专利名称：在重组异养型微生物中制备特制油的制作方法
技术领域：
本发明涉及从微生物中生产油类、燃料和油脂化学品。特别地，本文公开的内容涉及产油微藻、对其进行培养用以生产有用化合物(包括脂类、脂肪酸酷、脂肪酸、醛、醇和烷烃)的方法，以及对其进行遗传学改造用以提高生产效率和改变由其生产之油类类型和组分的方法和试剂。
背景技术：
化石燃料是埋葬之有机材料的可燃地质沉积物的通用术语，其由腐烂的动植物形成，所述动植物通过数亿年间暴露于地壳中的热和压力已经转化成为原油、煤、天然气或者重油。化石燃料是有限的、不可再生的资源。全球经济带来的能源需求增加还使得碳氢化合物的成本压カ逐渐增加。除了能源之外，很多エ业，包括塑料业和化学品生产商，主要依赖于获得碳氢化合物作为其生产过程的给料。对目前供给来源的具有成本效益的替代品可以帮助减轻能源和这些原材料成本的不断増加的压力。PCT公开No. 2008/151149描述了为了生产油类而培养藻类的方法和材料，并且特别地举例说明从由微藻原壳小球藻(Chlorellaprotothecoides)生产的油类中生产柴油。仍然需要提供在微藻中生产油类的改进型方法，特别是以较高产率和效率生产链长度较短、饱和度较高并且没有色素的油类的方法。本发明符合这种需求。发明概述本发明提供了原藻(PiOtotheca)属的细胞，其包含外源基因，在一些实施方案中，细胞是 Prototheca moriformis、Protothecakrugani、Prototheca stagnora 或者Prototheca zopfii菌种的细胞株，在其他实施方案中，细胞具有与SEQ ID NO :11-19中一种或者多种序列具有至少70、75、80、85或者95%核苷酸一致性的23S rRNA序列。在ー些细胞中，外源基因是编码序列并且与启动子处于可操作连接，在ー些实施方案中，启动子来源于原藻属菌种的内源性基因。在进ー步的实施方案中，编码序列编码选自由蔗糖转化酶、脂肪酰基-ACP硫酯酶、脂肪酰基-CoA/醛还原酶、脂肪酰基-CoA还原酶、脂肪醛还原酶、月旨肪醛脱羰基酶、酰基载体蛋白和赋予抗生素抗性的蛋白组成的组中的蛋白。对链长度为CS、C10、C12或者C14的ー种或者多种脂肪酰基-ACP底物具有水解活性之脂肪酰基-ACP硫酯酶的ー些实施方案包括与SEQ ID NO :59、61、63和138-140中ー种或者多种序列具有至少50、60、70、80或者90%氨基酸一致性的酰基-ACP硫酯酶。在进ー步的实施方案中，编码序列包含微藻质体祀向序列，在一些实施方案中，微藻是原藻属或者小球藻属或者小球藻科其他属的菌种。在一些实施方案中，质体靶向序列与SEQ ID NO :127-133中ー种或者多种序列具有至少20、25、35、45或者55%的氨基酸序列一致性，并且能够靶向由没有定位于质体基因组的外源基因所编码的蛋白。在其他实施方案 中，启动子响应于细胞培养基中氮气的減少或者消失而上调，例如上调至少3倍，其通过测定当胞外环境从含有至少IOmM或者5mM氮气变成不含氮气时原藻属细胞中转录子丰度而得到。在进ー步的实施方案中，启动子包含SEQ ID NO :91-102中ー种序列的50个或者更多核苷酸片段。在其他实施方案中，细胞具有与SEQ ID NO 11-19中ー种或者多种序列具有至少70、75、80、85或者95%核苷酸一致性的23S rRNA序列。在其他实施方案中，外源基因整合到细胞染色体中。在本发明细胞的附加实施方案中，细胞是原藻属的细胞，并且包含外源脂肪酰基-ACP硫酯酶基因和C8-C14含量为细胞总脂量之至少4%的脂类特性，其中C8含量是细胞总脂量的至少O. 3%，ClO含量是细胞总脂量的至少2%，C12含量是细胞总脂量的至少2%, C14含量是细胞总脂量的至少4%，C8-C14含量是细胞总脂量的10-30%、20-30%或者至少10、20或30%。在一些实施方案中，细胞是Prototheca moriformis、Protothecakrugani、Prototheca stagnora或者Prototheca zopfii菌种的细胞株,在其他实施方案中，细胞具有与SEQ ID NO :11-19中ー种或者多种序列具有至少70、75、80、85或者95%核苷酸一致性的23S rRNA序列。在其他实施方案中，外源脂肪酰基-ACP硫酯酶基因整合到细胞染色体中。本发明的其他实施方案包括制备甘油三酯组合物的方法，所述甘油三酯组合物具有C8-C14含量为甘油三酯组合物之至少4% w/w或者面积百分比的脂类特性，其中C8含量是至少O. 3% w/w或者面积百分比，ClO含量是至少2% w/w或者面积百分比，C12含量是至少2% w/w或者面积百分比，C14含量是至少4% w/w或者面积百分比，C8-C14含量是10-30%、20-30%或者至少10、20或30% w/w或者面积百分比。本发明还包括制备甘油三酯的方法，其包括培养上述细胞，其中所述细胞还包含编码蔗糖转化酶的外源基因，并且蔗糖作为碳源供给。在一些实施方案中，蔗糖转化酶与SEQ ID NO :3，20-29和90中ー种或者多种序列具有至少50、60、70、80或者90%的氨基酸一致性。本发明的实施方案包括甘油三酯组合物以及含有甘油三酯组合物的细胞，所述组合物具有C8-C14含量为至少4%的脂类特性和一种或者多种下列属性0. 1-0. 4微克/ml的总类胡卜素、少于O. 4微克/ml的总类胡卜素、少于O. 001微克/ml的番茄红素；少于O. 02微克/ml的β-胡萝卜素、每千克油中少于O. 02毫克的叶绿素；每100克油中
