专利名称：芦笋亲本繁殖方法
技术领域：
本发明属于草本植物的亲本繁殖领域，具体地为芦笋亲本繁殖技术。
背景技术：
芦笋学名石刁柏，系百合科天门冬属的宿根性多年生草本植物，为一种典型的雌 雄异株植物，其杂交亲本的繁殖只能采用无性繁殖方法。芦笋的无性繁殖方法有田间自然分株法和组织培养法。田间自然分株法是在亲本植株生长3年以上时，将其休眠根从田间刨出来，根据 其自然的生长状态，将其分开为3 5个芽孢群，再种回田间，使其达到增殖的目的。这种 方法繁殖效率很低，不适于用来进行大规模亲本繁殖。对于芦笋的组织培养法，目前主要采用器官培养、单细胞培养、原生质体培养、花 药培养等几种方法。在实际应用中，不同的组织培养法适用于不同的领域。①器官培养技 术主要用于快速繁殖个体，迅速扩大种群领域。主要有增殖培养和生根培养二个步骤。② 单细胞和原生质体培养技术适用于突变育种中。而其中单细胞和原生质体的分离、提取是 一项操作难度很大、成本又很高的工作。因此，这种培养技术使用的范围非常有限。③花药 培养技术主要用来培育芦笋超雄株，进一步选育全雄芦笋品种。与器官培养的最大不同是， 先经过花药培养产生愈伤组织，再由愈伤组织分化幼茎。其缺陷是愈伤组织的诱导率和幼 茎的分化率很低。已报道，该培养方法的愈伤组织诱导率最高为37. 9%，幼茎分化率最高为 21.7%。而且，花药培养产生的单倍体植株还要进行加倍，因此，不适用做亲本的大规模繁 殖。目前的器官培养法，在增殖培养方面主要是通过愈伤组织进行增殖，其增殖速度 较慢。在生根培养上主要是采用茎尖培养，先经过愈伤组织分化，再进行生根培养。已报道， 其根分化率可以达到87. 4%，甚至可达到90%以上，但其“鸡爪根”(芦笋本身具有强大粗 壮的肉质根，形似鸡爪，俗称“鸡爪根”)的分化率只有20%左右。其形成的根很细，且发生 于外植体茎尖切口处的愈伤组织中，愈伤组织中某些薄壁组织经过再次脱分化成为胚性细 胞，形成与周围邻接的薄壁组织有明显界限的一群分生细胞，进一步发展成为一个生长中 心(即“分生组织结节”)。分生组织结节单向极性分化时，由其外围局部的形成层状细胞 的旺盛分裂而使细胞增殖，使结节在某一方向迅速生长，形成根原基而发展形成根。从愈伤 组织中分化的根(愈伤化根)，其维管束与茎维管束不相连接，移栽成活率极低，只有不到 10%。严重影响了芦笋组织培养的繁殖效率，成为芦笋组织培养的最大障碍。
发明内容
本发明主要解决在芦笋器官组织培养过程中，所遇到的生根率低、根系质量差、移 栽成活率低等问题。提供一种由芦笋茎段腋芽直接生根的芦笋亲本繁殖方法，以达到生根 快、生根率高、根系质量好、移栽成活率高的目的。本发明是采用以下方式来实现的
该芦笋亲本繁殖方法，是通过选取优质芦笋并切成带有一个发育良好腋芽的芦 笋茎段，再经消毒、冲洗预处理后，在培养基溶液中进行培养，繁殖出可达移栽标准芦笋苗 的过程。该培养基溶液是在基本培养基溶液的基础上相对各培养阶段添加相应的激素配 制而成的，该基本培养基溶液组分如下每升基本培养基溶液中含NH4N031400 1800mg、 KNO3 1800 2000mg、CaCl2 · 2H2 0 300 600mg、MgSO4 · 7H20 250 490mg、KH2PO4 80 260mg、KI 0· 5 1. 2mg、H3B035 7. 4mg、MnSO4 · 4H20 15 29mg、ZnSO4 · 7H20 7 10mg、 Na2MoO4 · 2H20 0. 1 0. 4mg、CuSO4 · 5H20 0. 015 0. 04mg、CoCl2 · 6H20 0. 015 0. 04mg、 Na2EDTA (乙二胺四乙酸二钠)25 50mg、FeSO4 · 7H20 15 40mg、VBl (维生素 Bi) 0· 3 0. 5mg、VB6 (维生素 B6) 0. 4 0. 6mg、甘氨酸 1 3mg、烟酸 0. 