专利名称：建立无气道高反应性嗜酸粒细胞性气道炎症小鼠模型的方法
技术领域：
本发明属于应用基础医学研究领域，特别涉及一种建立无气道高反应性嗜酸粒细胞性气道炎症小鼠模型的方法。
背景技术：
哮喘是世界范围内严重威胁人类健康的疾病，在我国大约有2亿人受到哮喘的困 扰，如不能得到控制，将严重影响日常生活，甚至引起生命危险。气道高反应性和气道炎症 是哮喘的两个主要病理生理学特征。气道高反应性是气道对各种刺激物产生严重的阻塞反 应。刺激物多种多样，包括直接刺激物和间接刺激物，环境和基因均和气道高反应性机制有 关。气道反应性检测已广泛应用于哮喘流行病学和临床研究的诊断和检测，目前已成为肺 功能评估和哮喘治疗的重要参数。1989年Gibson发现临床上有一类特殊的患者，表现为慢性刺激性干咳或咳少量 粘液痰，诱导痰嗜酸粒细胞增高，糖皮质激素治疗效果良好，但患者肺通气正常，无气道高 反应性，峰流速变异率正常，无法诊断为支气管哮喘，因此将这一类疾病定义为嗜酸粒细胞 性支气管炎(EB)。2006年美国胸科医师协会咳嗽指南和2009年我国最新慢性咳嗽指南中 均将EB作为独立疾病提出，其与哮喘的关系和自然转归受到了人们的关注。EB与哮喘痰液 中嗜酸粒细胞都可以增高，其活化标志物嗜酸细胞阳离子蛋白浓度也明显增高，气道黏膜 均有白介素_5、集落刺激-肿瘤坏死因子和2型辅助T细胞的基因表达，血管重建在EB和 哮喘患者中均存在。为什么EB和哮喘具有相似的气道炎症和结构改变，但前者却不出现气 道高反应性？ EB的出现为研究气道高反应性发生机制提供了有利的工具。关于EB的研究主要集中于临床患者，目前的研究主要涉及临床病学，临床表现， 诊治和预后，有关机制的研究尚不深入。鉴于直接进行人体实验的局限性，有关病因的确 定，发病机制的探索、治疗方法的评价、疾病的转归和新药的研发在很大程度上需要通过动 物实验进行。因此建立无气道高反应性嗜酸粒细胞气道炎症动物模型对进一步研究EB的 发病机制和哮喘气道高反应性的发生机理具有重要意义。经检索目前国际上尚未建立确切的EB动物模型。仅有日本学者Ishiura提出了 EB豚鼠模型的建立方法。但该模型使用多粘菌素滴鼻造模，不符合人类EB的流行病学情 况。并且药物改变了豚鼠体内状态，可能影响最终的判断。另外该模型并非应用于与哮喘 比较，因此不适用于气道高反应性机制的研究。而且豚鼠的生化免疫试剂非常少，今后的进 一步研究受到了约束。因此该模型的应用受到极大限制，该学者发表文章后未见其他研究 应用该模型。目前小鼠模型中用于反映气道反应性的较为常用指标是无创肺功能检测的 Penh (enhanced pressure，增高的压力)，但有研究认为该指标也有缺陷，容易受到很多因 素如小鼠的运动、小鼠的潮气量、功能残气量以及气体的温度、湿度等的影响，结果不直观， 很多情况下不能真正反映气道反应性。有创肺功能检查可以直接检测下气道功能，排除上气道阻力等因素对肺功能的影响，是目前国际公认的检测小动物肺功能的金标准。
发明内容
为了克服现有技术的缺点和不足，本发明的首要目的在于提供一种建立无气道高 反应性嗜酸粒细胞性气道炎症小鼠模型的方法。本发明的目的通过下述技术方案实现一种建立无气道高反应性嗜酸粒细胞性气 道炎症小鼠模型的方法，包括以下操作步骤(1)小鼠的准备雌性Balb/c小鼠，小鼠的年龄为6 10周龄，动物级别为SPF 级；(2)小鼠的模型制作在实验第0、7和14天分别用IOyg鸡卵清蛋白+1.3mg氢 氧化铝的生理盐水混悬液200 μ 1给予小鼠腹腔内注射，进行致敏；分别在实验第21、22和 23天对小鼠进行浅麻醉后，给予质量百分比浓度为0. 02%的鸡卵清蛋白溶液50ul进行滴