O.40-0. 60毫克的Y-生育酚；每克油中O. 2-0. 5毫克的总生育三烯酚、每克油中少于O. 4毫克的总生育三烯酚、每100克油中4-8mg的菜油甾醇，每100克油中40_60mg的豆甾醇。在本发明的一些实施方案中，甘油三酯油类组合物具有C8-C14含量为甘油三酯组合物之至少4% w/w或者面积百分比的脂类特性，其中CS含量是至少O. 3% w/w或者面积百分比，ClO含量是至少2% w/w或者面积百分比，C12含量是至少2% w/w或者面积百分比，C14含量是至少4 % w/w或者面积百分比，C8-C14含量是10-30 %、20-30 %或者至少10、20或30 %w/w或者面积百分比。在其他实施方案中，甘油三酯油类组合物与至少另外一种组合物混合，所述另外ー种组合物选自由下列物质组成的组大豆、油菜籽、加拿大油菜、棕榈叶、棕仁、椰子、玉米、废植物、乌桕油、橄榄、向日葵、棉花籽、鸡脂肪、牛脂、微藻、大型藻类、萼距花(Cuphea)、亚麻、花生、精选白色动物油脂、猪油、亚麻芥油(Camelina sativa)、芥菜籽、腰果、燕麦、羽扇豆、洋麻、金盏花、大麻、咖啡豆、亚麻仁(亚麻籽)、棒子、大戟属、南瓜籽、香菜、山茶、芝麻、红花、稻米、油桐树、可可、干椰子肉、罌粟花、蓖麻籽、碧根果、加州希蒙得木、麻风树、夏威夷果、巴西坚果、鳄梨、石油或者上 述任意ー种油类的馏分。本发明的方法还包括通过进行ー个或者多个化学反应来对前面涉及的油类进行加工，用以产生游离脂肪酸和进行皂化作用，所述化学反应选自以下反应转酯基作用、氢化作用、加氢裂解作用、脱氧作用、异构化作用、酯交换作用、羟基化作用、水解作用。本发明还包括从前面涉及之油类的氢化作用制备的碳氢化合物燃料。在一些实施方案中，从分离自原藻属细胞的甘油三酯中制备碳氢化合物燃料，其中ASTM D86T10-T90蒸馏范围是至少25°C。在其他实施方案中，从分离自原藻属细胞的甘油三酯中制备脂肪酸烷基酯，其中组合物具有少于120秒的ASTM D6751A1低温适应时间。本发明还包括一种组合物，其包含(a)包含一种或者多种单糖的多糖，所述单糖由20-30摩尔百分比的半乳糖、55-65摩尔百分比的葡萄糖和5_15摩尔百分比的甘露糖组成；(b)蛋白质；和(c)包含与SEQ ID NO :11-19中ー种或者多种序列具有至少70、75、80、85或者95%核苷酸一致性之23S rRNA序列的DNA ;和(d)外源基因。在一些实施方案中，所述外源基因选自蔗糖转化酶和脂肪酰基-ACP硫酯酶，在进ー步的实施方案中，组合物进一歩包含脂类，所述脂类具有C8-C14含量为至少4%的脂类特性。在其他实施方案中，组合物以用作动物饲料而制备。本发明包括编码启动子的重组核苷酸，所述启动子响应于原藻属细胞培养基中氮气的減少或者消失而上调，例如上调至少3倍，其通过测定当胞外环境从含有至少IOmM或者5mM氮气变成不含氮气时原藻属细胞中的转录子丰度而得到。在一些实施方案中，重组核苷酸包含SEQ ID NO :91-102中ー种序列的50个或者更多核苷酸片段。本发明还包括包含表达盒的核苷酸载体，所述表达盒包含(a)在原藻属细胞中具有活性的启动子；和(b)与启动子处于可操作连接的编码序列，其中所述编码序列含有表I中最优选或者第二最优选的密码子，其占编码序列中密码子的至少20、30、40、50、60或者80%。在ー些载体中，编码序列包含与脂肪酰基-ACP硫酯酶读码框相同的质体靶向序列，所述脂肪酰基-ACP硫酯酶包括对链长度为C8、C10、C12或C14的ー种或者多种脂肪酰基-ACP底物具有水解活性的硫酯酶。一些载体包含编码能够使蛋白靶向原藻属细胞质体之多肽的质体靶向序列，包括微藻质体靶向序列和与SEQ ID Nos. 127-133中ー种或者多种序列具有至少20、30、35、45或者55%氨基酸序列一致性并且能够使蛋白靶向原藻属细胞质体的质体靶向序列。本发明额外的载体包含原藻属细胞核基因组外源性核酸序列，其中所述序列的长度是至少200个核苷酸，一些载体包含原藻属细胞核基因组外源性第一和第二核酸序列，其中所述第一和第ニ序列(a)长度均是至少200个核苷酸；(b)处于表达盒侧翼；和(C)位于相同的原藻染色体上，其间隔不大于5、10、15、20和50kB。本发明还包括与SEQ ID NO :134-135中ー种或者两种序列具有至少80、90、95或者98%核苷酸一致性的重组核酸和编码与SEQ IDNO =136-137中ー种或者两种序列具有至少80、90、95或者98%氨基酸一致性之蛋白的重组核酸。