3 0. 7mg、肌醇 80 120mg、 琼脂3 7g、蔗糖20 40g。该培养依次为诱导培养、增殖培养、生根预分化培养、生根培 养，其具体步骤如下第一步、诱导培养将经预处理后的芦笋茎段置入灭菌处理后的诱导培养基溶液 中，放入温度为27°C 士 1V的培养室，在光照和黑暗条件下交替培养30天左右，从芦笋茎段 的腋芽处培养出3 5根嫩茎，得芦笋嫩茎；所述的诱导培养基溶液是通过以下方式配制 的量取由上述组分配制而成的基本培养基溶液一定量，并按0. 1 0. 3mg/L的标准加入萘 乙酸激素、按0. 4 0. 6mg/L的标准加入6-苄基腺嘌呤激素，充分搅拌，混合均勻，得诱导 培养基溶液；第二步、增殖培养将第一步所得的芦笋嫩茎切成带有一个腋芽的芦笋嫩茎段并 置入灭菌处理后的增殖培养基溶液中，放入温度为27 V 士 1°C的培养室，在光照和黑暗条 件下交替培养25天左右，从芦笋嫩茎段的腋芽处增殖培养出3 5根嫩茎，得嫩茎种；所述 的增殖培养基溶液是通过以下方式配制的量取由上述组分配制而成的基本培养基溶液一 定量，并按0. 1 0. 3mg/L的标准加入萘乙酸激素、按0. 2 0. 4mg/L的标准加入激动素， 充分搅拌，混合均勻，得增殖培养基溶液；第三步、生根预分化培养将第二步所得的嫩茎种切成带有一个腋芽的嫩茎种段， 并置入在灭菌处理后的预分化培养基溶液中，放入温度为27V 士 1°C的培养室，在光照和 黑暗条件下交替培养20天左右，在该嫩茎种段的腋芽与茎的结合部位处分化生长出粗壮 的白根，得带根嫩茎种；所述的预分化培养基溶液是通过以下方式配制的量取由上述组 分配制而成的基本培养基溶液一定量，并按0. 05 0. 15mg/L的标准加入萘乙酸激素、按 0. 4 0. 6mg/L的标准加入吲哚丁酸激素、按0. 05 0. 15mg/L的标准加入激动素、按1. 0 2. Omg/L的标准加入嘧啶醇激素，充分搅拌，混合均勻，得预分化培养基溶液；第四步、生根培养将第三步所得的带根嫩茎种接种在灭菌处理后的生根培养基 溶液中，并放入温度为27°C 士 10C的培养室中，在光照强度为3000Lx左右下光照16小时和 在黑暗中放置8小时，交替培养30天左右，该嫩茎种的腋芽将培养成3根左右的嫩茎，在腋 芽与茎的结合部位培养出3条左右的粗壮的肉质根，达到移栽标准，得芦笋苗；所述的生根 培养基溶液是通过以下方式配制的量取由上述组分配制而成的基本培养基溶液一定量， 并按0. 1 0. 3mg/L的标准加入萘乙酸激素、按1. 0 2. Omg/L的标准加入嘧啶醇激素，充 分搅拌，混合均勻，得生根培养基溶液；上述各步骤中的灭菌处理是在0. 105Mp大气压和121°C 士 1°C的条件下进行20分 钟的灭菌过程；
上述第一至第三步骤中的光照和黑暗条件下交替培养是指在光照强度为3000Lx 左右下光照14小时和在黑暗中放置10小时。优选基本培养基溶液的组分如下每升溶液中含NH4N031650mg、KNO3 1900mg、 CaCl2 ·2Η20 440mg、MgSO4 ·7Η20 370mg, KH2PO4 170mg、KI 0. 83mg, H3BO3 6. 2mg、MnS04 · 4H20 22. 3mg、ZnSO4 · 7H20 8. 6mg、Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg、CuSO4 · 5H20 0. 025mg、CoCl2 · 6H20 0. 025mg、Na2EDTA (乙二胺四乙酸二钠)37. 3mg、FeS04 ·7Η20 27. 8mg、VBl (维生素 Bi) 0. 4mg、 VB6(维生素B6)0. 5mg、甘氨酸2. Omg、烟酸0. 5mg、肌醇lOOmg、琼脂5g、蔗糖30g。进一步，上述基本培养基溶液的Ph值为6.0士0. 