到右200nM，25nM，IOnM, IOOnMc
0096]
图18描述了在A549细胞中用包封在本文所述纳米微粒内的SiRNA敲除BCL2 mRNA，如实施例58所述的。柱标记如下
0097]UT :A549 ；
0098]NP-I 从左到右200nM，IOOnM, 50nM, 25nM, 12. 5nM
0099]NP-2 从左到右200nM，IOOnM, 50nM, 25nM, 12. 5nM
0100]NP-3 从左到右200nM，IOOnM, 50nM, 25nM, 12. 5nM
0101]NP-SCR 从左到右200nM，IOOnM, 50nM, 25nM, 12. 5nM ；禾口
0102]Bcl2 siRNA T :从左到右12. 5ηΜ，4ηΜ，0· 8ηΜ，0· 16ηΜ，0· 03nM，A549T。
0103]
图19描述了在DU149细胞中用含有LNA的寡核苷酸敲除ErbB3 mRNA，如实施例 59所述的。柱标记如下
0104]A 从左到右1000nM，500nM，250nM，125nM, 62nM, OnM
0105]B 从左到右1000nM，500nM，250nM，125nM, 62nM, OnM
0106]C 从左到右1000nM，500nM，250nM，125nM, 62nM, OnM
0107]D 从左到右1000nM，500nM，250nM，125nM, 62nM, OnM ；和
0108]E 从左到右1000nM，500nM，250nM
0109]F :从左到右125mM，62nM，0nM。
0110]发明的详细描述
0111]A.概述
0112]1.式(I)的可释放聚合脂质
0113]本发明的一个方面，提供了式(I)的可释放聚合脂质
0114]
权利要求
1.一种化合物，其具有式(I)
2.如权利要求1的化合物，其中M是含有缩酮或缩醛的基部或含有亚胺的基部。
3.如权利要求1的化合物，其中M是-CR3R4-O-CR1R2-O-CR5R6-,其中R1^独立地选自下组氢，CV6烷基，C2_6烯基，c2_6炔基，C3_19支链烷基，C3_8环烷基，CV6 取代烷基，c2-6取代烯基，c2-6取代炔基，C3_8取代环烷基，芳基，取代芳基，杂芳基，取代杂芳基，C1^6杂烷基，取代Ch6杂烷基，C1^6烷氧基，芳氧基，C1^6杂烷氧基，杂芳氧基，c2_6烷酰基， 芳酰基，c2-6烷氧酰基，芳氧酰基，c2-6烷酰氧基，芳酰氧基，c2-6取代烷酰基，取代芳酰基，C2-6 取代烷酰氧基，取代芳氧酰基，和取代芳酰氧基；和R3-6独立地选自下组氢，氨基，取代氨基，叠氮，羧基，氰基，商素，羟基，硝基，矽醚，磺酰基，巯基，CV6烷巯基，芳巯基，取代芳巯基，取代CV6烷硫基，CV6烷基，C2_6烯基，c2-6炔基， c3_19支链烷基，c3_8环烷基，Ch6取代烷基，c2_6取代烯基，c2_6取代炔基，C3_8取代环烷基，芳基，取代芳基，杂芳基，取代杂芳基，C1^6杂烷基，取代CV6杂烷基，CV6烷氧基，芳氧基，C1^6杂烷氧基，杂芳氧基，c2-6烷酰基，芳酰基，仏-6烷氧酰基，芳氧酰基，c2-6烷酰氧基，芳酰氧基， c2_6取代烷酰基，取代芳酰基，c2_6取代烷酰氧基，取代芳氧酰基，和取代芳酰氧基。
4.如权利要求3的化合物，其中R1和&独立地选自下组氢，C1^6烷基，C3_8支链烷基， C3_8环烷基，C1^6取代烷基，c3_8取代环烷基，芳基，取代芳基和芳烷基。
5.如权利要求1的化合物，其中M是-N= CR10-或-CRltl = N-，其中Rltl是氢，C^6烷基， c3_8支链烷基，c3_8环烷基，CV6取代烷基，c3_8取代环烷基，芳基和取代芳基。
6.如权利要求1的化合物，其中R是聚亚烷氧化物。
