专利名称：一种拟青霉代谢产物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种拟青霉代谢产物及其应用，属于微生物药物筛选技术领域。
背景技术：
拟青霉属中的一些种在控制植物虫害中起着重要作用，如淡紫拟青霉对胞囊线 虫、根结线虫等植物寄生线虫的控制，玫烟色拟青霉和粉拟青霉能寄生并致死多种昆虫，包 括同翅目、鳞翅目、双翅目、鞘翅目、膜翅目等。在许多国家，这些拟青霉已成功开发成生防 菌剂，在构建生态农业中起着重要作用。 拟青毒属(Paecilomyces Bainier)属于半知菌亚门(Deuteromycotina)，丝 包纟冈 (Hyphomycetes)，丝孢目(Hyphomycetales)，丛梗孢科(Moniliaceae)。主要形态特征是菌 丝多核，白色、灰白色至暗白色或褐色，从毛状，蔓延。分生孢子梗从蔓延的气生菌丝或菌丝 索上产生，但不少种缺乏明确的孢子梗。有或无孢梗束形成，长度变化很大。瓶梗基部柱状 或球形膨大，向上变细长，常超过总长的一半，多弯曲并偏离主轴；瓶梗着生情况复杂，或呈 轮状如青霉一样的分枝，或不规则地丛生于短小的分枝上，或单生于蔓延的气生菌丝上。分 生孢子单胞，拟卵圆形、椭圆形、肾形、或变细长的柱状，少数种近球形。分生孢子通常聚集 成干燥离散的链，有时倾斜排列或形成不规则的孢子团块。在查氏培养基上，菌落通常白 色、灰白色、淡橙黄色、肉色、模糊的淡褐色、黄褐色、或真正的绿色。 松材线虫1982年在南京中山陵首次发现，以后相继在江苏、安徽、广东和浙江等 地成灾，几乎毁灭了在香港广泛分布的马尾松林。近距离传播主要靠媒介天牛，如松墨天牛 (Monochamus alternatus)，携带传播；远距离主要靠人为调运带疫(带松材线虫的天牛) 的苗木、松材、松木包装箱及松木制品等进行传播。被松材线虫感染后的松树，针叶黄褐色 或红褐色、萎蔫下垂，树脂分泌停止，在树干上可观察到天牛侵入孔或产卵痕迹，病树整株 干枯死亡，木材蓝变。严重威胁用材林。由于扩展迅速，现已对黄山、张家界等风景名胜区 的天然针叶林构成了巨大威胁。松材线虫病在美国、加拿大、墨西哥、日本、韩国、朝鲜等国 也均有发生。因此，研制开发针对松材线虫的生防制剂显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种拟青霉代谢产物，为开发松材线虫生防菌剂奠定基 础。 本发明使用的真菌是拟青霉1788 (Paecilomyces sp. 1788) ， 1788菌株已于2009 年11月5日保存于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，地址中国.北京.中关 村；保藏号CGMCC No. 3422。 本发明是这样实现的将拟青霉(Paecilomyces sp. 1788)通过查氏培养基常规 液体发酵培养，将发酵液低压浓縮后，水相经反复柱层析，洗脱得到本发明的拟青霉代谢产 物，该拟青霉代谢产物由如下步骤得到 a.生产菌株为Paecilomyces sp. 1788，保藏号:CGMCC No. 3422 ;
b.将1788菌株的菌丝体接种到试管PDA固体培养基斜面上，20-3(TC下培养4-8 天，获得试管种； c.将试管种接种到每瓶装50ml液体培养基的250ml三角瓶中，培养基配方为蛋 白胨10g，酵母膏lOg，葡萄糖20g，自来水lOOOml， pH自然；培养温度20_30°C ;摇床培养， 转速为100-250rpm ;培养时间5_15天； d.将含菌丝的发酵液低压浓縮后，用乙酸乙酯和正丁醇依次萃取，萃取后的水相 部位低压浓縮形成浓縮液，将其缓慢加入2倍体积的丙酮中并不断搅拌，然后静置，形成丙 酮水溶相和沉淀相，再分离两相； e.重复数次直至丙酮水溶相基本无色，收集沉淀相；沉淀相重复过聚己酰胺柱， 以丙酮与水梯度洗脱，再经过C-18硅胶柱和S印hadexLH-20凝胶柱甲醇洗脱，以TLC板为 参考合并组分，活性跟踪检测所分离得到活性组分，用0. 5%茚三酮乙醇溶液显色成红色。