1，是通过0. IM的NaOH溶液或 0. IM的HCl溶液进行调整的。 上述基本培养基溶液的配制步骤如下首先称取琼脂3 7g、蔗糖20 40g置 入大量杯中，加入蒸馏水至500ml，充分搅拌使其溶解，待用；然后分别称取大量元素NH4NO3 1400 1800mg、KN03 1800 2000mg,CaCl2·2Η20 300 600mg、MgS04·7Η20 250 490mg、 KH2P0480 260mg ；微量元素 KI 0· 5 1. 2mg、H3BO3 5 7. 4mg、MnSO4 · 4H2015 29mg、 ZnSO4 ·7Η207 IOmg^Na2MoO4 ·2Η20 0· 1 0. 4mg,CuSO4 ·5Η20 0. 015 0. 04mg、CoCl2 ·6Η20 0. 015 0. 04mg ；Na2EDTA25 5Omg(乙二胺四乙酸二钠)、FeSO4 · 7H20 15 40mg 和有机 物母液VBl 0. 3 0. 5mg、VB6 0. 4 0. 6mg、甘氨酸1 3mg、烟酸0. 3 0. 7mg、肌醇80 120mg，并置于500ml量筒中，加蒸馏水到500ml，充分溶解；再将量筒中的溶液加入到前述 的大量杯溶液中，充分搅拌，均勻混合；最后用0. IM的NaOH和0. IM的HCl溶液调整其Ph 值到 6.0 士 0. 1。该预处理包括芦笋茎的选取，切段，浸泡消毒及冲洗；其浸泡是依次在70%酒精 溶液中浸泡15 20秒，15%的次氯酸钠溶液中浸泡15分钟。上述的置入是采用腋芽朝上平放的方式；上述的接种是采用根系朝下的方式。本发明与目前的器官培养相比，具有以下积极效果1、本发明直接从田间取回的 芦笋嫩茎经诱导后长出的新茎直接进行切段增殖，取材方便，可适应于大面积的繁殖培养， 且其增殖速度大大提高；2、本发明的增殖过程未经过愈伤组织而直接诱导幼茎分化，其幼 茎分化率从21. 7%提高到100% ；3、本发明的增殖过程中，省出了愈伤组织的诱导时间，极 大地提高了增殖效率；4、本发明与现在普遍采用的用茎尖培养，通过愈伤组织生根的方法 相比，生根率从87. 4%提高到100%、鸡爪根(芦笋本身具有强大粗壮的肉质根，形似鸡爪， 俗称“鸡爪根”，这类根发生在茎基部维管束结节处，且根中的维管组织与茎维管组织是相 连接)的分化率从20%左右提高到96%，从而保证了移栽后的成活率，由不到10%提高到 接近100%。总之，本发明与现有芦笋组织培养技术相比，在增值效率、生根率、生根质量、移 栽成活率方面都有非常显著的提高。
具体实施例方式实施例一本发明的芦笋亲本繁殖方法，是通过选取优质芦笋并切成带有一个发育良好腋芽 的茎段，再经消毒、冲洗预处理后，在培养基溶液中进行培养，繁殖出可达移栽标准芦笋苗 的过程。基本培养基溶液的组分和配制
该基本培养基溶液的组分如下每升溶液中含NH4NO3 1650mg, KNO3 1900mg、 CaCl2 · 2H20 440mg、MgSO4 · 7H20 370mg、KH2PO4 170mg、KI 0. 83mg、H3BO3 6. 2mg、 MnSO4 · 4H20 22. 3mg、ZnSO4 · 7H208. 6mg、Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg、CuSO4 · 5H20 0. 025mg、 CoCl2 · 6H200. 025mg、Na2EDTA (乙二胺四乙酸二钠)37. 3mg、FeSO4 · 7H20 27. 8mg、VBl (维生 素Β1)0· 4mg、VB6(维生素Β6)0· 5mg、甘氨酸2. Omg、烟酸0. 5mg、肌醇lOOmg、琼脂5g、蔗糖 30g。 