鼻激发；(3)小鼠的处理在实验第23天进行滴鼻激发24 48小时后对小鼠进行创肺功 能检测和支气管肺泡灌洗液细胞分类计数分析，并且收集小鼠的肺以观察肺组织学变化， 即获得类似人类的无气道高反应性嗜酸粒细胞性气道炎症的小鼠模型。步骤(1)所述小鼠的年龄优选6 7周龄。本发明建立的小鼠模型与哮喘小鼠模型相比，滴鼻激发期间竖毛、呼吸急促和腹 肌抽搐的表现减轻且较快恢复；支气管肺泡灌洗液白细胞分类计数显示和对照组比较嗜酸 粒细胞(EOS)明显增高，与哮喘组相仿，提示小鼠气道嗜酸粒细胞性炎症形成；本发明建立 的小鼠模型的基础气道阻力无明显变化，与对照组之间气道阻力无显著差异；提示本模型 无气道高反应性产生。对本发明建立的小鼠模型进行肺组织形态学观察，与对照组相比，可 见支气管、细支气管上皮下和小血管周围有炎性细胞浸润，以嗜酸粒细胞和淋巴细胞为主， 上皮细胞轻度变性脱落，肺泡腔内渗出增加，可见组织细胞或巨噬细胞，间质充血水肿，但 程度较哮喘小鼠模型减轻。本发明的原理是EB作为一种变态反应性疾病有与哮喘相似的病因和临床表现。 有学者认为EB的气道嗜酸粒细胞浸润程度较轻，释放出相关的炎症介质较少，对气道上皮 作用较弱。也可能是二者的基础反应不同、遗传易感性不同。Brightling认为，EB患者中 与咳嗽密切相关的炎症介质(组胺和前列腺素D2)明显增加，与哮喘有关的炎症介质(半 胱氨酸白三烯、嗜酸粒细胞阳离子蛋白等)没有区别。发明人在之前的研究中显示EB患者 气道粘膜基底膜厚度显著低于哮喘患者，炎症细胞浸润程度低于咳嗽变异性哮喘患者。这 些都提示EB和哮喘本质也许是一样的。因此发明人选择哮喘模型建立中常用的OVA进行 致敏，通过低剂量激发试图得到无气道高反应性嗜酸粒细胞气道炎症的小鼠模型。本发明 还采用气管插管和机械通气的有创方法，使用经典的小鼠气道阻力作为指标测定小鼠气道 反应性变化，结合气道炎性细胞浸润情况，对哮喘气道反应性增高程度作出准确评价。本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果本研究模型模仿成熟的小鼠 哮喘模型制作方法，仅在激发阶段使用低剂量鸡卵清白蛋白滴鼻与哮喘不同之外，其它过 程完全一致，从而减少了造模阶段的差异；使用鸡卵清白蛋白做为变应原，更能模拟人类哮 喘的病因学变化，且与哮喘小鼠模型比较时有更好的操作背景；模型制作过程中小鼠气道反应性使用Buxco有创肺功能仪进行检测，是目前国际上检测小动物肺功能的金标准，检 测方法和结果得到国际公认。模型制作之后得到的结果能够模拟人类EB疾病的主要病理 生理学特点，即无气道高反应性，有气道嗜酸粒细胞性炎症，提示模型建立成功。该小鼠模 型与小鼠哮喘模型的病理生理学特点仅存在气道反应性不同，在气道炎症方面具有相似的 特点，排除了气道炎症在研究气道高反应性方面的干扰，为气道高反应性研究提供了较以 往更好的动物模型。小鼠是目前应用最广的实验动物，因其广泛的分生、免疫组化试剂和基 因操作手段，模型建立之后的后续研究将有广泛的适用范围。该模型是在国际上首次建立 的无气道高反应性嗜酸粒细胞性支气管炎小鼠模型，为EB的发病机制和气道高反应性的 研究奠定了良好的基础，提供了广阔的前景。
图1为小鼠支气管肺泡灌洗液分析图。图2为小鼠气道反应性变化图。图3为小鼠肺组织形态图，其中A为对照组小鼠肺组织病理图，B为模型组小鼠肺组织病理图，C为哮喘组小鼠肺组织病理图。
具体实施例方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。实施例1(1)动物及分组SPF级雌性Balb/c小鼠30只，6 7周龄，体重18 20g，广东省 实验动物中心提供(购买日期2009年7月16日；实验动物质量合格证明No. 0052732)， 饲养于广州呼吸疾病研究所SPF级动物室，自由进食去卵白蛋白SPF级饲料和饮水，昼夜明 暗交替12/12小时；随机分为生理盐水(NS)对照组、模型组和哮喘组，每组8只。