专利名称：一种培育大颗粒有核珍珠的方法
技术领域：
本发明属于养殖技术领域，涉及一种培育有核珍珠的方法，本发明所述方法用于 培育直径在8-lOmm的孵育珠核，从而能够使培育出来的珍珠具有更大的直径(一般能达 IOmm以上)，所使用的培育生物一般为淡水贝类，例如三角帆蛘等。
背景技术：
我国淡水资源丰富，淡水贝类育珠前景广阔。目前，我国淡水珍珠年产量千吨以 上，但优质、高档的珍珠却不足百吨，直径为8mm以上的珍珠在短期内难以满足国际市场的 要求。珍珠颗粒的大小在很多程度上决定了珍珠生产的经济效益。对于淡水贝类大颗粒珍 珠培育在生产上仍是一个难题。近10年来，人工育珠工艺的理论基础得到了新的发展“游 离细胞植入法培育有核珍珠”及“内脏团育珠技术”在培育淡水有核珍珠上取得了突破性进 展，为优质珍珠的培育提供了良好的生物学基础，也为大颗粒珍珠培育提供了空间的可能。 但是，大颗粒珠核插核后吐珠率高和伤口难以愈合一直困绕着大颗粒有核珍珠的培育，迫 切需要在生产工艺上进行技术创新，降低插核手术给珍珠产业带来的风险。
发明内容
本发明所要解决的主要技术问题在于现有内脏团培育有核珍珠的过程中，插入珠 核后，珍珠培育生物(例如三角帆蛘等)一般具有高吐珠率的问题，并针对该问题提供一种 培育有核珍珠的方法。本发明所采用的技术方案是一种培育大颗粒有核珍珠的方法，包括a、从蛘体上获得外套膜外表皮细胞，b、用 得到的外套膜外表皮细胞孵育珠核，得到孵育珠核，C、将孵育珠核植入育珠蛘内进行培育； C步骤所述的培育包括①、在育珠蛘内开一用于放置孵育珠核的囊袋；②、将孵育珠核塞入囊袋，囊袋开口处用生物缝合线缝合；③、对经②步骤处理后的育珠蛘进行培育。珍珠培育生物的吐珠率，如果从时间过程上看，可以分成前后两种情况，前一种情 况是指，在孵育珠核塞入囊袋的过程中，发生吐珠现象(即孵育珠核难以塞入囊袋)；后一 种情况是，在孵育珠核塞入囊袋后，发生吐珠现象。这两种现象均会造成珍珠培育生物的吐 珠率增高，给珍珠培育工作带来困难。现有技术在遇到本发明上述困难时，一般只能有意识的解决后一种情况所带来的 吐珠率提高的问题，所采取的方案通常是将插入的珠核直径减少，虽然这种做法能够从某 种程度上解决后一种情况所带来的吐珠率提高的问题，但这一方案却在解决问题的同时带 来了新的技术问题，即插入的珠核直径减少，所培育出来的珍珠颗粒也就比较小，满足不了 国际市场的需求。本发明的解决思路是同时针对珍珠培育生物吐珠率高的两个方面全面展开的，一方面，对于后一种情况，本发明通过生物缝合的技术手段能够从根本上杜绝育珠蛘在插入 珠核后，发生吐珠现象；另一方面，对于前一种情况，本发明经过研究发现，孵育珠核囊袋的 开口处并不是设置在珍珠培育生物的培育器官上的(以蛘类为例，培育器官为蛘体的内脏 团)，这样的器官往往不具有良好的肌肉收缩性能，孵育珠核塞入其中后，囊袋开口处的珠 核容纳量并没有多大变化，在这种情况下，孵育珍珠很容易从囊袋开口处突出，并最终脱离 蛘体。本发明进一步发现，以蛘类为例，蛘体内脏团与斧足的交界处具有较好的肌肉收缩性 能，因此，将囊袋开口处设置在这一部位，可以大大的增加囊袋开口处的珠核容纳量，从而 使孵育珠核塞入囊袋过程变得容易。 使用本发明的技术方案不但能够解决珍珠培育生物高吐珠率的技术问题，而且还 得到了一个附加的技术效果，那就是囊袋开口处由于可以用生物缝合线缝合，因此囊袋开 口处可以尽可能的开大些(不影响有核珍珠培育效果的前提下)，以容纳直径更大的孵育 珠核，从而为培育出大直径的珍珠创造基本条件，一般说来，本发明所述孵育珠核的直径为 8-10mmo当然，生物缝合线缝合后，塞入口(即囊袋开口处)也需要进行必要的处理，以使 塞入口不至于受到感染而产生病变，从而严重影响珍珠培育效果，或者导致育珠蛘的死亡。为此，本发明方法中的c步骤在②步骤和③步骤之间还增设了清洗消毒步骤先用抗菌素在②步骤的囊袋开口处进行清洗，然后将促肌肉生产药物涂抹到②步 骤的囊袋开口处上以使囊袋开口处的肌肉快速复原。