7.如权利要求1的化合物，其中R是聚乙二醇。
8.如权利要求1的化合物，其中Q具有式(Ia)结构 (Ia)
9.如权利要求8的化合物，其具有式(II)
10.如权利要求8的化合物，其具有式(IIa)
11.如权利要求8的化合物，其具有式(IIb)或(II’ b)
12.如权利要求8的化合物，其中Qh独立地包括选自下组的基团C12-22烷基， C12-22烯基，C12-22烷氧基，月桂酰(C12)，肉豆蔻酰(C14)，棕榈酰(C16)，硬脂酰(C18)， 油酰(C18)，和瓢儿菜酰(C2》；饱和或非饱和C12烷氧基，C14烷氧基，C16烷氧基，C18烷氧基，C20烷氧基，和C22烷氧基；和饱和或非饱和C12烷基，C14烷基，C16烷基，C18烷基， C20烷基和C22烷基。
13.如权利要求8的化合物，其中L11,L12和L13独立地选自9。权利要求6的化合物， 其中L11, L12和L13独立地选自下组-(CR31IUtll-;和 -Y26 (CR31R32) ql-， 其中Y26 是0，NR33，或 S ；R31_32独立地选自下组氢，羟基，Cp6烷基，C3_12支链烷基，C3_8环烷基，Cp6取代烷基， C3_8取代环烷基，C1^6杂烷基，取代Cp6杂烷基，CV6烷氧基，苯氧基和CV6杂烷氧基；I^3选自以下氢，CV6烷基，C3_12支链烷基，C3_8环烷基，C1^6取代烷基，C3_8取代环烷基， (V6杂烷基，取代CV6杂烷基，Ch6烷氧基，苯氧基和Ch6杂烷氧基；和 (ql)是零或正整数。
14.如权利要求8的化合物，其中L11,L12和L13独立地选自下组-CH2-，- (CH2) 2_，- (CH 2) 3_，- (CH2) 4_，- (CH2) 5_，- (CH2) 6_，-O (CH2) 2_，-O (CH2)「，-O (CH2) 4_，-O (CH2) 5_，-O (CH2) 6_，和 CH(OH)-。
15.如权利要求1的化合物，其中L1选自下组 -(CR21R22)tl-[C( = Y16)]a3-,-(CR21R22) tlY17~ (CR23R24) t2~ (Yis) a2- [C ( — Yi6) ] a3-' _ (CR2iR22CR23R24Y17) u_ [C ( — Yi6)]a3_， ~~ (CR21R22CR23R24Y17) tl (CR25R2θ) t4~ (Yl8) a2~ [C ( — Yi6) ] a3-'~~ [ (CR21R22CR23R24) t2Yl7] t3 (CR25R26) t4~ (Yl8) a2~ ^C ( — Y16) ] a3~' ~~ (CR21R22) tl~ [ (CR23R24)七2了17] t3 (CR25R26) t4~ (Yl8) a2~ ^C ( — Y16) ] a3~'
16.如权利要求1的化合物，其中L1选自下组-ch2- (ch2) 2_，- (ch2) 3", - (ch2) 4_，- (ch2) 5_，- (ch2) 6_，-nh (ch2)--ch(nh2)ch2-,-(ch2) 4-c( = 0)-，- (ch2) 5-c( = 0)-，- (ch2) 6-c( = 0)-，-nh(ch2)--ch2ch2o-ch2o-c ( = 0)-， -(ch2ch2o) 2-ch20-c ( = 0)-， -(ch2ch2o) 3-ch20-c ( = 0)-， -(ch2ch2o) 2-c ( = 0)-， -ch2ch2o-ch2ch2nh-c ( = 0)-， -(ch2ch2o) 2-ch2ch2nh-c ( = 0)-，-ch2-o-ch2ch2o-ch2ch2nh-c ( = 0)-，-ch2-o- (ch2ch2o) 