本发明还包括制备甘油三酯组合物的方法，其包括(a)在固定碳源存在下培养原藻属细胞群，其中(i)所述细胞含有外源基因；(ii)所述细胞积累至少10、20、30、40、60或者70%细胞干重的脂类；和(iii)所述固定碳源选自由高粱和经解聚的纤维素类物质组成的组；和(b)从培养的微生物中分离脂类组分。在一些实施方案中，固定碳源是经解聚的纤维素类物质，其选自由玉米秸杆、芒草(Miscanthus)、饲用高粱、甜菜渣和甘庶渣组成的组，可选地在培养步骤前用水对这些材料进行 清洗。在ー些方法中，固定碳源是经解聚的纤维素类物质，并且在培养步骤前使经解聚的纤维素类物质中的葡萄糖水平浓缩至至少300g/升、至少400g/升、至少500g/升或者至少600g/升，并随着细胞生长和积累脂质的时间供给到培养基中。在ー些方法中，外源基因编码对链长度为C8、C10、C12或C14的ー种或者多种脂肪酰基-ACP底物具有水解活性的脂肪酰基-ACP硫酯酶，在ー些方法中甘油三酯具有C8-C14含量为至少4%的脂类特性和一种或者多种下列属性0. 1-0. 4微克/ml的总类胡卜素、每千克油中少于O. 02毫克的叶绿素；每100克油中O. 40-0. 60毫克的Y -生育酚；每克油中O. 2-0. 5毫克的总生育三烯酚、每100克油中4-8mg的菜油甾醇和每100克油中40-60mg的豆甾醇。本发明中进ー步的方法包括制备甘油三酯组合物，其包括(a)在经解聚的纤维素类物质存在下培养微生物群；其中(i)在培养步骤前用水对经解聚的纤维素类物质进行清洗；(ii)细胞积累至少10、20、30、40、60或者70%细胞干重的脂类；和(iii)在培养步骤前使经解聚的纤维素类物质中的葡萄糖水平浓缩至至少300、400、500或者600g/升；(iv)以分批补料反应方式培养微生物，其中用葡萄糖水平为至少300、400、500或者600g/升的经解聚的纤维素类物质供给微生物；和(b)从培养的微生物中分离脂类组分。在一些实施方案中，固定碳源是经解聚的纤维素类物质，其选自由玉米秸杆、芒草、饲用高粱、甜菜浆和甘蔗渣组成的组。在进ー步的实施方案中，微生物是原藻属的菌种并且含有一种外源基因，所述外源基因包括对链长度为C8、C10、C12或C14的ー种或者多种脂肪酰基-ACP底物具有水解活性的脂肪酰基-ACP硫酯酶。本发明中进ー步的方法包括生产甘油三酯油类，其包括在蔗糖作为碳源存在下培养具有与SEQ ID NO :30具有至少90或者96%核苷酸一致性之23S rRNA序列的细胞。本发明还包括制备化学品的方法，其包括对甘油三酯油类进行ー种或者多种化学反应和皂化作用，所述化学反应选自以下反应转酯基作用、氢化作用、加氢裂解作用、脱氧作用、异构化作用、酯交换作用、羟基化作用、水解作用，其中所述油类具有C8-C14含量为至少4%的脂类特性和一种或者多种下列属性0. 1-0. 4微克/ml的总类胡卜素、每千克油中少于O. 02毫克的叶绿素；每100克油中O. 10-0. 60毫克的Y-生育酚；每克油中O. 1-0.5毫克的总生育三烯酸、每克油中少于O. 4毫克的总生育三烯酸、每100克油中l_8mg的菜油甾醇，每100克油中10-60mg的豆留醇。ー些方法通过培养包含外源脂肪酰基-ACP硫酯酶基因的原藻属细胞来生产油类而进行，所述基因编码对链长度为C8、C10、C12或C14的ー种或者多种脂肪酰基-ACP底物具有水解活性的脂肪酰基-ACP硫酯酶。在ー些方法中，水解反应选自由皂化作用、酸水解、碱水解、酶促水解、催化水解和热压水水解组成的组，其包括将油类分解为甘油和脂肪酸的催化水解反应。在进ー步的方法中，使脂肪酸发生氨基化反应，以产生脂肪族含氮化合物，或者发生臭氧分解反应，以产生一元和ニ元酸。在一些实施方案中，对油类使用甘油三酯分解方法，所述方法选自由酶促分解和压カ分解组成的组。在ー些方法中，水解反应之后进行缩合反应。其他方法包括对油类进行氢化处理反应，可选地其中在氢化处理反应之前或者同时使氢化处理反应的产物进行脱氧反应或者缩合反应。一些方法额外地包括气体脱除反应。额外的方法包括通过进行脱氧反应对前面涉及的油类进行加工，所述反应选自由氢解反应、氢化作用、连续性氢化-氢解反应、连续性氢解-氢化反应和氢化-氢解联合反应组成的组。在ー些方法中，脱氧反应之后进行缩合反应。其他方法包括对前面涉及的油类进行酯化反应，可选地进行酯交 换反应或者转酯基反应。其他方法包括对前面涉及的油类进行羟基化反应，可选地其中在羟基化反应之后进行缩合反应。
图I和图2显示以高粱作为碳源生长之原藻菌种和Cholorellaluteoviridis菌株SAG 2214的生长曲线。图3显示SAG 2214在葡萄糖和蔗糖中生长的时间进程。图4显示如实施例3中所描述在原藻转化中使用的表达盒。图5显示如实施例3中所描述UTEX菌株14353个转化子的Southern印迹分析结
果O图6显示经密码子优化和未经密码子优化之suc2 (酵母蔗糖转化酶(ylnv))转基因质粒的图解。示出相关限制性克隆位点，箭头表示转录方向。图7a显示在纤维素来源的糖类(玉米秸杆、甜菜浆、高粱蔗、芒草和葡萄糖对照)中生长之Prototheca moriformis的结果。以光学密度测定(A750读值)表示生长。图7b显示与葡萄糖/木糖对照相比，利用不同水平的玉米秸杆来源之纤维素糖类进行Prototheca moriformis生长实验的结果。图7c显示木糖对在原藻培养物中生产脂类的影响。图7d显示盐浓度(Na2SO4)和防沫剂对原藻生长(以细胞干重(DCW)表示)的影响。图8显示对多种纤维素类物质(甘蔗渣、高粱蔗、芒草和甜菜浆)进行热水处理和得到的糖蒸汽对原藻生长的影响。图9显示重复循环进行热水处理后纤维素类生物质(甘蔗渣、高粱蔗、芒草和甜菜浆)中羟甲基糠醛(HMF)和糠醛水平不断減少。图10显示纤维素类物质糖化过程的图解，其产生适用于在发酵罐中进行异养型油类生产的糖蒸汽。图11显示重复循环进行热水处理后在经汽爆的甘蔗渣中HMF和糠醛水平不断减少。图12显示原藻转化中使用之硫酯酶质粒的图解。