专利名称：OsmiR528的调控位点及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及0smiR5^的调控位点，通过对调控位点的改变，获得能够提高作物抗 逆性的转基因农作物。
背景技术：
miRNA和SiRNA的研究是近年来国际生命科学研究的热点之一。具有调节功能的 非编码小分子RNA是指长度为21-Mnt左右，大多在进化上具有序列保守性的RNA分子。 它们不编码蛋白质，而是以RNA的形式，在转录后水平上通过降解mRNA或抑制其翻译，参与 调节真核生物染色体结构的维持、防御病毒及调控生长发育等过程。小分子RNA的发现不 仅揭示了困扰科学家们多年的基因沉默现象的本质，还改变了人们对基因的传统认识，特 别是miRNA的发现是近年来生命科学研究的一个重大突破，小分子RNA在2002和2003连 续两年被《Science》杂志评为“年度十大科技进展”。随着对小分子RNA研究的深入，近几 年又发现有新的小分子种类，例如trans-acting siRNA(ta-siRNA)和天然顺式排列的反义 RNA (natural cis-antisense RNA)介导产生的nat-siRNA参与植物的发育调控和逆境反 应，这些新发现使我们认识到小分子RNA的存在可能具有更为广泛的作用。大量的实验证据表明miRNA对动植物的多种生命现象具有重要的调控作用，在植 物中主要表现在花的形态建成、开花时间的调控、维管束发育、根冠细胞的形成和叶型的发 育等方面。在拟南芥中，某些miRNA的表达量在高盐及营养等逆境条件下会明显改变，表明 miRNA还参与植物抗逆性反应等生理过程的调控此外，miRNA还介导反式作用的ta_siRNA 的合成而间接地参与植物发育调控(Yoshikawa et al.，2005)，以miRNA390为例，miRNA390 掺入到RICS复合体后可以指导TAS3转录本的切割，TAS3并不编码蛋白质，而是ta_siRNA 的前体。TAS3被切割后产生固定的5，或者3，末端，经过RDR6反转录，形成双链的TAS3RNA， 在DCL4的作用下，产生TAS3 ta-siRNA并指导靶基因ARF3mRNA的降解。由于TAS3ta_siRNA 作用的靶mRNA不是它自身编码的TAS3位点，而是以反式作用于ARF3，4mRNA，顾名思义这类 siRNA为反式作用的siRNA(trans-acting siRNA)。这类新的siRNA的发现，不仅使我们认 识到了 miRNA的新功能，更使我们认识到小分子RNA的存在可能具有更为广泛的作用。虽然小分子RNA在理论上的研究已经取得了巨大的进步，但是何如在生产上利用 小分子RNA，为现代农业服务，产生经济价值是现代生物领域的一大难题。本发明通过对 miRNA5^识别位点的研究，获得了能够提高植物抗逆性的DNA序列，农作物的性状改良提 供基因资源具有重要的意义
发明内容
本发明的目的是通过突变靶基因的0smiR5^的识别位点，获得一种新的DNA序列 5 ,把该序列构建到表达载体上转化农作物，获得的转基因株系具有提高作物抗逆性的 功能。本发明所提供的0smiR5^的识别位点，包括5个基因5个识别序列，这些序列具有以下特性1)序列表中的 SEQ ID NO 1序列表中的SEQ ID NO :1由M个脱氧核苷酸序列组成，是基因0s06g06050 被0smiR5^识别的位点，在体内0smiR5^通过识别SEQ ID NO 1位点切割，实现对 0s06g0605的调控。突变0smiR5^的识别位点，获得5 基因，构建5 的表达载体 pcmabil300-528Tm,转化农杆菌菌株，利用该菌株转化植物，获得转基因植株。5 在植物 体内能够避免0smiR5^对正常靶基因的负调控，从而起到真正过表达靶基因的作用。2)序列表中的 SEQ ID NO 2序列表中的SEQ ID NO :2由M个核苷酸序列组成，是基因0s06g37150被 0smiR528识别的位点，在体内0smiR5^通过识别SEQ ID NO 2位点切割，实现对 0s06g37150的调控。突变0smiR5^的识别位点，获得5 基因，构建5 表达载体 ραιιειΙ 1300-5^ ιι，转化农杆菌菌株，利用该菌株转化植物，获得转基因植株。5 在植物 体内能够避免0smiR5^对正常靶基因的负调控，从而起到真正过表达靶基因的作用。3)序列表中的 SEQ ID NO 3序列表中的SEQ ID NO :3由M个核苷酸序列组成，是基因0s08g04310被 0smiR528识别的位点，在体内0smiR5^通过识别SEQ ID NO 3位点切割，实现对 0s08g04310的调控。突变0smiR5^的识别位点，获得5 基因，构建5 表达载体 pcmabil300-528Tm,转化农杆菌菌株，利用该菌株转化植物，获得转基因植株。5 在植物 体内能够避免0smiR5^对正常靶基因的负调控，从而起到真正过表达靶基因的作用。4)序列表中的 SEQ ID NO 4序列表中的SEQ ID N0:4由M个核苷酸序列组成，是基因0s06gll310被 0smiR528识别的位点，在体内0smiR5^通过识别SEQ ID NO 4位点切割，实现对 0s06gll310的调控。突变0smiR5^的识别位点，获得5 基因，构建5 表达载体 pcmabil300-528Tm,转化农杆菌菌株，利用该菌株转化植物，获得转基因植株。