专利名称：通过花药培养获得洋桔梗再生植株的方法
技术领域：
本发明涉及一种通过花药培养获得洋桔梗再生植株的方法，属于生物技术领域。
背景技术：
洋桔梗(Eustoma grandif lorum)为龙胆科观赏植物，原产于北美洲，其株态轻盈， 花色典雅，花形别致，茎杆叶片光洁动人，是近年来国际上流行的一种高档切花。其种源主 要是从国外进口 Fl杂种，价格昂贵，给洋桔梗切花生产带来很多困难。
发明内容
为解决Fl杂种需进口，洋桔梗切花难以生产等问题，本发明提供一种通过花药培 养获得洋桔梗再生植株的方法。通过本发明可对洋桔梗进行花药培养产生单倍体植株，再 经秋水仙素加倍处理能够产生纯合自交系，可为Fl代种子生产提供优良的亲本材料。本发明通过下列技术方案完成一种通过花药培养获得洋桔梗再生植株的方法， 其特征在于经过下列工艺步骤A.将经过预处理的花蕾灭菌后切除花冠，剥出花药，除去花丝，将花药接种在 MS+0. 5 3mg/L的ΚΤ+0. 5 3mg/L的2，4_D，pH为5. 5 6. O的诱导培养基上，在光照强 度为1500 20001x，光照时间为8 12小时/天，温度为20 28°C条件下，培养20 40天，取出，放入上述诱导培养基上，如此反复培养至花药上长出愈伤组织；B.将A中继代培养的愈伤组织置于MS+0. 5 3mg/L的ΚΤ+0. 1 0. 5mg/L的NAA， pH为5. 5 6. 0的分化培养基上，在温度为20 28°C，光照强度为1500 20001x，光照 时间为8 12小时/天的条件下，培养20 40天，使愈伤组织分化出芽，未分化的愈伤 组织继续放入上述相同分化培养基上，在相同条件下继续培养至分化出芽；C.将B中分化出的芽置于MS+0. 1 0. 5mg/L的ΒΑ+0. 1 0. 5mg/L的NAA，pH为 5. 5 6. 0的繁殖培养基上，在温度为20 28°C，光照强度为1500 20001x，光照时间 为8 12小时/天的条件下，培养20 40天，即获得花药培养的洋桔梗再生植株。所述A中的花蕾预处理经过下列步骤(1)于冬季选洋桔梗材料，取其花蕾；(2)将花蕾装入塑料袋中，放入3 6°C冰箱中2 4天； (3)花蕾用体积浓度为75 %的酒精消毒30 60秒，再用质量浓度为0. 05 0. 2 % 的HgC12消毒10 20分种，最后用无菌水冲洗2 4次，吸干花蕾上的水分，得预处理灭 菌的花蕾。所述A中的花蕾为花萼等长于花冠或者花萼稍长于花冠的花蕾。本发明与现有技术相比具有下列优点和效果通过本发明之方法对洋桔梗花药进 行离体培养，诱导洋桔梗基因型成功率达100 %，愈伤诱导率达35 100 %，愈伤组织分化 率为8 23%，分化植株最高可达28株/愈伤组织，为洋桔梗单倍体植株的获得提供了可 靠技术支持，进而有望解决生产洋桔梗切花困难、成本高等问题。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步描述。实施例1A.所用洋桔梗材料为‘Ceremony Orange’，取花萼与花冠等长的花蕾；将花蕾送冰箱内于;TC放置4天；取出花蕾用体积浓度为75%的酒精消毒30秒，再用质量浓度为 0.2%的HgC12消毒10分种，最后用无菌水冲洗3次，用经过高压灭菌处理的滤纸吸干花蕾 上的水分；将花蕾切除花冠，剥出花药，除去花丝后，接种在MS+0. 5mg/L的KT+0. 5mg/L的 2,4-D, pH为5. 5的诱导培养基上，在光照强度为15001x，光照时间为12小时/天，温度 20°C，培养40天，取出，放入新的与上述相同的诱导培养基上至花药长出愈伤组织，切下愈 伤组织，未长愈伤组织的花药继续在相同的诱导培养基中，相同培养条件下进行继代培养 至长出愈伤组织；B.将A中继代培养的愈伤组织置于MS+0. 5mg/L的KT+0. lmg/L的NAA，pH为5. 5 的分化培养基上，在温度20°C，光照强度为15001x，光照12小时/天的条件下，培养40天， 从愈伤组织分化出芽，未分化的愈伤组织再放入相同配方的上述分化培养基上、在相同培 养条件下继续培养分化出芽；C.将B中分化出的芽置于MS+0. lmg/L的BA+0. lmg/L的NAA，pH为5. 