异源β_微管蛋白(驱动NeoK)和谷氨酸脱氢酶启动子分别来源于莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)和ChlorellaSorokiniana0硝酸盐还原酶3’UTR来源于普通小球藻(Chlorella vulgaris)。示出相关限制性克隆位点，箭头显示转录方向。图13显示由原藻甘油三酯油类生产之可再生柴油的色谱图。发明详述本发明起因于发现原藻和某些相关微生物出乎意料地具有能够经济并且大量地生产油类、燃料和其他碳氢化合物或者脂类组合物的优势特性，以及发现对这些微生物进行遗传学改造用以促进这些特性的方法和试剂。除了其他应用之外，由这些微生物生产的油类可以用于运输燃料、石油化学品和/或食品和化妆品エ业中。脂类的转酯基作用产生可用作生物柴油的长链脂肪酸酷。可以对其他酶促和化学过程进行调整，用以产生脂肪酸、醛、醇、烷烃和烯烃。在一些应用中，可以生产可再生柴油、喷气燃料或者其他碳氢化合物。本发明还提供了培养微藻的方法，用以增加产量和脂类 产率，和/或更具成本效率地生产本文中描述的组合物。为了便于阅读，发明的详细描述分为几个章节。第I章提供了本文中使用之术语的定义。第2章描述了本发明方法中使用的培养条件。第3章描述了遗传工程方法和材料。第4章描述了使原藻能够利用蔗糖的遗传工程。第5章描述了使原藻调整脂类生物合成的遗传工程。第6章描述了制备燃料和化学品的方法。第7章公开了本发明的实施例和实施方案。发明详述后面是实施例，其阐述了发明的多个方面和实施方案。I.定义除非另有定义，本文中使用的所有技术性和学术性术语具有与本发明所属领域技术人员通常理解的含义。下列參考文献为技术人员提供本发明中使用之许多术语的一般定义Singleton 等，Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology (2nded. 1994) ；The CambridgeDictionary of Science and Technology (Walker ed.,1988)；The Glossaryof Genetics, 5th Ed. , R. Rieger 等，(eds. ), Springer Verlag (1991);和Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。除非另有说明，本文中使用的下列术语具有赋予其的含义。“在微藻中具有活性”是指在微藻中具有功能的核酸。例如，用于驱动抗生素抗性基因以赋予转基因微藻抗生素抗性的启动子在微藻中具有活性。“酰基载体蛋白”或者“ACP”是脂肪酸合成过程中作为硫酯在4’ -磷酸泛酰巯基こ胺基团的远端硫醇基处与生长的酰基链结合的蛋白，其包含脂肪酸合成酶复合体组分。“酰基-Cok分子”或者“酰基_CoA”是包含酰基基团的ー种分子，所述酰基基团在辅酶A 4’ -磷酸泛酰巯基こ胺基团的远端硫醇基处通过硫酯键连接与辅酶A共价连接。“面积百分比”是指利用FAME GC/FID检测方法观察到的峰面积，在所述检测方法中，检测前将样品中的每个脂肪酸均转化成为脂肪酸甲酷(FAME)。例如，与其他任何脂肪酸例如C14:1相比，对于14个碳原子的饱和脂肪酸(C14:0)可以观察到单独的峰。每种FAME的峰面积与其在混合物中的百分含量是成比例的，其可以基于样品中存在之所有峰的总和来计算(即[特异性峰的面积/所有被测峰的总面积]X 100)。当涉及本发明之油类和细胞的脂类特性吋，“C8-C14含量为至少4% ”是指细胞中或者提取的甘油脂组合物中总脂肪酸的至少4%具有包括8、10、12或者14个碳原子的链长度。“无菌的”是无其他有生命的生物体污染的生物体培养物。“生物柴油”是利用生物学方法产生的脂肪酸酰酯，其适于在柴油发动机中用作燃料。“生物质”是通过细胞生长和/或繁殖产生的物质。生物质可以包含细胞和/或胞内内含物以及胞外物质，其包括但不限于由细胞分泌的化合物。“生物反应器”是封闭或者半封闭腔体，细胞培养于其中，可选地以悬浮形式。
“催化剂”是一种试剂，例如分子或者大分子复合体，其能够帮助或者促进反应物至产物的化学反应而不会成为产物的一部分。催化剂使反应速率增加，接着催化剂可以作用于另ー个反应物，以生成产物。催化剂一般使反应所需的总活化能降低，以使反应更快地或者在较低温度下进行。因此，可以更快地到 达反应平衡。催化剂的示例包括酶，其是生物催化剂；热，其是非生物催化剂；和在化石油类提炼过程中使用的金属。“纤维素类物质”是纤维素的消化产物，其包括葡萄糖和木糖，以及可选地额外的化合物(例如ニ糖、寡糖、木质素、糠醛和其他化合物)。纤维素类物质来源的非限定性示例包括甘蔗渣、甜菜浆、玉米秸杆、木片、锯末和柳枝稷。“共培养”和其变体例如“共培育”和“共发酵”是指在相同的生物反应器中存在两种或者多种类型的细胞。两种或者多种类型的细胞可以均是微生物，例如微藻，或者可以是微藻细胞与ー种不同的细胞类型培养。培养条件可以是刺激两种或者多种类型细胞生长和/或繁殖的条件，或者是促进两种或者多种细胞中的一种或者其子代生长和/或繁殖同时使剩余细胞保持生长的条件。“辅助因子”是除底物之外的任何分子，是酶发挥其酶促活性所需的分子。“互补DNA”或者“ cDNA”是mRNA的DNA拷贝，一般通过信使RNA (mRNA)的逆转录或者扩增(例如通过聚合酶链式反应(“PCR”))获得。