图1为实施例所述将附着外套膜细胞的珠核用镊子塞进内脏团囊袋深处的操作 示意图。
具体实施例方式为了使本领域技术人员很好的理解本发明的具体技术特征，以利于本发明的实 施，现对本发明做进一步的解释。一种培育大颗粒有核珍珠的方法，包括第一、从蛘体上获得外套膜外表皮细胞， 第二、用得到的外套膜外表皮细胞孵育珠核，得到孵育珠核，第三、将孵育珠核植入育珠蛘 内进行培育。其中每个步骤中又包含若干小步骤，对于第三步骤而言，它又可以分为1、在育珠蛘内开一用于放置孵育珠核的囊袋；2、将孵育珠核塞入囊袋，囊袋开口处用生物缝合线缝合；3、对经2步骤处理后的育珠蛘进行培育。技术人员可以明白的从本说明书发明内容得知，上面提到的第一、第二、第三、1、2 以及3步骤分别对应发明内容部分的a、b、c、①、②以及③步骤，技术人员可以将
发明内容
部分所涉及的各种为产生相应技术效果而提供的改进的技术方案应用到本具体实施方式
中来。本具体实施方式
的主要目的就是在以上技术方案的基础上，再对技术方案进行进 一步的扩充或者改进，以帮助本领域技术人员实现更好的技术效果。
其一，本具体实施方式
对第一步骤进行进一步的细化，细化后的第一步骤包括I、从蛘体上分离外套膜外表皮组织；II、将外套膜外表皮组织放入胰酶消化液消化，收集外套膜外表 皮细胞。为了减少细菌等有害病原物对外套膜外表皮组织的感染，可以进一步的在在I步 骤和II步骤之间设置冲洗步骤用PBS及抗生素(例如青霉素及链霉素的混合物等)的混合洗液冲洗外套膜外表 皮组织。并且最好将II步骤中的胰酶消化液的质量百分比浓度设定在0. 25% -0. 32%之 间，本具体实施方式
发现，这样的浓度设置可以完全将外套膜外表皮细胞从外套膜外表皮 组织上剥离，而又不会给外套膜外表皮细胞造成伤害。其二，本具体实施方式
对第二步骤进行进一步的细化，细化后的第二步骤包括(1)、用多聚赖氨酸处理珠核；(2)、用第一步骤获得的外套膜外表皮细胞，孵育(1)步骤得到的珠核，使珠核外 附着至少一层外套膜外表皮细胞，形成孵育珠核。第二步骤在上述(1)、(2)工作之前，一般需要对珠核进行灭菌处理。(2)步骤在保障本具体实施方式
珍珠培育效果方面的作用是十分巨大的，具体的 来讲大量外套膜外表皮细胞均勻附着外膜上表皮细胞，使外表皮细胞在移行增值过程 中能均勻包裹珠核，珍珠质的分泌和沉积分布均勻，避免了疵珠，并有效地缩短育珠时间。为了便于本领域技术人员知晓如何判断珠核外已经附着至少一层外套膜外表皮 细胞，并且能够保证外套膜外表皮细胞是均勻的附着在珠核外表面上，本具体实施方式
提 供了一种判断标准孵育后的珠核在倒置显微镜下，技术人员能够观测到外套膜外表皮细胞已经铺 满了珠核表面，形成单层细胞层，并且在水相中轻轻弹动珠核，细胞不会从珠核上脱离。为了保证(2)步骤中的孵育工作能够顺利进行，必须事先在珠核表面用粘附剂 (例如(1)步骤中的多聚赖氨酸)处理以使最先接触珠核表面的外套膜外表皮细胞能够顺 利的粘附在珠核表面上，然后再利用这些已经附在珠核表面的外套膜外表皮细胞进行繁殖 培养。在实际操作过程中，对粘附剂粘度大小的选择是有限制的，一般来说，粘度太大， 不便于珠核孵育的操作，粘度太小细胞附着在珠核上的能力较小。采用的调控粘附剂粘度的手段，一般有两种，对于本具体实施方式