该基本培养基溶液的具体配制步骤如下首先称取琼脂5g、蔗糖30g置入大量杯 中，加入蒸馏水至500ml，充分搅拌使其溶解，待用；然后分别称取大量元素NH4NO3 1650mg、 KNO3 1900mg、CaCl2 · 2H20 440mg、MgSO4 · 7H20 370mg、KH2PO4 170mg ；微量元素 KI 0. 83mg、 H3BO3 6. 2mg、MnSO4 · 4H20 22. 3mg、ZnSO4 · 7H20 8. 6mg、Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg、CuSO4 · 5H20 0. 025mg、CoCl2 · 6H200. 025mg、Na2EDTA 37. 3mg、FeSO4 · 7H20 27. 8mg 禾口 有机物母液 VB10. 4mg、VB60. 5mg、甘氨酸2. Omg、烟酸0. 5mg、肌醇lOOmg，并置于500ml量筒中，加蒸馏 水到500ml，充分溶解。再将量筒中的溶液加入到前述的大量杯中，充分搅拌，均勻混合。用 精密试纸测试其Ph值为5. 6，用滴管滴入0. IM的NaOH溶液至Ph值到6.0士0. 1。即配制 了基本培养基溶液，待用。上述大量元素和微量元素的作用是提供植物生长所必需的矿物 质营养元素；蔗糖和有机物为植物生长提供必要的C、H、0、N等有机营养元素和必要的植物 生理活性物质，以维持植物的的正常代谢。该基本培养基溶液应随配随用，一般不能超过24 小时。该预处理包括芦笋茎的选取，切段，浸泡消毒及冲洗；从田间选取无病虫危害的 嫩芦笋茎，用清水冲洗干净，切成具有一个发育好腋芽的近1厘米长的茎段，再将该茎段放 入70%酒精溶液中浸泡15 20秒，然后放入15%的次氯酸钠溶液中，浸泡15分钟取出， 用无菌水冲洗3遍，得芦笋茎段。其中每根嫩芦笋茎平均可切成达到上述标准的芦笋茎段 4个(第一代)，根据需要可适当选取进适应的第一代芦笋茎段。本发明的培养依次为诱导培养、增殖培养、生根预分化培养、生根培养，其具体步 骤分别如下第一步、诱导培养，主要是将预处理后的芦笋茎段诱导分化出尽可能多的可用于 增值培养的第二代芦笋。首先，配制诱导培养基溶液量取基本培养基溶液500ml，放入量 杯中，并按0. 2mg/L的标准加入萘乙酸(NAA)O. lmg、按0. 5mg/L的标准加入6-苄基腺嘌 呤(6-BA)0.25mg，充分搅拌，混合均勻，即配制成诱导培养基溶液，待用。然后，进行诱导 培养基溶液灭菌处理取已配制成的诱导培养基溶液，按每25ml的诱导培养基溶液装入一 300ml带盖的诱导培养瓶中的要求，分别装入20个300ml的诱导培养瓶中，在0. 105Mp大气 压和121 °C 士 1 °C的条件下进行20分钟的灭菌处理，取出晾凉，备用。在超净工作台上，再将 上述经预处理后的芦笋茎段置入上述装有诱导培养基溶液并经灭菌处理后的带盖的20个 诱导培养瓶中；放入要求如下优质芦笋茎段平放诱导培养基溶液中，腋芽向上，每只诱导 培养瓶中放入5个芦笋茎段，共100个芦笋茎段。再将该装有芦笋茎段的20个诱导培养瓶 放置在温度为27°C 士 1°C的培养室中，在光照强度为3000Lx左右下光照14小时和黑暗中 10小时，交替进行培养30天左右，每个芦笋茎段上即可培养出高度为10厘米左右的3 5 根嫩茎，即第二代芦笋。其中18个芦笋茎段长出3根嫩茎，46个芦笋茎段长出4根嫩茎，35 个芦笋茎段长出5根嫩茎，共长出芦笋嫩茎413根，其中可利用进行下一步培养的有效腋芽的个数达1205个。每个芦笋茎段长出嫩茎平均数超过4根，诱导培养成功率为99.0%。经 此培养过程后，由100个芦笋茎段(每个茎段上具有一个良好腋芽)诱导培养出1205个有 效腋芽，其诱导培养率达1200%，即1 12。