“培育”或者其变体例如“培养”和“发酵”是指通过使用可选和/或可控条件有意地刺激一种或者多种细胞的生长(细胞大小、细胞内含物和/或细胞活性増加)和/或繁殖(通过有丝分裂使细胞数量増加)。生长和繁殖的组合可以称作増殖。可选和/或可控条件的示例包括使用限定性培养基(具有已知特性，例如PH值、离子強度和碳源)、指定温度、氧压、ニ氧化碳水平和在生物反应器中生长。培育不是指自然界中微生物的生长或繁殖或者除此之外无人为干渉；例如，最终变成化石以产生地质原油之生物体的自然生长不是培育。“细胞裂解”是低渗环境中细胞的裂解。细胞裂解是由过度渗透或者水向细胞内侧运动(水分过多)引起。细胞不能承受内侧水的渗透压，因此发生爆炸。“脱脂粉(Delipidated meal) ”和“脱脂的微生物生物质”是油类被提取或者分离后的微生物生物质，其通过利用机械(即通过压榨机实施)，或者溶剂萃取，或者二者同时使用。与从微生物生物质中提取或者分离油类/脂类之前相比，脱脂粉中油类/脂类含量減少，但是其含有ー些残留的油类/脂类。“表达载体”或者“表达构建体”或者“质粒”或者“重组DNA构建体”是指通过人为干涉制备的核酸，包括利用使得宿主细胞中特定核酸进行转录和/或翻译的一系列特定核酸元件通过重组方法或者直接的化学合成来制备。表达载体可以是质粒、病毒或者核酸片段的一部分。表达载体通常包含需要转录的核酸，其与启动子可操作地连接。“外源基因”是编码被引入(“转化”)细胞中之RNA和/或蛋白表达的核酸。经转化的细胞可以被称为重组细胞，其中可以引入额外的外源基因。相对于被转化的细胞，夕卜源基因可以来源于不同物种(因而是异源的)，或者来源于相同物种(因而是同源的)。因此，外源基因可以包括相对于基因的内源拷贝在细胞基因组中占据不同位置或者处于不同控制下的同源基因。外源基因可以在细胞中存在多于ー个拷贝。外源基因可以通过插入基因组或者作为附加分子存在于细胞中。
“外源提供”是指提供到细胞培养之培养基中的分子。“压榨”是从原材料(例如大豆和油菜籽)中提取油类的ー种机械方法。压榨机是ー种螺旋型机器，其挤压材料使其通过封闭桶样的腔。原材料进入压榨机的ー侧，废饼从另ー侧挤出，而油从箱体柱子之间渗出并被收 集。该机器使用由螺杆转动产生的摩擦力和持续压カ来移动并挤压原材料。油通过不能使固体通过的小开ロ渗出。由于原材料被挤压，通常摩擦力使得其变热。“脂肪酰基-ACP硫酯酶”是在脂类合成过程中催化从酰基载体蛋白中切割下脂肪酸的酶。“脂肪酰基-CoA/醛还原酶”是催化酰基-CoA还原成为伯醇的酶。“脂肪酰基-CoA还原酶”是催化酰基-CoA还原成为醛的酶。“脂肪醛脱羰基酶”是催化脂肪醛转化成为烷烃的酶。“脂肪醛还原酶”是催化醛还原成为伯醇的酶。“固定碳源”是ー种含碳分子，通常是有机分子，其在环境温度和压カ下以固体或者液体形式存在于培养基中，可以被培养于培养基中的微生物使用。“匀浆物”是被物理破坏的生物质。“碳氢化合物”是仅含有氢原子和碳原子的分子，其中碳原子共价连接形成直链、支化、环状或者部分环状的主链，氢原子连接到主链上。碳氢化合物的分子结构从最简单的甲烷(CH4)(天然气成分)形式到非常大并且非常复杂的结构(例如在原油中发现的浙青质、石油和浙青)之间变化。碳氢化合物可以是气态、液态或者固态形式，或者这些形式的任意组合，并且主链中相邻的碳原子之间具有一个或者多个双键或三键。因此，该术语包括直链、支化、环状或者部分环状的烷烃、烯烃、脂类和石蜡。其示例包括丙烷、丁烷、戊烷、己烧、羊烧和S烯。“碳氢比”是分子中氢原子和碳原子的比率(基于原子对原子)。该比率可以用于指碳氢化合物分子中碳原子和氢原子的数量。例如，具有最高比率的碳氢化合物是甲烷CH4(4 I)。“疏水组分”是材料的一部分或者片段，其在疏水相中比在水相中可溶性更高。疏水组分在水中基本上是不可溶的并且一般是非极性的。“脂类产率增加”是指微生物培养物产量増加，例如通过增加每升培养物的细胞干重、増加生产脂类之细胞的百分比或者増加单位时间内每升培养物体积的脂类总量。“诱导型启动子”是响应于特定刺激物而介导可操作连接之基因进行转录的启动子。“可操作连接”是两个核酸序列之间的功能性连接，所述核酸序列例如控制序列(通常是启动子)和相连序列(通常是编码蛋白的序列，也被称为编码序列)。如果启动子可以介导外源基因转录，那么启动子与外源基因处于可操作连接。“原位”是指“在适当位置”或者“在其原始位置”。“营养物质的限制性浓度”是培养基中化合物的浓度，其限制培养之微生物的繁殖。“营养物质的非限制性浓度”是在特定培养期间提供最大繁殖的浓度。因此，在营养物质限定性浓度存在下，特定培养期间产生的细胞数低于当营养物质是非限定性吋。当营养物质的浓度大于提供最大繁殖的浓度时，该营养物质在培养基中被称为是“过量”的。