实验表明拟青霉1788的发酵产物毒杀松材线虫(Burs即helenchuh xylophilus) ，24小时的半致死率(ED5。)为299. 5卯m， ED95为796. 2ppm。
本发明的拟青霉代谢产物具有毒杀松材线虫(Burs即helenchuhxylophilus)的 功能，能作为制备杀松材线虫制剂的应用。 本发明与现有的杀松材线虫药相比，具有高效、低毒、易溶于水、易制备等特点。
具体实施例方式
本发明活性物质的发酵生产方法 1、将1788菌株的菌丝体接种到试管固体培养基斜面上，培养基配方为PDA培养 基，20或25或3(TC下培养4或6或8天，获得试管种； 2、将试管种接种到250ml三角瓶中(每瓶装50ml)液体培养基中，培养基配方为 蛋白胨10g，酵母膏10g，葡萄糖20g，自来水lOOOml， pH自然。培养温度20或25或30°C ; 摇床培养，转速为100-250 rpm ;培养时间5或10或15天。 3、将含菌丝的发酵液低压浓縮后，用乙酸乙酯和正丁醇依次萃取，萃取后的水相 部位低压浓縮形成浓縮液，将其缓慢加入2倍体积的丙酮中并不断搅拌，然后静置，形成丙 酮水溶相和沉淀相，再分离两相。重复数次直至丙酮水溶相基本无色，收集沉淀相。沉淀相 重复过聚己酰胺柱，以丙酮与水梯度洗脱，再经过C-18硅胶柱和S印hadexLH-20凝胶柱甲 醇洗脱，以TLC板为参考合并组分，活性跟踪检测所分离到活性组分，用0. 5%茚三酮乙醇 溶液显色成红色。 本发明活性组分对松材线虫的药效试验
1、试验用药剂 将活性组分用无菌蒸馏水稀释为适用浓度。 将未接种的发酵培养基用无菌蒸馏水稀释为适用浓度作为对照。
2、制备试验用线虫 将灰葡萄孢(Botrytis cinerea)接在PDA平板上，25。C培养至长满平板，接入一 块带有松材线虫(B.xylophilus)的培养基，25t:培养到菌丝消失，线虫长满平板，然后置 于4t:冰箱保存备用。使用时按贝曼漏斗法洗出，用无菌水调节线虫悬液至约300条/ml。
3、试验方法
4
取2ml测试样品或对照样品于6cm直径的培养皿中，用移液枪加入0. 3ml的线虫 悬液(约100条)。测定活性时，在解剖镜下于不同时间(12h和24h)进行观察，记录死线 虫数(以物理剌激不动为标准)和总的线虫数，计算样品对线虫的"样品致死率"和"对照 死亡率"。 一个样品设两个重复，最后得到这个菌株的"校正致死率"。供试菌株的校正致死 率按下列公式计算 样品平均致死率(％ ) = E (观察计数到的死线虫数/观察计数到的总线虫 数)X100% /n ; 校正致死率(％ )=样品平均致死率(％ )-对照平均致死率(％ )
实施例1 :拟青霉1788发酵液对松材线虫的毒杀作用 培养好的液体发酵物用真空抽滤后得清亮溶液，该溶液在60-7(TC减压浓縮至干 得活性物质，溶解于无菌蒸馏水配制成5mg/ml的样品，按上述试验方法进行药效试验。列 表所示为校正死亡率。 表1发酵液对B. xylophilus线虫的毒杀作用
重复次数 4小日寸12小时 24小时
1 27. 5。/0 40.1% 94.2%
2 22.4% 38. 3% 92. 7%
3 28. 6% 47. 9% 92. 6% 结果表明，拟青霉1788的液体发酵产物对松材线虫具有显著的毒杀作用，致死率 达到92%以上. 实施例2 :活性组分对松材线虫的毒杀作用