(2)试剂鸡卵清蛋白(0VA，V级)，氢氧化铝溶液，乙酰甲胆碱(MCh)，均购自美国 Sigma公司，用生理盐水配制MCh激发液，浓度为3. 12mg/ml、6. 25mg/ml、12. 5mg/ml、25mg/ ml 禾口 50mg/mlo(3)主要仪器小鼠肺功能仪有创检测系统(RC System)，美国Buxco公司；普通光 学显微镜，德国ZEISS公司。(4)模型制备哮喘组小鼠在实验第0、7、14天用10 μ g 0VA+1. 3mg氢氧化铝的生 理盐水混悬液200μ 1，予小鼠腹腔内注射进行致敏；分别在实验第21、22和23天对小鼠浅 麻醉后，予质量百分比浓度为0. 4%的OVA溶液50ul滴鼻激发；在实验第23天进行滴鼻激 发24小时后进行小鼠有创肺功能检测；对照组予0. 2ml生理盐水(NS)进行致敏及50 μ 1 生理盐水进行滴鼻激发；模型组小鼠激发时改用质量百分比浓度为0. 02%的OVA溶液50ul 滴鼻激发，其余步骤同哮喘组。(5)肺功能检测BuXC0小鼠肺功能仪有创肺阻抗法测定小鼠的气道反应性对小 鼠腹腔注射质量百分比浓度为1 %的戊巴比妥钠60mg/kg进行麻醉，在第2和3环状软骨做 横行切口，置入20G插管，将小鼠置于Buxco体描箱中，连接小动物呼吸机行机械通气；呼吸 频率120次/分，潮气量10ml/kg ；首先记录小鼠基础气道阻力(lung resistence, Rl) lmin,随后盐水雾化激发了解OVA溶剂对气道的影响，盐水激发所得的肺阻力与基础肺阻力的比 值增高超过10%的小鼠考虑其对盐水存在气道高反应性则弃去。之后测定以IOul倍增浓 度的乙酰甲胆碱雾化激发后&的变化；每次雾化lmin，记录3min。Mch激发浓度由低到高， 依次为 3. 12mg/ml、6. 25mg/ml、12. 5mg/ml、25mg/ml 和 50mg/ml，以 Mch 激发后 Rl 为评价指 标。(6)支气管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid, BALF)分析肺功能检 测结束后，将气管插管内注入0. 8ml磷酸盐缓冲液(PBS液)，注入3次，共2. 4ml，反复抽吸 3次后立即回收，回收率为80%。离心后细胞沉淀用ImlPBS液混勻，取IOul入血细胞计数 板进行细胞总数测定，取IOOul悬浮液涂片，苏木素&伊红(HE)染色，在光学显微镜下计数 200个白细胞并进行分类。(7)肺组织病理变化BALF分析结束后，气管插管内注入质量百分比浓度为的4% 多聚甲醛0. 8ml行内固定，取全肺置于质量百分比浓度为4%多聚甲醛溶液中固定24小时 以上；然后用常规石蜡包埋，HE染色，光学显微镜下观察肺组织病理变化，观察肺组织大体 变化和炎症细胞浸润情况。(8)统计学处理应用SPSS12. 0统计学软件，数据以；表示，多组间比较采用
单因素方差分析，多组间两两比较采用最小显著差异法(LSD法)。(9)结果喘息表现哮喘组小鼠在滴鼻激发期间出现明显竖毛、呼吸急促和腹肌抽搐等表 现。模型组和对照组小鼠的上述症状明显减轻且较快恢复正常。BALF白细胞总数及分类不同剂量OVA致敏后，BALF中的细胞总数明显增加，模型 组和哮喘组同对照组比较有显著差异。分类计数中以EOS增加明显，中性粒细胞(Neu)和 淋巴细胞(Lym)也有不同程度增高，巨噬细胞(Mac)显著下降(如图1所示)。气道反应性变化和对照组比较，哮喘组小鼠的基础气道阻力增高，模型组小鼠的 基础气道阻力无明显变化；哮喘组的基础气道阻力和对照组及模型组比较均有增高，模型 组和对照组之间的&无显著差异。经生理盐水激发后，各组的气道阻力增加值不超过10%。 倍增浓度的Mch激发后，模型组和对照组比较无显著差异。在6. 25mg/ml之后哮喘组与对 照组及模型组比较气道反应性均明显增高，有显著差异(如图2所示)。