5的繁殖培 养基上，在温度为20°C，光照强度为15001χ，光照时间为12小时/天，培养40天，即获得 花药培养的洋桔梗再生植株。该实施例的愈伤诱导率达77. 3%，愈伤组织分化率为12. 1 %。实施例2Α.选洋桔梗材料‘Art Peach’，取花萼稍长于花冠的花蕾；将花蕾放入冰箱中于 6°C放置2天；取出花蕾用体积浓度为75%的酒精消毒60秒，再用质量浓度为0. 05%的 HgC12消毒20分种，最后用无菌水冲洗2次，用经过高压灭菌处理的滤纸吸干花蕾上的水 分；将花蕾切除花冠，剥出花药，除去花丝，将花药接种在MS+3mg/L的KT+3mg/L的2，4_D， PH为6.0的诱导培养基上，在光照强度为20001x，光照时间为8小时/天，温度28°C，培 养20天，取出，放入上述诱导培养基上至花药长出愈伤组织，切下愈伤组织，未长愈伤组织 的花药继续在相同的诱导培养基中，相同培养条件下进行继代培养至长出愈伤组织；B.将A中继代培养的愈伤组织置于MS+3mg/L的KT+0. 5mg/L的NAA，pH为6. 0的 分化培养基上，在温度28°C，光照强度为20001x，光照8小时/天的条件下，培养20天，从 愈伤组织分化出芽，未分化的愈伤组织继续放入相同配方的上述分化培养基上，在相同培 养条件下继续分化出芽；C.将B中分化出的芽置于MS+0. 5mg/L的BA+0. 5mg/L的NAA，pH为6. 0的繁殖培 养基上，在温度为28°C，光照强度为20001x，光照时间为8小时/天，培养20天，即获得花 药培养的洋桔梗再生植株。该例愈伤诱导率达100 %，愈伤组织分化率为15.6%。实施例3A.选洋桔梗材料‘Cessna White’，取花萼稍长于花冠的花蕾；将花蕾放入冰箱内 于4°C放置3天；花蕾用体积浓度为75%的酒精消毒40秒，再用质量浓度为0. 1 %的HgC12消毒15分种，最后用无菌水冲洗4次，用经过高压灭菌处理的滤纸吸干花蕾上的水分；将花蕾切除花冠，剥出花药，除去花丝，将花药接种在MS+lmg/L的KT+lmg/L的2，4_D，pH为5. 8 的诱导培养基上，在光照强度为18001x，光照时间为10小时/天，温度25°C，培养30天， 取出，放入上述诱导培养基上至花药长出愈伤组织，切下愈伤组织，未长愈伤组织的花药继 续在相同的诱导培养基中，相同培养条件下进行继代培养至长出愈伤组织；B.将A中继代培养的愈伤组织置于MS+1. 2mg/L的KT+0. 3mg/L的NAA，pH为5. 8 的分化培养基上，在温度25°C，光照强度为ISOOlx,光照10小时/天的条件下，培养30天， 从愈伤组织分化出芽，未分化的愈伤组织继续放入相同配方的上述分化培养基上，在相同 培养条件下继续分化出芽；C.将B中分化出的芽置于MS+0. 2mg/L的BA+0. 2mg/L的NAA，pH为5. 8的繁殖培 养基上，在温度为25°C，光照强度为18001χ，光照时间为10小时/天，培养30天，即获得 花药培养的洋桔梗再生植株。该例愈伤诱导率达92.3%，愈伤组织分化率为17.7%。实施例4Α.选洋桔梗材料‘Cessna Green’，取花萼稍长于花冠的花蕾；将花蕾放入冰箱内 于4°C放置2天；取出花蕾用体积浓度为75%的酒精消毒50秒，再用质量浓度为0. 的 HgC12消毒15分种，最后用无菌水冲洗3次，用经过高压灭菌处理的滤纸吸干花蕾上的水 分；将花蕾切除花冠，剥出花药，除去花丝，将花药接种在MS+2mg/L的KT+2mg/L的2，4_D， PH为5. 5的诱导培养基上，在光照强度为20001x，光照时间为10小时/天，温度25°C，培 养30天，取出，放入上述诱导培养基上至花药长出愈伤组织，切下愈伤组织，未长愈伤组织 的花药继续在相同的诱导培养基中，相同培养条件下进行继代培养至长出愈伤组织；B.将A中继代培养的愈伤组织置于MS+1. Omg/L KT+0. 5mg/L NAA, pH为5. 5的分 化培养基上，在温度25°C，光照强度为20001x，光照10小时/天的条件下，培养30天，从 愈伤组织分化出芽，未分化的愈伤组织继续放入相同配方的上述分化培养基上，在相同培 养条件下继续分化出芽；C.将B中分化出的芽置于MS+0. 3mg/L BA+0. lmg/L NAA, pH为5. 5的繁殖培养基 上，在温度为25°C，光照强度为20001x，光照时间为10小时/天，培养30天，即获得花药
