甘蓝型油菜小孢子简化高效培养方法

专利名称：甘蓝型油菜小孢子简化高效培养方法
技术领域：
本发明涉及油菜小孢子培养方法，尤其涉及甘蓝型油菜小孢子简化高效培养方法，属植物新品种培育新方法。
背景技术：
甘蓝型油菜是我国主要油料作物，其遗传育种、基因组学研究、代谢组学研究、种质资源创新、细胞遗传学研究和分子遗传学研究十分活跃。油菜小孢子离体培养在上述领域有着十分广泛的应用。Lichter于1982年利用甘蓝型油菜游离小孢子培养获得再生植株，随后各国学者对影响油菜小孢子培养及其成苗的诸多因素进行了广泛的研究，使得油菜小孢子培养技术更为简化、效率更高、便于操作。我国学者根据我国温室栽培条件不足、取材主要来自大田的实际情况，研究了大田油菜小孢子培养的制约因素及相关技术，形成了一套有别于国外的甘蓝型油菜小孢子培养技术体系。但是，尽管如此，甘蓝型油菜小孢子培养技术仍然繁琐，效率低下，存在进一步简化和提高效率的要求和余地。目前甘蓝型油菜小孢子培养技术主要来自Lichter的方法，主要包括初花期从主花序和上部一次分枝花序上摘取处于单核晚期的花蕾16个，用75%的酒精进行Imin的表面消毒，再在0. 的升汞中消毒lOmin。用无菌水洗涤3次，在含13%蔗糖的B5液体培养基(含B5大量元素、微量元素、铁盐和有机成分，pH5. 8)中研磨成勻浆，用40 μ m的尼龙网过滤，滤液经800r/min离心5min，除去上清液，重复3次。加8mL含16%蔗糖和50mg/L 的秋水仙素的NLN液体培养基中，于32°C恒温培养箱中暗培养2天，使小孢子加倍。将加倍后的小孢子悬浮液经800r/min离心5min，除去上清液。再加8mL含16%蔗糖的NLN液体培养基，将上述小孢子悬浮液分装于10个直径9cm的一次性无菌培养皿中，添加NLN液体培养基将培养皿底部覆盖。密封后将培养皿置于32°C恒温培养箱中热激暗培养2天，然后移到25°C恒温培养箱中暗培养至有肉眼可见的胚状体出现，转至摇床继续培养(40r/min， 25°C，黑暗)至胚状体长大。之后将胚状体转移到含2%蔗糖的B5固体培养基(含B5大量元素、微量元素、铁盐和有机成分，0.8%琼脂，pH5.8)的培养瓶中，在2°C低温生长箱中春化处理10d，再在25°C、16h光照及弱光下光照培养，长大后移栽到大田。从上述的小孢子培养过程可以看出，甘蓝型油菜小孢子培养过程繁琐、复杂、效率低、成本高。尤其是每次取样折断整个花序，使得每个单株只能取样一次，取样的群体要求较大。对于只有少数种子的材料难以进行小孢子培养，而且由于取样来自不同的单株，单株间基因型的差别影响利用小孢子培养获得的DH群体用来研究遗传规律。而且，为了加快研究进程，我国大部分科研、教学单位在夏季到青海加代进行小孢子培养，胚状体苗的长途无菌运输也成为制约油菜小孢子培养成败的一个因素。针对上述油菜小孢子培养中存在的问题进行研究，简化培养过程、提高培养效率、 降低培养成本是决定油菜小孢子培养能否推广普及的关键。

发明内容
针对目前甘蓝型油菜小孢子培养中存在的问题，本发明在取样时期、时间、方式、 提取液、培养方法、加倍方法和长途无菌运输等技术方面分别行了改进，目的是大幅度提高甘蓝型油菜小孢子培养效率、简化培养方法和培养程序、降低培养成本。为实现本发明目的，技术方案如下
1、将取样时期由过去的初花期提前到现蕾期目前油菜小孢子培养的取样时间通常在油菜初花后。由于油菜花期升温快、可供取样的适合培养时间短，往往造成小孢子的培养时间紧，后期田间大量试验任务与室内小孢子培养工作重叠。为了增加小孢子培养时间、缓解开花后期田间与室内工作的矛盾，我们改进了取样时期，将现在的初花后取样提前到现蕾以后，提前的时间大约9天左右。具体方法为在青海省西宁市青海农科院试验田，在现蕾期、气温在20°C的上午或下午，选取 31005(H155XQva)每个单株上所有2. 8mm 3. 5mm单核靠边期的花蕾40个，放入装有碎冰的50mL离心管中，置于冰盒中带回实验室。去掉碎冰，将30mL 84消毒液倒入50mL离心管中，盖上盖子，灭菌lOmin，其间反复上下摇晃，使84消毒液与花蕾和管壁充分接触灭菌。 在超净工作台内将灭过菌的花蕾移入另外一个无菌的50mL离心管中，用4°C无菌水洗涤3 次。然后按照小孢子培养程序进行小孢子培养。表1取样时期对小孢子培养效果的影响
距离群体初花的时间(大)接种花蕾数出胚数山胚率(枚/个)
Days after first flower in No.of No. of obtained Yield of embryos
population bloomed_inoculated buds embryos_(embryo no. /bud)_
-92050625.29
-63083927.99
-340126831.71
O(CK)40136334.08
340131032.76
640103725.94
940115728.93
123576521.87
153046815.60由表1可以看出，在初花前9天(见附