2-ch2ch2nh-c ( = 0)-， -ch2-o-ch2ch2o-ch2c ( = 0)-， -ch2-o- (ch2ch2o) 2-ch2c ( = 0)-， -(ch2) 4-c ( = 0)nh-，- (ch2) 5-c ( = 0)nh-， -(ch2) 6-c( = 0)nh-， -ch2ch2o-ch2o-c ( = 0) -nh-, -(ch2ch2o) 2-ch20-c ( = 0) -nh-, -(ch2ch2o) 3-ch20-c ( = 0) -nh-, -(ch2ch2o) 2-c ( = 0) -nh-,
17. 是独立的 0，NR，29，或 S ；R’ 21_27独立地选自下组氢，羟基，氨基，Cp6烷基，C3_12支链烷基，C3_8环烷基，Ch6取代烷基，c3_8取代环烷基，芳基，取代芳基，芳烷基，C1^6杂烷基，取代CV6杂烷基，C1^6烷氧基，苯氧基和Cp6杂烷氧基；R’ 28_29独立地选自下组氧，CV6烷基，C3_12支链烷基，C3_8环烷基，Ch6取代烷基，c3_8取代环烷基，芳基，取代芳基，芳烷基，Ch6杂烷基，取代Ch6杂烷基，CV6烷氧基，苯氧基和CV6 杂烷氧基；(t，1)，(t，2)，(t，3)和(t，4)是独立的零或正整数；和(a，2)和(a，3)是独立的零或1。
18.如权利要求1的化合物，其中L2选自下组
19.如权利要求8的化合物，其中Q选自下组:
20.如权利要求8的化合物，其中Q选自下组
21.如权利要求1的化合物，其中目标基团附着在R基团上，而化合物1具有下式 A——R——(L1)a——M——(L2)b——Q，其A是目标基团。
22.如权利要求21的化合物，其中目标基团是细胞表面目标基团。
23.如权利要求21的化合物，其中目标基团选自下组RGD肽，叶酸盐，茴香酰胺，血管内皮细胞生长因子，FGF2，生长激素抑制剂和生长激素抑制剂同类物，铁传递蛋白，促黑细胞激素，ApoE和ApoE肽，冯·威利布兰德因子(von Willebrand' s Factor)和冯·威禾Ij 布兰德因子肽，腺病毒纤维蛋白和腺病毒纤维蛋白肽，PDl和PDl肽，EGF和EGF肽。
24.如权利要求8的化合物，其具有式(IIIa)(
25.如权利要求8的化合物，其具有式(IIIb)或(III’ b)
26.如权利要求1的化合物，其选自下组
27.如权利要求1的化合物，其选自下组
28.纳米微粒组合物，其含有如权利要求1的式(I)化合物。
29.如权利要求观的纳米微粒组合物，其中式(I)化合物选自下组
30.
31.
32.如权利要求观的纳米微粒组合物，其中致融脂质选自下组DOPE，DOGP,P0PC, DSPC，EPC，及其组合。
33.如权利要求观的纳米微粒组合物，其进一步含有胆固醇。
34.如权利要求观的纳米微粒组合物，其中阳离子脂质具有的摩尔比是纳米微粒组合物中总脂质的约10% -约99. 9%范围。
35.如权利要求34的纳米微粒组合物，其中阳离子脂质具有的摩尔比是纳米微粒组合物中总脂质的约15% -约25%范围。
36.如权利要求33的纳米微粒组合物，其中阳离子脂质，非胆固醇基致融脂质，式(I)化合物，和胆固醇的摩尔比是纳米微粒组合物中总脂质的约 15-25% 20-78% 0-50% 2-10%。
37.如权利要求33的纳米微粒组合物，其选自下组阳离子脂质，二酰磷脂酰乙醇胺，式⑴的化合物，和胆固醇的混合物；阳离子脂质，二酰磷脂酰胆碱，式(I)的化合物，和胆固醇的混合物；阳离子脂质，二酰磷脂酰乙醇胺，二酰磷脂酰胆碱，式(I)的化合物，和胆固醇的混合物；和阳离子脂质，二酰磷脂酰乙醇胺，式(I)的化合物，与神经酰胺偶联的PEG(PEG-Cer)， 和胆固醇的混合物。