“脂酶”是ー种水溶性酶，其催化水不溶性脂类底物的酯键发生水解。脂酶催化脂类水解成为甘油和脂肪酸。“脂类修饰酶”是指ー种改变脂类共 价结构的酶。脂修饰酶的示例包括脂酶、脂肪酰基-ACP硫酯酶、脂肪酰基-CoA/醛还原酶、脂肪酰基-CoA还原酶、脂肪醛还原酶和脂肪醛脱羰基酶。“脂类途径酶”是在脂类代谢(即脂类合成、修饰或者降解)中发挥作用的任何酶，和对脂类进行化学修饰的任何蛋白以及载体蛋白。“脂类”是溶于非极性溶剂(例如醚和氯仿)并且相对或者完全不溶于水的ー类分子。脂类分子具有这些特性，因为其大部分由天然疏水性长烃尾组成。脂类的示例包括脂肪酸(饱和的和不饱和的)、甘油酯或者甘油脂(例如甘油单酯、甘油ニ酷、甘油三酯或者中性脂肪，和磷酸甘油酯或者甘油磷酸脂)、非甘油酯(鞘脂类、留醇脂(包括胆留醇和留类激素)、异戊烯醇脂(包括萜类)、脂肪醇、蜡和聚酮类)和复合脂类衍生物(连接糖的脂类，或者糖脂，和连接蛋白的脂类)。“脂肪”是脂类的亚族，其被称为“甘油三酷”。“裂解物”是含有已裂解细胞之内含物的溶液。“裂解”是生物体的质膜以及可选地细胞壁发生破裂，其足以释放至少部分胞内内含物，通常通过机械、病毒或者滲透机制损伤其完整性。“溶解”是生物体或者细胞的细胞膜和可选的细胞壁被破坏，其足以释放至少部分胞内内含物。“微藻”是含有叶绿体和或者质体并且可选地能够进行光合作用的真核微生物，或者是能够进行光合作用的原核微生物。微藻包括不能代谢固定碳源作为能量的专性光能自养生物以及完全依靠固定碳源生存的异养生物。微藻包括细胞分裂后即刻与姐妹细胞分离的单细胞生物(例如衣藻(Chlamydomonas))以及例如团藻(Volvox,两种不同细胞类型简单多细胞光合微生物)的微生物。微藻包括例如小球藻、杜氏藻(Dunaliella)和原藻细胞。微藻还包括显示细胞-细胞粘附的其他光合微生物，例如阿格门氏藻(Agmenellum)、鱼腥藻(Anabaena)和桑椹藻(Pyrobotrys)。微藻还包括丧失进行光合作用的能力的专性异常微生物，例如某些双鞭甲藻和原藻属中的菌种。“微生物”是用显微镜可以看见的单细胞生物体。对于两种蛋白或者基因的“天然共表达”是指蛋白或者其基因天然共表达于其来源的组织或者生物体中，例如由于编码这两种蛋白的基因处于共同调控序列的控制下，或者由于其响应于相同刺激物而表达。“渗透压休克”是渗透压突然減少后溶液中细胞的破裂。有时诱导发生渗透压休克，以使这些细胞的细胞内含物释放到溶液中。“多糖降解酶”是能够催化多糖水解或者糖化的任意酶。例如，纤维素酶催化纤维素水解。“多糖”或者“聚糖”是由通过糖苷键连接到一起的单糖组成的碳水化合物。可以利用酶使纤维素解聚，以产生单糖(例如木糖和葡萄糖)以及较大的ニ糖和寡糖。“启动子”是指导核酸转录的核酸控制序列。本文中使用的启动子包括转录起始位点附近的必需核酸序列，例如对于II型聚合酶启动子来说是TATA元件。可选地,启动子还包括远端的增强子或者抑制子元件，其可以位于离转录起始位点远至数千碱基对的位置。
“重组”是由于引入外源核酸或者改变天然核酸而被修饰细胞、核酸、蛋白或者载体。因此，例如重组细胞表达细胞天然形式中没有的基因或者表达与由非重组细胞表达的那些基因不同的天然基因。“重组核酸”是一般通过对核酸进行处理(例如利用聚合酶和核酸内切酶)最初于体外形成的核酸，或者除此之外以通常天然不存在的形式。可以产生重组核酸，例如用以使两种或者多种核酸处于可操 作连接。因此，就本发明的目的而言，认为通过使通常天然不会连接的DNA分子相连接而于外体形成的分离的核酸或者表达载体是重组的。重组核酸一经制备并引入到宿主细胞或者生物体中，其可以利用宿主细胞体内的细胞体系进行复制；但是，这种核酸ー经重组产生，尽管其随后在胞内进行复制，就本发明的目的而言仍然认为其是重组的。类似地，“重组蛋白”是利用重组技术制备的蛋白，即通过重组核酸的表达。“可再生柴油”是烷烃(例如C10:0、C12:0、C14:0、C16:0和C18:0、)的混合物，其通过脂类的加氧作用和脱氧作用产生。“糖化”是使生物质(通常是纤维素类生物质或者木质纤维素类生物质)转化成为单糖(例如葡萄糖和木糖)的过程。“经糖化的”或者“经解聚的”是指通过糖化作用已经转化成为单糖的纤维素类物质或者生物质。“声波作用”是利用声波能量破坏生物材料(例如细胞)的过程。“糠醛种类”是保持相同的基本结构特性的2_呋喃羧基醛或者其衍生物。“干草”是收集谷粒后作物的经干燥的茎和叶。“蔗糖利用基因”是当表达时帮助细胞能够利用蔗糖作为能量来源的基因。本文中由蔗糖利用基因编码的蛋白被称为“蔗糖利用酶”，其包括蔗糖转运蛋白、蔗糖转化酶和己糖激酶(例如葡糖激酶和果糖激酶)。II.培养本发明总体涉及原藻菌株的培养，特别是重组原藻菌株的培养，用以生产脂类。为了便于阅读，本章分为几节。第I节描述了原藻菌种和菌株，以及如何通过基因组DNA的比较来鉴定新的原藻菌种和菌株以及相关微藻。第2节描述了用于培养的生物反应器。第3节描述了培养基。第4节描述了依照本发明中阐述性培养方法生产油类。I.原藻菌种和菌株原藻是用于生产脂类的标志性微生物，因为其可以产生大量脂类，特别是适用于生产燃料的脂类。与由其他微藻生产的脂类相比，由原藻生产的脂类具有较短长度和较高饱和度的碳氢链。此外，原藻脂类一般不含色素(叶绿素和某些类胡萝卜素低至不可检出水平)，而且在任何情况下其色素含量远远少于来源于其他微藻的脂类。此外，相对于由其他微藻生产脂类，本发明中提供的重组原藻细胞可以以较高产率和效率以及较低成本生产脂类。本发明方法中使用的阐述性原藻菌株包括此外，这种微藻可以异养生长并且可以经遗传工程改造成为 Prototheca wickerhamii、Prototheca stagnora (包括 UTEX327)、Prototheca portoricensis、Prototheca moriformis (包括 UTEX 菌株 1441,1435)和Prototheca zopfii。原藻属的菌株是专性异养型。可以通过扩增基因组的特定靶区域来鉴定本发明中使用的原藻菌种。