提到的多聚赖 氨酸而言，可以从多聚赖氨酸的分子量及多聚赖氨酸的浓度这两方面来调节粘度，任何一 种调节手段都可以单独使用，但是两种调节手段同时使用时，本领域技术人员一般能够获 得更为精准的粘度调节效果。为满足本具体实施方式
在珠核表面上粘附外套膜外表皮细胞的需要，(1)步骤的 多聚赖氨酸的分子量在10000-150000之间，多聚赖氨酸的浓度可以设定为0. 1-0. 2mg/ml。(2)步骤中孵育(1)步骤得到的珠核的温度一般能够适应外套膜外表皮细胞的生 长繁殖即可，本具体实施方式
将该温度设定为25°C _27°C。下面再向本领域技术人员演示下，应用本具体实施方式
的实施例。
实施例本实施例采用1龄左右健康、活力强的小蛘为外套膜外表皮组织的获取来源。第一、采用撕膜法分离河蛘的外套膜外表皮组织。所采用的撕膜法，能够使获得的外套膜组织成分单一，不含内表皮组织或细胞，从而有助于高纯度外套膜外表皮细胞的获得。第二，在无菌室内，取外套膜外表皮组织在PBS溶液(含8g/LNaCl、0. 2g/LKCl、 1. 44g Na2HP04/L 和 0. 24g/L KH2PO4, pH 为 7. 4)中洗涤，然后用 PBS+200IU/mL 双抗(青霉 素及链霉素)、PBS+1000IU/mL双抗、PBS+200IU/mL双抗洗液的次序各冲洗组织一次，最后 用PBS再次冲洗。第三、取处理过的组织剪成2mm3大小的小块，用PBS冲洗小片2次，然后在组织小 片中加入0. 3%的胰酶消化液于37°C下消化30min，以完全培养基终止胰酶反应并分散细 胞，静止IOmin后取水相，离心后收集细胞。用血球计数板对细胞悬液进行计数调整细胞数 在5 X IO5-I X IO6个/mL，置于26°C CO2恒温培养箱培养细胞。第四、采用与珍珠同质的贝壳磨制的圆球形、扁平形珠核，直径为8mm，洗涤后高压 蒸汽灭菌，干燥后用0. lmg/mL的多聚赖氨酸(分子量为15，000)浸泡8小时。取出珠核， 使用恒温干燥箱在60°C下干燥，期间确保处理过程无菌污染。在细胞培养室内，用获得的外 表皮细胞及培养液在CO2恒温培养箱内孵育处理的珠核，温度26°C，孵育时间为8h，用具体 实施方式提供的判断标准进行判断，使珠核外充份附着大量的外套膜外表皮细胞。第五、选取健康有活力的3龄育珠蛘，其长达到13cm、宽达到10cm、壳高达到3. 5cm 以上，清洗外壳泥土和藻类，开壳器开壳后用“U”型架支撑壳的开口，使用75%的酒精棉球 对手术部位进行擦拭，用开口针在内脏团2与斧足3交界处水平钩开约15mm开口 4，并使 用通片针向内脏团2方向打开一口袋装囊袋，将附着外套膜细胞的珠核1用镊子塞进内脏 团囊袋深处(插核部位见图1)。插核完成后，采用单手打结法用特殊生物线对伤口进行缝 合，防止吐珠，使伤口处组织贴附在一起，同时用抗菌素和促肌肉生长药物在伤口缝合处加 以清洗和涂抹以降低伤口感染，促进肌肉再生。经术后缝合的的育珠蛘在清水池中暂养8 小时后竖直吊养于水下20cm中，进行珍珠培育。此外，本实施例植入的珠核直径较大(为8mm)，为了降低珠核对内脏团的机械损 伤，降低蛘的死亡率，植入的珠核采用一蛘一珠的方式。其培育结果可达75%左右的成珠 率，获得珍珠直径至少在IOmm以上，培育时间为两年半左右。
权利要求