肺组织形态学观察对照组小鼠肺组织结构清晰，肺泡壁、肺内支气管壁及血管周 围无炎性细胞浸润，间质无充血水肿。哮喘组小鼠支气管、细支气管上皮下和小血管周围 可见明显炎性细胞浸润，以EOS为主，上皮细胞轻度变性脱落，肺泡腔内渗出增加，可见组 织细胞或巨噬细胞，间质充血水肿。模型组小鼠上述表现存在但较哮喘组减轻(如图3所 示)°本实验结果显示哮喘组小鼠基础肺阻力显著高于对照组和模型组，模型组和对照组的基础肺阻力无显著差异。生理盐水激发后气道阻力与基础肺阻力比较，三组均未超过 10%，提示生理盐水作为MCh的溶剂对气道阻力基本无影响。倍增浓度的MCh激发后，在浓 度大于6. 25mg/ml的哮喘组与对照组比较气道反应性均明显增高，显示哮喘组小鼠出现气 道反应性增高，模型成功建立。模型组小鼠在各MCh浓度点气道反应性与对照组比较无显著差异，在MCh浓度大 于6. 25mg/ml时与哮喘组有显著差异，提示模型组小鼠无气道高反应性产生。
BALF显示模型组和哮喘组中细胞分类有明显变化，其中以EOS增高为主。肺组织 病理显示模型组和哮喘组中均有炎症细胞浸润，以EOS和淋巴细胞为主，后者表现更加明
Mo 综上所述，应用腹腔注射OVA致敏结合小剂量OVA滴鼻激发的方法制备的小鼠模 型，具有嗜酸粒细胞性气道炎症的病理生理特征，无气道反应性增高的气道表现，是一种较 为理想的无气道高反应性嗜酸粒细胞性气道炎症动物模型，为进一步研究EB和哮喘之间 的联系与区别奠定了实验基础。目前我国学者在建立小鼠哮喘模型时多未检测小鼠气道反应性，仅通过气道炎症 来判断小鼠哮喘模型的成立。本实验从另一方面说明仅通过BALF中EOS增高和肺组织病 理炎症浸润改变并不能真正确定哮喘模型的成功，必须进行肺功能检测得到与对照组有意 义的肺功能差异才是确定模型成功的依据。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
一种建立无气道高反应性嗜酸粒细胞性气道炎症小鼠模型的方法，其特征在于包括以下操作步骤(1)小鼠的准备雌性Balb/c小鼠，小鼠的年龄为6～10周龄，动物级别为SPF级；(2)小鼠的模型制作在实验第0、7和14天分别用10μg鸡卵清蛋白+1.3mg氢氧化铝的生理盐水混悬液200μl给予小鼠腹腔内注射，进行致敏；分别在实验第21、22和23天对小鼠进行浅麻醉后，给予质量百分比浓度为0.02％的鸡卵清蛋白溶液50ul进行滴鼻激发；(3)小鼠的处理在实验第23天进行滴鼻激发24～48小时后对小鼠进行创肺功能检测和支气管肺泡灌洗液细胞分类计数分析，并且收集小鼠的肺以观察肺组织学变化，即获得类似人类的无气道高反应性嗜酸粒细胞性气道炎症的小鼠模型。
2.根据权利要求1所述的一种建立无气道高反应性嗜酸粒细胞性气道炎症小鼠模型 的方法，其特征在于步骤(1)所述小鼠的年龄为6 7周龄。
全文摘要
本发明公开了一种建立无气道高反应性嗜酸粒细胞性气道炎症小鼠模型的方法。该方法包括步骤(1)小鼠的准备SPF级雌性Balb/c小鼠，5～6周龄；(2)小鼠造模在实验第0、7和14天分别用10μg鸡卵清蛋白+1.3mg氢氧化铝的生理盐水混悬液200μl给予小鼠腹腔内注射，进行致敏；在实验第21、22和23天对小鼠进行浅麻醉，予质量百分比浓度0.02％的鸡卵清蛋白溶液50ul进行滴鼻激发；(3)小鼠的处理在末次激发24～48h后对小鼠进行创肺功能检测和支气管肺泡灌洗液细胞分类计数分析，收集小鼠的肺以观察肺组织学变化，即获得类似人类的无气道高反应性嗜酸粒细胞性气道炎症的小鼠模型。
文档编号A01K67/027GK101796937SQ201010109450
公开日2010年8月11日 申请日期2010年2月5日 优先权日2010年2月5日
发明者谢佳星, 赖克方, 钟南山, 陈莉延 申请人:广州医学院第一附属医院;广州呼吸疾病研究所;呼吸疾病国家重点实验室