5 在植物 体内能够避免0smiR5^对正常靶基因的负调控，从而起到真正过表达靶基因的作用。5)序列表中的 SEQ ID NO 5序列表中的SEQ ID NO :5由M个核苷酸序列组成，是基因0s07g38290被 0smiR528识别的位点，在体内0smiR5^通过识别SEQ ID NO 5位点切割，实现对 0s07g38290的调控。突变0smiR5^的识别位点，获得5 基因，构建5 表达载体 ραιιειΙ 1300-5^ ιι，转化农杆菌菌株，利用该菌株转化植物，获得转基因植株。5 在植物 体内能够避免0smiR5^对正常靶基因的负调控，从而起到真正过表达靶基因的作用。本发明所有的5 以及含有5 序列的表达载体、宿主菌株、转基因细胞系、 转基因株系、转基因新品种均属于保护内容。下面结合实施实例进一步阐述本发明，而不构成对本发明权利要求范围的限制。
图1 0smiR5^的识别位点。图 2 pCAMBIA1300-5^Tm 载体示意图。图3 pCAMBIA1300-5^Tm转化株系表皮毛的表型。
具体实施实例下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见 《MolecularCloning :A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning :A Laboratory Manual, 3rd edition，2001，NY，Cold Spring Harbor)。降角军组文 库的测序委托华大基因公司完成。实施例1、降解组文库的建立以超级杂交水稻两优培九父本93-11为研究材料，取4 6厘米幼穗，液氮冷冻保存。用Trizol 提取 93-11 幼穗的总 RNA，用 Oligotex mRNA mini kit 分离 mRNA，加入 5'RNA adapter (cx4669)，用T4 RNA Iigase连接，产物纯化后，用引物cx4670，进行第一链 反转录，利用正向引物cx4671和反向引物cx4672扩增。获得的产物用限制性内切酶Mme I消化，再加上DNA adapter (cx4908和cx4674 )。最后用正向引物cx4675 和反向引物 cx4676扩增，获得产物经纯化后提交Solexa Genome analyzer测序。引物序列
cx46695'-GUUCAGA⑶UCUACA⑶CCGAC-3‘
cx46705'-CGAGCACAGAATTAATACGACT(18)V-3
cx46715'-GTTCAGAGTTCTACAGTCCGAC-3‘
cx46725'-CGAGCACAGAATTAATACGAC-3‘
cx49085'-TCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3‘
cx4674:5，-CAAGCAGAAGACGGCATACGANN-3’
cx46755'-AATGATACGGCGACCACCGACAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGAC-3'
cx4676:5，-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3，
实施例2、生物信息学分析
93-11基因组序列和日本晴基因注释序列来源于TIGR6. 1。Solexa测序
ShortOligonucleotide Analysis Package (SOAP) ，rniRNA target 分析调用CleaveLand程序进行分析。实施例3、5，RACE实验验证如前所述，提取总RNA，再用Oligotex mRNA mini kit纯化mRNA，之后用T4 RNA Iigase 加上一个 5’RNA adapter (cxl558)，经 Oligo (dT) 15 (cx2251)反转录，产物用巢式引 物进行两轮PCR。外引物cxlM4 ；内引物cxlM5。基因特异性的外引物和内引物根据需 要设计。PCR产物纯化后，进行测序，统计结果。cxl558 :5， -GCUGAUGGCGAUGAAUGAACACUGCGUUUGCUGGCUUUGAUGAAA-3’cx2251 :5’ _τττττττττττττττ_3'cxl544 :5，-GCTGATGGCGATGAATGAACACTG-3，cxl545 :5， -CGCGGATCCGAACACTGCGTTTGCTGGCTTTGATG-3’实施例4、miRNA528靶基因识别位点的获得我们获得了 0smiR5^的识别位点，如附图1所示。在水稻中0smiR5^的靶基因有 5 个，分别是 0s06g06050、0s06g37150、0s08g04310、0s06gll310、0s07g38290 基因。miRNA 的识别位点是长度为Mnt的脱氧核苷酸序里，其中0s06g06050的识别序列如序列表序列1所示；0s06g37150识别序列如序列表序列2所示；0s08g04310识别序列如序列表序列3所 示；0s06gll310的识别序列如序列表序列4所示；0s07g38290识别序列如序列表序列5所不。