将分离得到的活性组分溶于无菌蒸馏水，稀释为500ppm溶液。
按上述试验方法进行药效试验。列表所示为校正死亡率。
表2活性组分对B. xylophilus线虫的毒杀作用
重复次数4小时12小时24小时
115. 5%40.3%82. 1%
221. 7%42.8%81. 3%
320. 1%38.3%80. 7% 结果表明，分离得到的活性组分对B. xylophilus线虫的致死率在24小时达到
80%以上。具有明显的杀线虫活性。 实施例3 :活性组分对松材线虫的半致死率ED5。 实施例3方法同实施例2，不同之处为将2. 5mg活性组分溶于少量无菌蒸馏水， 配制为1000卯m的水溶液，随后倍半稀释，测定半致死率(ED5。)和95%致死率(ED95)。
表3对B. xylophilus线虫的ED50和ED95浓度ppm4小时12小时24小时
100025. 8%43. 7%100%
80025. 5%40. 3%96. 1 %
60017. 9%35. 4%86. 7%
40015. 8%30. 7%64. 0%
20010. 3%23. 3%27. 3%
1000. 7%1. 6%5. 1% 结果表明，活性组分在24小时对B. xylophilus线虫的半致死率(ED5。)为为299. 5 卯m，95X致死率(ED95)为796. 2卯m。
权利要求
一种拟青霉代谢产物，其特征在于该拟青霉代谢产物由如下步骤得到a.生产菌株为Paecilomyces sp.1788，保藏号CGMCC No.3422；b.将1788菌株的菌丝体接种到试管PDA固体培养基斜面上，20-30℃下培养4-8天，获得试管种；c.将试管种接种到每瓶装50ml液体培养基的250ml三角瓶中，培养基配方为蛋白胨10g，酵母膏10g，葡萄糖20g，自来水1000ml，pH自然；培养温度20-30℃；摇床培养，转速为100-250 rpm；培养时间5-15天；d.将含菌丝的发酵液低压浓缩后，用乙酸乙酯和正丁醇依次萃取，萃取后的水相部位低压浓缩形成浓缩液，将其缓慢加入2倍体积的丙酮中并不断搅拌，然后静置，形成丙酮水溶相和沉淀相，再分离两相；e.重复数次直至丙酮水溶相基本无色，收集沉淀相；沉淀相重复过聚己酰胺柱，以丙酮与水梯度洗脱，再经过C-18硅胶柱和SephadexLH-20凝胶柱甲醇洗脱，以TLC板为参考合并组分，活性跟踪检测所分离得到活性组分，用0.5％茚三酮乙醇溶液显色成红色。
2. 权利要求1所述的拟青霉代谢产物，其特征在于该拟青霉代谢产物具有毒杀松材线 虫(Burs即he/enchuh xy/ophi/us)的功能，能作为制备杀松材线虫制剂的应用。
全文摘要
本发明涉及一种拟青霉代谢产物及其应用，属于微生物药物筛选技术领域。本发明是这样实现的生产菌株为Paecilomyces sp.1788，保藏号CGMCCNo.3422；将拟青霉(Paecilomyces sp.1788)通过查氏培养基常规液体发酵培养，将发酵液低压浓缩后，水相经反复柱层析，洗脱得到本发明的拟青霉代谢产物。本发明的拟青霉代谢产物具有毒杀松材线虫(Bursaphelenchuh xylophilus)的功能，24小时的半致死率(ED50)为299.5ppm，ED95为796.2ppm。能作为制备杀松材线虫制剂的应用。本发明与现有的杀松材线虫药相比，具有高效、低毒、易溶于水、易制备等特点。
文档编号A01N63/04GK101787376SQ201010039109
公开日2010年7月28日 申请日期2010年1月5日 优先权日2010年1月5日
发明者刘亚君, 刘意, 张克勤 申请人:云南大学