第二步增殖培养，主要是通过培养繁殖出大量的可用于生根预分化培养的第三 代芦笋。配制增殖培养基溶液量取经上述的配制步骤配制的基本培养基溶液500ml，并按 0. 2mg/L的标准加入萘乙酸(NAA)O. lmg、按0. 3mg/L的标准加入激动素(KT)O. 15mg,充分 搅拌，混合均勻，即配制成增殖培养基溶液，待用。然后，进行增殖培养基溶液灭菌处理取 上述的配制好的增殖培养基溶液，按每25ml的增殖培养基溶液装入一 300ml带盖的增殖培 养瓶中的要求，分别装入20个300ml的增殖培养瓶中，在0. 105Mp大气压和121 °C 士 1°C的 条件下进行20分钟的灭菌处理，取出晾凉，备用。芦笋嫩茎的增殖培养在超净工作平台上 将上述第一步已培养好的芦笋嫩茎从诱导培养瓶中取出，切成带有腋芽的1厘米左右长的 芦笋嫩茎段若干，按每个上述装有增殖培养基溶液并经灭菌处理后的带盖的增殖培养瓶中 以平放且腋芽向上的方式置入25个该芦笋嫩茎段，共置入500个芦笋嫩茎段，然后将其放 置在温度为27°C 士 1°C的培养室中，在光照强度为3000Lx左右下光照14小时和黑暗10小 时，交替进行培养26天，即可繁殖出足够的嫩茎，得嫩茎种，即第三代芦笋。经检验，接种的 500个茎段全部分化出新茎，增殖成功率为100%，共分化出有效嫩茎数为1560个，平均出 茎数3. 12个。可利用进行下一步培养的良好腋芽个数达5000个。经此培养过程后，由500 个芦笋茎段(每个茎段上具有一个良好腋芽)增殖培养出5000个有效腋芽，其增殖培养率 达 1000% Bp 1 10。第三步生根预分化，主要是将第三代芦笋诱导出尽可能多的带白根的嫩茎种。配 制预分化培养基溶液量取经上述的配制步骤配制的基本培养基溶液1000ml，并按0. Img/ L的标准加入萘乙酸(NAA)O. lmg、按0. 5mg/L的标准加入吲哚丁酸(IBA)O. 5mg、按0. Img/ L的标准加入激动素(KT)O. lmg、按1. 5mg/L的标准加入嘧啶醇(ancymidol)0. 15mg，充分 搅拌，混合均勻，即配制成预分化培养基溶液，待用。然后，进行预分化培养基溶液灭菌处 理取上述的配制好的预分化培养基溶液，按每25ml的预分化培养基溶液装入一 300ml带 盖的预分化培养瓶中的要求，分别装入40个300ml的预分化培养瓶中，在0. 105Mp大气压 和121°C 士 1°C的条件下进行20分钟的灭菌处理，取出晾凉，备用。生根预分化培养在超 净工作平台上将第二步已培养好的嫩茎(第三代)从增殖培养瓶中取出，切成0.5厘米长 的带有单个腋芽的嫩茎种段若干。按每个装有上述预分化培养基溶液并经灭菌处理后的预 分化培养瓶中以平放且腋芽向上的方式置入20个该嫩茎种段，共接种800个嫩茎段。将已 接种了嫩茎段的预分化培养瓶放置在温度为27°C 士 1°C的培养室中，在光照强度为3000LX 左右下光照14小时和黑暗中10小时，交替进行培养20天左右，即可在嫩茎种段上的腋芽 与茎的结合部位生出粗壮的白根。其中，长出白根的嫩茎段数为798个，成功率接近100%， 根系粗壮优质的为775个，占96. 9%。第四步生根培养，主要是促进已经分化出白根的嫩茎种段迅速生长成可以 移栽的芦笋苗。配制生根培养基溶液量取经上述的配制步骤配制的基本培养基溶 液5000ml，并按0. 2mg/L的标准加入萘乙酸(NAA) lmg、按1. 5mg/L的标准加入嘧啶醇 (anCymidol)7.5mg、充分搅拌，混合均勻，即配制成生根培养基溶液，待用。然后，进行生根 培养基溶液灭菌处理上述的配制好的生根培养基溶液，以每个3X20cm的生根培养基溶液试管中装入25ml生根培养基溶液，分别装入200个生根试管中，在0. 105Mp大气压和 121°C 士 1°C的条件下进行20分钟的灭菌处理，取出晾凉，备用。已预分化生根嫩茎种段的 生根培养在超净工作平台上将第三步已培养好的带白根的优质嫩茎段从预分化培养瓶中 取出200个，以每只试管接种一个生根嫩茎段且根系朝下地直接接种在上述的生根培养基 溶液试管中。