图1)，取样培养可以获得胚状体，只是可以用来培养的合适大小的花蕾较少，所得的胚状体较少，但是出赔率较高。随着时间的推移， 可以用于培养的花蕾增多，出胚率也显著增加。初花前后一周可用于培养的合适大小的花蕾数量大，出胚率达到最高。初花后15天以后适合培养的花蕾数量急剧下降，出胚率也显著降低。所以，将小孢子培养的时间提前到现蕾期，不仅可以获得较为理想的培养效果，而且可以将培养时间增加30%左右，缓解油菜初花期后的用工压力。2、在一天中气温达到20°C左右取样出胚率最高
多年的油菜小孢子培养实践表明，取样时的气温对出胚率存在较大的影响。为了提高培养效率，需要探究合适的取样温度。我们在一天的上午7点、上午10点、下午14点、 下午17点四个不同的时间取样，发现出胚率明显不同。由表2可见，一天中，上午7点取样没有得到胚状体，上午10点和下午17点取样能够获得胚状体，但出胚率较低。下午14点取样出胚率最高，培养效果最好。在西宁8月中旬，早上7点的气温较低(10°C左右)，下午 14点气温可达到20°C左右，上午10点和下午17点气温都低于20°C。表2取样时间对小孢子培养效果的影响
权利要求
1.甘蓝型油菜小孢子简化高效培养方法，包括取样、培养基提取小孢子、小孢子培养、 胚状体的长途无菌运输及胚状体培养，其特征在于，对各环节进行了改进，具体如下在甘蓝型油菜现蕾期、气温20°c时，H155XQva选取每个单株上所有2. 8mm 3. 5mm单核靠边期的花蕾30-50个，放入装有碎冰的离心管中；去掉碎冰，将84消毒液倒入离心管中，灭菌，其间反复上下摇晃；将灭过菌的花蕾，用4°C的无菌水洗涤；倒掉无菌水，在离心管中滴入4°C 的无菌13%蔗糖溶液，快速研磨成勻浆，用尼龙网过滤小孢子至另一无菌离心管中，加4°C 的无菌13%的蔗糖溶液，密封，离心，弃上清液，加含16%蔗糖的NLN液体培养基，将小孢子悬浮液分装于培养皿中，添加NLN液体培养基将培养皿底部覆盖，密封；然后将培养皿置于 32°C恒温培养箱中暗培养至有肉眼可见的胚状体出现，转至摇床继续培养至胚状体长大； 将胚状体转入含2 %蔗糖、B5固体培养基的三角瓶中，或者将胚状体装入含13 %蔗糖、B5液体培养基的离心管中，密封，运输；之后将胚状体转移到含2%蔗糖、B5固体培养基的培养瓶中，在2°C低温生长箱中春化处理10d，再在25°C、16h光照及弱光下光照培养，直至移栽到温室；等再生苗长至5 10片叶时，将苗子挖出，洗净，用秋水仙素溶液浸根4-5小时，再将苗子栽于温室；花期将有花粉的单株套袋，自交获得DH种子。
2.如权利要求1所述的甘蓝型油菜小孢子简化高效培养方法，其特征在于，取样时期提前至蕾期、多次反复取样、在环境温度达到20°C以上时取样、用蔗糖溶液替代B5培养液作提取液、根据胚状体的多少选择适当的长途运输方式等。
全文摘要
本发明涉及油菜小孢子培养方法，公开了一种甘蓝型油菜小孢子简化高效培养方法，属植物新品种培育新方法。针对目前甘蓝型油菜小孢子培养中存在的问题，在取样时期、时间、方式、提取液、培养方法、加倍方法和长途无菌运输等技术方面分别行了改进，使得甘蓝型油菜小孢子培养效率大幅度提高，培养方法和培养程序简化，降低了培养成本，方便推广和应用。
文档编号A01H4/00GK102217532SQ201010147898
公开日2011年10月19日 申请日期2010年4月16日 优先权日2010年4月16日
发明者张书芬, 文雁成, 朱家成, 王建平, 赵磊 申请人:河南省农业科学院经济作物研究所