培养的洋桔梗再生植株。该例愈伤诱导率达85.7%，愈伤组织分化率为22.2%。实施例5A.选洋桔梗材料‘Volet Spring’，取花萼等长于花冠的花蕾；将花蕾于4°C冰箱 中放置2天；取出花蕾用体积浓度为75%的酒精消毒30秒，再用质量浓度为0. 2%的HgC12 消毒10分种，最后用无菌水冲洗2次，用经过高压灭菌处理的滤纸吸干花蕾上的水分；将花 蕾切除花冠，剥出花药，除去花丝，将花药接种在MS+3mg/L KT+lmg/L 2，4_D，pH为6. 0的 诱导培养基上，在光照强度为20001x，光照时间为8小时/天，温度25°C，培养40天，花药 长出愈伤组织，切下愈伤组织，未长愈伤组织的花药继续在相同的诱导培养基中，相同培养 条件下进行继代培养至长出愈伤组织；B.将A中继代培养的愈伤组织置于MS+1. Omg/L KT+0. 3mg/L NAA, pH为6. 0的分 化培养基上，在温度25°C，光照强度为20001x，光照12小时/天的条件下，培养40天，从愈伤组织分化出芽，未分化的愈伤组织继续放入相同配方的上述分化培养基上，在相同培养条件下继续分化出芽；C.将B中分化出的芽置于MS+0. 4mg/L BA+0. 2mg/L NAA, pH为6. 0的繁殖培养基 上，在温度为25°C，光照强度为20001x，光照时间为12小时/天，培养30天，即获得花药
培养的洋桔梗再生植株。该例愈伤诱导率达69. 2 %，愈伤组织分化率为14. 3 %。
权利要求
一种通过花药培养获得洋桔梗再生植株的方法，其特征在于经过下列各步骤A.将经过预处理的花蕾灭菌后切除花冠，剥出花药，除去花丝，将花药接种在MS+0.5～3mg/L的KT+0.5～3mg/L的2，4-D，pH为5.5～6.0的诱导培养基上，在光照强度为1500～2000lx，光照时间为8～12小时/天，温度为20～28℃条件下，培养20～40天，取出，放入上述诱导培养基上，如此反复培养至花药上长出愈伤组织；B.将A中继代培养的愈伤组织置于MS+0.5～3mg/L的KT+0.1～0.5mg/L的NAA，pH为5.5～6.0的分化培养基上，在温度为20～28℃，光照强度为1500～2000lx，光照时间为8～12小时/天的条件下，培养20～40天，使愈伤组织分化出芽，未分化的愈伤组织继续放入上述相同分化培养基上，在相同条件下继续培养至分化出芽；C.将B中分化出的芽置于MS+0.1～0.5mg/L的BA+0.1～0.5mg/L的NAA，pH为5.5～6.0的繁殖培养基上，在温度为20～28℃，光照强度为1500～2000lx，光照时间为8～12小时/天的条件下，培养20～40天，即获得花药培养的洋桔梗再生植株。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述A中预处理为经过下列步骤(1)于冬季选洋桔梗材料，取其花蕾；(2)将花蕾装入塑料袋中，放入3 6°C冰箱中2 4天；(3)花蕾用体积浓度为75%的酒精消毒30 60秒，再用质量浓度为0.05 0. 2%的 HgC12消毒10 20分种，最后用无菌水冲洗2 4次，吸干花蕾上的水分，得预处理灭菌的花蕾。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述A中的花蕾为花萼等长于花冠或者花 萼稍长于花冠的花蕾。
全文摘要
本发明提供一种通过花药培养获得洋桔梗再生植株的方法，经过选材、花蕾消毒、愈伤组织的诱导、愈伤组织分化成芽、再生植株的扩繁等步骤，获得花药培养的洋桔梗再生植株。本发明诱导洋桔梗基因型成功率达100％，愈伤诱导率达35～100％，愈伤组织分化率为8～23％，分化植株最高可达28株/愈伤组织，可为F1代种子生产提供优良的亲本材料。
文档编号A01H4/00GK101836587SQ20101013393
公开日2010年9月22日 申请日期2010年3月29日 优先权日2010年3月29日
发明者周旭红, 张颢, 曹桦, 李绅崇, 李金泽, 桂敏, 王继华, 莫锡君, 蒋亚莲 申请人:云南省农业科学院花卉研究所