实施例5、pCAMBIA1300-528Tm 载体的构建本实施列是关于pCAMBIA1300-5^Tm载体构建一个通用说明，0s06g06050、 0s06g37150、0s08g04310、0s06gll310、0s07g38290 都是按照此方法完成构建的。首先订购水稻BAC质粒，将纯化后的BAC质粒用适合的酶切过夜，第二天跑0. 7% 琼脂糖凝胶电泳分离切割后片段。以11Λ marker(invitrogen )为参照，切取目的条带的 条带。将该条带以冻融法回收。PCR检测回收是否正确。同时，将中间载体pUCRNAi用同样 的酶切过夜，末端脱磷并回收。将回收的BAC片段与载体片段以摩尔比约8 1的量进行 连接(T4 Ligase (NEB ))过夜。第二天将连接产物转化大肠杆菌DH5 α，并于37°C培养过 夜，可获得单克隆。选取单克隆进行培养，同时对其进行PCR验证，验证正确的克隆提取质 粒，获得序列正常的中间载体。将纯化后的中间载体和植物转化载体PCAMBIA1300用上述 酶切过夜，从中间载体的酶切产物中回收目的条带，同时载体酶切产物末端脱磷并回收，将 该两个回收产物以摩尔比约8 1的量进行连接(T4 Ligase (NEB ))过夜。第二天将连接 产物转化大肠杆菌DH5ci，并于37°C培养过夜，可获得单克隆。选取单克隆进行培养，同时 对其进行PCR验证，验证正确的克隆提取质粒，获得序列正常的含有目的基因组DNA的植物 转化载体。该植物转化载体将转化水稻作为后续实验的对照植株。以中间载体作为模板，对所需区域进行定点突变，设计的原则是氨基酸水平上的 突变，但保持蛋白水平不变化。利用突变试剂盒获得定点突变的MSTmDNA序列，将该序列连入之前回收的 PCAMBIA1300植物表达载体获得pCAMBIA1300_5^Tm载体，图谱见附图2。实施例5、pCAMBIA1300-5^Tm转基因株系的表型把构建好的pCAMBIA1300_5^Tm载体转化水稻，对得到的突变体进行表型分析发 现，pCAMBIA1300-528Tm的转基因株系和野生型相比叶的表皮毛发生明显的变化，见附图 3。以前的研究表明，植物的表皮毛可能和对环境胁迫的响应有关。pCAMBIA1300-5^Tm的 转基因株系有可能提高农作物的抗逆性。对pCAMBIA1300-5^Tm转基因株系抗逆性的分析 正在进行中。SEQUENCE LISTING<110>中国科学院遗传与发育生物学研究所<120>0smiR528的调控位点及其应用<130>528T<160>5<170>PatentIn version 3. 5<210>1<211>24<212>RNA<213>oryza sativa<400>1
auuccucugcuugccucuuccauu
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<212>RNA
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<400>5
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权利要求
1.来源于水稻0smiR5^的识别位点，其特征在于其脱氧核苷酸序列是序列列表中的 序列1、序列2、序列3、序列4和序列5。
2.根据权利要求1所述，其特征在于序列1、序列2、序列3、序列4和序列5是水稻基 因528T基因的一段长度为Mnt的序列，该序列的脱氧核苷酸序列能够被0smiR5^特异性 识别。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于528Tm基因为528T基因在序列1、序列2、 序列3、序列4或序列5的序列位置发生了一个或一个以上脱氧核苷酸突变。
4.根据权利要求2或3所述，其特征在于528T基因为0s06g06050、0s06g37150、 0s08g04310、0s06gll310、0s07g38290。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于将5 构建在表达载体上转化目的植物 细胞、组织或器官，能够获得具有抗逆性的转基因株系。
6.根据权利要求5所述，其特征在于构建所述植物表达载体的出发载体是一种可用于 根瘤农杆菌或发根农杆菌转化植物的双元载体或可用于植物微弹轰击的载体，或者是可在 原核生物中复制的载体。
7.根据权利要求5所述，其特征在于目的植物细胞、组织或器官是任何一种农作物的 细胞、组织或器官。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于目的植物为任何单子叶或双子叶的植物。
9.根据权利8要求所述，单子叶植物为水稻、玉米、小麦、高粱、谷子、大麦、燕麦、黑麦， 双子叶植物为棉花、大豆、烟草、油菜、番茄。
全文摘要
本发明涉及OsmiR528的靶基因调控位点，通过突变靶基因的识别位点，获得一种新的DNA序列528Tm，把该序列构建到表达载体上转化农作物，获得的转基因株系具有提高作物抗逆性的功能。
文档编号A01H5/00GK102134571SQ20101010118
公开日2011年7月27日 申请日期2010年1月26日 优先权日2010年1月26日
发明者刘春艳, 曹守云, 曹晓风, 李平川, 杨荣新 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所