一种培育大颗粒有核珍珠的方法，包括a、从蚌体上获得外套膜外表皮细胞，b、用得到的外套膜外表皮细胞孵育珠核，得到孵育珠核，c、将孵育珠核植入育珠蚌内进行培育；其特征在于c步骤所述的培育包括①、在育珠蚌内开一用于放置孵育珠核的囊袋；②、将孵育珠核塞入囊袋，囊袋开口处用生物缝合线缝合；③、对经②步骤处理后的育珠蚌进行培育。
2.根据权利要求1所述的一种培育大颗粒有核珍珠的方法，其特征在于②步骤中的孵 育珠核的直径为8-10mm。
3.根据权利要求1或2所述的一种培育大颗粒有核珍珠的方法，其特征在于①步骤中 的囊袋开口处位于内脏团与斧足的交界处。
4.根据权利要求1或2所述的一种培育大颗粒有核珍珠的方法，其特征在于所述c步 骤在②步骤和③步骤之间还增设了清洗消毒步骤先用抗菌素在②步骤的囊袋开口处进行清洗，然后将促肌肉生产药物涂抹到②步骤的 囊袋开口处上。
5.根据权利要求1或2所述的一种培育大颗粒有核珍珠的方法，其特征在于a步骤包括I、从蛘体上分离外套膜外表皮组织；II、将外套膜外表皮组织放入胰酶消化液消化，收集外套膜外表皮细胞。
6.根据权利要求5所述的一种培育大颗粒有核珍珠的方法，其特征在于a步骤在I步 骤和II步骤之间还设有冲洗步骤用PBS及抗生素的混合洗液冲洗外套膜外表皮组织。
7.根据权利要求6所述的一种培育大颗粒有核珍珠的方法，其特征在于所述冲洗步骤 中的抗生素为青霉素及链霉素的混合物。
8.根据权利要求5所述的一种培育大颗粒有核珍珠的方法，其特征在于II步骤中的胰 酶消化液的质量百分比浓度为0. 25% -0. 32%。
9.根据权利要求1或2所述的一种培育大颗粒有核珍珠的方法，其特征在于b步骤包括(1)、用多聚赖氨酸处理珠核；(2)、用a步骤获得的外套膜外表皮细胞，孵育(1)步骤得到的珠核，使珠核外附着至少 一层外套膜外表皮细胞，形成孵育珠核。
10.根据权利要求9所述的一种培育大颗粒有核珍珠的方法，其特征在于b步骤还包括 在(1)步骤之前对珠核进行灭菌处理。
11.根据权利要求9所述的一种培育大颗粒有核珍珠的方法，其特征在于(2)步骤中孵 育(1)步骤得到的珠核在25°C _27°C条件下进行。
12.根据权利要求9所述的一种培育大颗粒有核珍珠的方法，其特征在于(1)步骤的多 聚赖氨酸的分子量在10000-150000之间。
13.根据权利要求9所述的一种培育大颗粒有核珍珠的方法，其特征在于多聚赖氨酸 的浓度为 0. 1-0. 2mg/ml。
14.根据权利要求13所述的一种培育大颗粒有核珍珠的方法，其特征在于多聚赖氨酸的浓 度为 0. 1-0. 2mg/ml。
全文摘要
本发明属于养殖技术领域，涉及一种培育大颗粒有核珍珠的方法，为了解决现有培育有核珍珠的过程中，插入珠核后，珍珠培育生物(例如河蚌等)一般具有高吐珠率的问题，本发明提供了一种培育大颗粒有核珍珠的方法，该方法包括a、从蚌体上获得外套膜外表皮细胞，b、用得到的外套膜外表皮细胞孵育珠核，得到孵育珠核，c、将孵育珠核植入育珠蚌内进行培育；其中c步骤分为①在育珠蚌内开一用于放置孵育珠核的囊袋；②将孵育珠核塞入囊袋，囊袋开口处用生物缝合线缝合；③对经②步骤处理后的育珠蚌进行培育。本发明方法能够顺利解决上述技术问题，并且能够使培育出来的珍珠的直径一般在10mm以上。
文档编号A01K61/00GK101803581SQ20101016283
公开日2010年8月18日 申请日期2010年5月5日 优先权日2010年5月5日
发明者施志仪, 李文娟, 贾亮 申请人:上海海洋大学