38.如权利要求36的纳米微粒组合物，其中所包括的阳离子脂质，DOPE，胆固醇，和式 (I)化合物的摩尔比是纳米微粒组合物中总脂质的约18% 52% 20% 10%，而其中阳离子脂质是
39.纳米微粒，其含有包封在如权利要求观的纳米微粒组合物之内的核酸。
40.如权利要求39的纳米微粒，其中核酸是单链或双链寡核苷酸。
41.如权利要求39的纳米微粒，其中核酸选自下组脱氧核苷酸，核糖核苷酸，锁核酸 (LNA)，短干扰RNA (siRNA)，微RNA (miRNA)，适配体，肽骨架核酸(PNA)，磷酰二胺吗啉代寡核苷酸(PMO)，三环-DNA，双链寡核苷酸(诱骗0DN)，催化RNA序列(RNAi)，适配体，镜像异构体，CpG低聚体及其组合。
42.如权利要求40的纳米微粒，其中寡核苷酸是反义寡核苷酸。
43.如权利要求40的纳米微粒，其中寡核苷酸具有磷酸二酯键，硫代磷酸酯连接及其组合。
44.如权利要求40的纳米微粒，其中寡核苷酸包括LNA。
45.如权利要求40的纳米微粒，其中寡核苷酸具有约8-约50个核苷酸。
46.如权利要求40的纳米微粒，其中寡核苷酸抑制了致癌基因，促血管生成途径基因， 促细胞增殖途径基因，病毒感染原基因，和促炎症途径基因的表达。
47.如权利要求40的纳米微粒，其中寡核苷酸选自下组反义bcl-2寡核苷酸，反义 HIF-I α寡核苷酸，反义存活素寡核苷酸，反义ErbB3寡核苷酸，反义PIK3CA寡核苷酸，反义 HSP27寡核苷酸，反义雄激素受体寡核苷酸，反义Gli2寡核苷酸，和反义β -连环蛋白寡核苷酸。
48.如权利要求40的纳米微粒，其中寡核苷酸含有以下所列的八个或更多连续核苷酸SEQ ID NO :1, SEQ ID NOs 2 and 3，SEQ ID NO :3，SEQ ID NO :4，SEQ ID NO :5, SEQ ID NO :6，SEQ ID NO :7, SEQ ID NO -J, SEQ ID NO :8，SEQ ID NO -.9, SEQ ID NO 10，SEQ ID NO :11, SEQ ID NO :12, SEQ ID NO :13, SEQ ID NO :14, SEQ ID NO :15, SEQ ID N0:16，和SEQ ID NO : 17，每个核酸都是天然存在的或修饰的核酸。
49.如权利要求40的纳米微粒，其中核酸和阳离子脂质的电荷比是约1 20-约 20 1。
50.如权利要求40的纳米微粒，其中纳米微粒具有约50-约150nm的大小。
51.一种治疗哺乳动物疾病的方法，其包括将权利要求39的纳米微粒给药至有需要的哺乳动物。
52.一种将寡核苷酸导入细胞的方法，其包括使细胞与权利要求39的纳米微粒接触。
53.一种抑制人细胞或组织中基因表达的方法，其包括使人细胞或组织与权利要求38 的纳米微粒接触。
54.如权利要求53的方法，其中细胞或组织是癌细胞或组织。
55.一种下调哺乳动物基因表达的方法，其包括将有效量的权利要求39的纳米微粒给药至有需要的哺乳动物。
56.一种抑制癌细胞生长或增殖的方法，其包括使癌细胞与权利要求39的纳米微粒接触。
57.如权利要求55的方法，还包括给药抗癌剂。
全文摘要
本发明涉及与可释放脂质偶联的聚合物和用于递送核酸含有其的纳米微粒组合物和使用其调控基因表达的方法。尤其是，本发明涉及含有酸可变性链接基的可释放聚合脂质，该链接基是基于含有缩酮或缩醛的链接基或含有亚胺的链接基。
文档编号A01N43/04GK102231950SQ200980145890
公开日2011年11月2日 申请日期2009年11月17日 优先权日2008年11月17日
发明者乌德春, 史连军, 彦魏丽, 赵洪 申请人:安龙制药公司