例如，可以通过利用引物和利用基因组任意区域的方法(例如利用Wu等，Bo t. Bu 11. Acad. S in.(2001) 42 :115-121 Identification ofChlorella spp 中描述的方法)对核和/或质体DNA进行扩增和测序，来鉴定特定的原藻菌种或者菌株。使用核糖体DNA序列分离。本领域技术人员使用公认的系统发生学分析方法(例如对核糖体内转录间隔区(ITS1和ITS2rDNA)、23S rRNAUSS rRNA和其他保守的基因组区域进行扩增和测序)，不仅可以鉴定原藻菌种，还可以鉴定具有相似脂类特性和生产能力的 生产碳氢化合物和脂类的其他生物体。对藻类进行鉴定和分类的方法示例还可以见于例如Genetics，2005Aug ；170(4) =1601-10和RNA，2005Apr ；11(4) : 361-4。因此，可以利用基因组DNA比较来鉴定本发明中使用的适宜微藻菌种。可以从微藻菌种中扩增基因组DNA的保守区域(例如但不限于编码23S rRNA的DNA)，并比较共有序列，用以筛选与本发明中使用的优选微藻在分类学上相关的微藻菌种。对于原藻属菌种的这种DNA序列比较的示例显示于下面。基因组DNA比较还可以用于鉴定菌株保藏中错误鉴定的微藻菌种。菌株保藏通常基于表型特征和形态特征鉴定微藻菌种。使用这些特征可能导致对微藻属或者菌种进行错误分类。使用基因组DNA比较是基于系统发生学关系对微藻菌种进行分类的较好方法。本发明中使用的微藻通常具有编码与SEQ ID NO :11-19具有至少99%、至少90%或者至少85%核苷酸一致性之23S rRNA的基因组DNA序列。对于使用序列比较来确定核苷酸或者氨基酸一致性，通常以ー种序列作为參照序列，测试序列与其进行比较。当使用序列比较算法吋，将测试序列和參照序列输入计算机中，指定子序列坐标(如果需要)，并且指定序列算法的程序參数。随后基于指定的程序參数计算测试序列相对于參考序列的序列一致性百分比。可以例如通过局部同源性算法(Smith & Waterman, Adv. App I. Math. 2 482(1981))、同源性比对算法(Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48 :443 (1970))、相似性搜索方法(Pearson & Lipman, Proc. Nat’ I. Acad. Sci. USA 85 :2444 (1988))、计算机实施的这些方法(GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA，Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group, 575Science Dr. , Madison, WI)或者通过目检(一般见于上文Ausubel等)来进行比较序列的最佳比对。适于确定序列一致性和序列相似性百分比的另外ー种算法示例是BLAST算法，其描述于Altschul等，J. Mol. Biol. 215 =403-410 (1990)中。进行BLAST分析的软件可以在National Center forBiotechnoiogy Information 上(网址是 www. ncbi. nlm. nih. gov)公开获得。这种算法包括首先通过鉴定查询序列中长度为W的短词来鉴定高分数序列对(HSPs)，所述短词在与数据库序列中具有相同长度的词比对时匹配或满足某些正值的阈值分数T。T是指邻域词分数阈值(上文Ausubel等)。这些初始邻域词命中作为种子启动搜索，用以寻找含有它们的较长HSPs。接着该词命中沿着每条序列在两个方向延伸，远至能够提高累积比对分数。对于核苷酸序列，利用參数M(—对匹配残基的奖励分数，通常> O)和N(非配对残基的罚分，通常< O)计算累积分数。对于氨基酸序列，使用分数矩阵计算累积分数。每个方向上词命中的延伸在下列情况时停止当累积比对分数由其达到的最大值降低数量X ;由于ー个或者多个残基比对负值的积累而使累积分数降至O或者以下；或者达到任一序列的末端。对于鉴定核酸或者多肽是否在本发明的范围内，BLAST程序的默认參数是合适的。BLAST程序(对于核苷酸序列)使用的默认值是词长(W)为11，期望值(E)为10, M= 5, N = -4和进行两条链的比较。对于氨基酸序列，BLAST程序使用的默认值是词长(W)为3，期望值(E)为10和BL0SUM62分数矩阵。TBLATN程序(对于核苷酸序列，利用其蛋白序列)使用的默认值是词长(W)为3，期望值(E)为10和BLOSUM62分数矩阵(參见Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915(1989))。除了计算序列一致性百分比之外，BLAST算法还可以进行两个序列之间相似性的统计学分析(例如參见 Karlin & Altschul, Proc. Nat，I. Acad. Sci. USA 90 5873-5787(1993))。BLAST算法提供的 ー种相似性测定是最小总和概率(P(N))，其表示通过两个核苷酸或者核酸序列之间偶然发生配对的概率。例如，如果测试核酸与參照核酸比较的最小总和概率小于大约O. I,更优选小于大约O. 01，最优选小于大约O. 001，则认为该核酸与參照序列是相似的。除了生产合适的脂类或者碳氢化合物以生产油类、燃料和油脂化工产品之外，影响对本发明中使用的微生物进行选择的其他考虑因素包括(I)脂类含量高(以细胞重量计算)；(2)易于生长；(3)易于进行遗传工程化；(4)易于对生物质进行处理。在特定的实施方案中，野生型或者经遗传工程化的微生物生产具有至少40 %、至少45 %、至少50 %、至少55%、至少60%、至少65%或者至少70%或者更多的脂类。优选生物体是异养生长型(不存在光下生长于糖类中)。2.牛物反应器以进行遗传学操作和生产碳氢化合物(例如脂类、脂肪酸、醛、醇和烷烃)为目的培养微生物。前面一种类型的培养以小規模并且最初至少在起始微生物可以生长的条件下进行。以生产碳氢化合物为目的的培养通常以大規模(例如10，000L.40, 000LU00, 000L或者更大的生物反应器)在生物反应器中进行。通常利用本发明的方法在生物反应器内的液体培养基中对原藻进行培养。生物反应器通常不允许光进入。使用生物反应器或者发酵罐来培养微藻细胞，至其生理周期的多个阶段。在异养生长和繁殖方法中使用生物反应器提供很多优势。为了生产用于食品中的生物质，优选在液体中(例如在悬浮培养基中)大量发酵微藻。生物反应器(例如不锈钢发酵罐)可以容纳非常大的培养体积(本发明的多个实施方案中使用具有40，000升和更大能力的生物反应器)。生物反应器通常还使得可以控制培养条件，例如温度、PH值、氧压和ニ氧化碳水平。例如，生物反应器通常是可配置的，例如利用与管道连接的接ロ，以允许气体组分(例如氧气或者氮气)通过液体培养物起泡。利用生物反应器还可以更容易地对其他培养參数(例如培养基的PH值、微量元素的类型和浓度以及其他培养基组分)进行控制。生物反应器可以配置成使培养基在微藻复制和数量増加期间流过生物反应器。例如在一些实施方案中，可以在接种后但是在细胞达到期望密度之前将培养基注入生物反应器中。在其他情况下，培养初始即将培养基充满生物反应器，并且在接种培养物后不再注入培养基。換言之，使微藻生物质在液体培养基中培养一段时间，其间微藻复制并且数量增加；但是，在这期间没有大量的液体培养基流过生物反应器。因此在ー些实施方案中，接种后没有液体培养基流过生物反应器。可以利用装配有例如旋转刀和旋桨、振荡器、搅拌棒、用于将气体增压注入的装置等设备的生物反应器使微藻培养物混合。混合可以是连续性的或者周期性的。例如，在一些实施方案中，没有維持气体进入和培养基进入的紊流条件以使微藻复制，直至所述微藻数量的增加达到期望水平。
可以使用生物反应器接ロ引入或者提取气体、固体、半固体和液体至含有微藻的生物反应室中。由于很多生物反应器具有多于ー个接ロ(例如一个用于培养基进入，另ー个用于取样)，仅使ー种物质进入或者保留ー个接ロ是没有必要的。例如，可以使用ー个接ロ使培养基流入生物反应器中并且随后用于取样、进气、排气或者其他目的。优选可以重复使用取样ロ，不会改变妥协培养物的无菌性质。取样ロ可以配置成具有阀门或者具有使样品停止和开始流动或者提供连续取样装 置的其他设备。通常生物反应器具有能够接种培养物的至少ー个接ロ，其还可以用于其他目的，例如培养基进入或者气体进入。生物反应器接ロ使得可以控制微藻培养物的气体含量。例如，生物反应器的部分体积可以是气体而非液体，并且生物反应器的气体入口允许将气体泵入生物反应器中。可以有益地泵入生物反应器中的气体包括空气、空气/CO2混合物、隋性气体(例如氩气)和其他气体。通常生物反应器装配成使得使用者能够控制气体进入生物反应器的速率。如上面提到，可以通过増加流入生物反应器的气体来促进培养物混合。气体流动增加还影响培养物的浊度。通过在液体培养基层下放置一个进气ロ以使进入生物反应器的气体在培养物表面起泡，可以产生紊流。一个或者多个排气ロ使气体可以泄漏，因此防止生物反应器中压カ累积。优选排气ロ通向防止杂质微生物进入生物反应器的止回管道。3. :! 养基微藻培养基通常含有例如固定氮源、固定碳源、微量元素、可选地维持pH值的缓冲液和磷酸类物质(通常以磷酸盐提供)等组分。其他组分可以包括盐(例如氯化钠)，特别是对于海水微藻。氮源包括有机和无机氮源，其例如包括但不限于分子氮、硝酸、硝酸盐、氨(纯氨水或者盐形式，例如(NH4)2SO4和NH4OH)、蛋白、大豆粉、玉米浆和酵母提取物。微量元素的示例包括锌、硼、钴、铜、锰和钥，例如分别以ZnCl2、H3B03、CoCl2 · 6H20、CuCl2 · 2H20、MnCl2 · 4H20 和(NH4)6Mo7O24 · 4H20 的形式提供。根据本发明的方法使用的微生物可以在全世界多个地点和环境中发现。由于其与其他菌种分离和其发生的进化趋异，因此难以预测提供最佳生长以及生产脂类和/或碳氢化合物成分的特定生长培养基。在某些情况下，特定的微生物菌株可能不能生长于特定的生长培养基中，因为存在某些抑制组分或者缺少该特定微生物菌株需要的某些关键性营养需求。—般可以从多种来源获得固体和液体生长培养基，而且可以例如在线适用于多种微生物菌株之特定培养基的制备方法可以在http://www. utex. orR/(University ofTexas at Austin, IUniversityStation A6700, Austin, Texas, 78712-0183 站点)中的藻类培养物保藏中心在线找到。例如，多种淡水和盐水培养基包括描述于PCT
发明者A·索曼奇, G·鲁登科, K·埃斯皮纳, P·蔡, S·富兰克林 申请人:索拉兹米公司