将接种的生根培养基溶液试管放置培养室中，在温度为27°C 士 1°C、光照强度 为3000Lx左右下光照16小时，在温度为22°C 士 1°C下黑暗8小时，交替进行培养30天，将 在嫩茎种段上长出3根嫩茎和3条粗壮的肉质根，即培养出可达移栽标准的一株芦笋苗，第 四代芦笋。其中，达移栽标准的芦笋苗为198株，均具有强大粗壮的肉质根，成功率为99%。由上述第一步和第二步可知，经诱导培养和增殖培养后单个腋芽的芦笋茎段可培 养出12*10个良好腋芽，可用于第三步和第四步的培养。由上述的第三步和第四步可知，经 第一步和第二步培养后芦笋茎在生根和成苗率都在95%以上，接近于百分之百，根系质量 较高，从而保证了移栽成活率。实施例二 (本实施例中没有陈述部分均同实施例一) 本发明的芦笋亲本组织繁殖方法，本发明的芦笋亲本繁殖方法，是通过选取优质 芦笋并切成带有一个发育良好腋芽的茎段，再经消毒、冲洗预处理后，在培养基溶液中进行 培养，繁殖出可达移栽标准芦笋苗的过程。基本培养基溶液的组分和配制该基本培养基溶液组分如下每升基本培养基溶液溶液中含NH4NO3 1400mg、 KNO3 2000mg、CaCl2 · 2H20 600mg、MgSO4 · 7H20250mg、KH2PO4 260mg、KI 1. 2mg、H3BO3 5mg、 MnSO4 ·4Η20 15mg、ZnSO4 ·7Η20 10mg、Na2MoO4 ·2H20 0. 4mg、CuSO4 ·5H20 0. 04mg、CoCl2 ·6Η20 0. 04mg,Na2EDTA 25mg、FeS04 ·7Η20 40mg、VB10. 5mg、VB6 0. 6mg、甘氨酸 3mg、烟酸 0. 7mg、肌 醇120mg、琼脂7g、蔗糖40g ；上述组分经配制得其本培养基溶液，用精密试纸测试其Ph值 为6. 3，再用滴管滴入0. IM的HCl溶液至Ph值到6.0 士 0. 1。该预处理过程如下从田间取回无病虫危害的芦笋嫩茎50根，用清水冲洗干净， 切成1厘米长的茎段200个，并保证每个茎段上有一个发育好的腋芽；再将上述的茎段放入 70%酒精溶液中浸泡15 20秒，然后放入15%的次氯酸钠溶液中，浸泡15分钟取出，用无 菌水冲洗3遍，即得接种用芦笋茎段200个(第一代)。本发明中的培养依次为诱导培养、增殖培养、生根预分化培养、生根培养，其具体 步骤如下第一步、诱导培养上述芦笋茎段置入诱导培养基溶液中，在光照和黑暗条件下交 替培养30天左右，得芦笋嫩茎(第二代)；包括有诱导培养基溶液的配制、诱导培养基溶 液的装瓶及灭菌、消毒好的芦笋茎段置入诱导培养瓶中培养；诱导培养基溶液的配制量 取由上述组分配制而成的基本培养基溶液1000ml，并按0. 15mg/L的标准加入萘乙酸激素 0. 15mg、按0. 4mg/L的标准加入6-苄基腺嘌呤激素0. 4mg，充分搅拌，混合均勻，得诱导培养 基溶液IOOOml ；经诱导培养基溶液的装瓶及灭菌，分别装入40个诱导培养瓶中。再经29天 培养，得芦笋嫩茎。其中38个芦笋茎段长出3根嫩茎，103个芦笋茎段长出4根嫩茎，59个 芦笋茎段长出5根嫩茎，每个芦笋茎段长出嫩茎平均数多于4根，诱导培养成功率为100 %。 能进行下一步培养的有效腋芽数达2400个，其繁殖率达1 12。第二步、增殖培养上述芦笋嫩茎切成芦笋嫩茎段并置入增殖培养基溶液中，在光照和黑暗条件下交替培养25天左右，得到大量的增殖嫩茎；它包括有增殖培养基溶液的配 制、增殖培养基溶液的装瓶及灭菌、芦笋嫩茎切成嫩茎段并置入增殖培养瓶中培养；增殖培 养基溶液的配制量取由上述组分配制而成的基本培养基溶液1000ml，并按0. 15mg/L的标 准加入萘乙酸激素0. 15mg、按0. 25mg/L的标准加入激动素0. 25mg，充分搅拌，混合均勻，得 增殖培养基溶液IOOOml ；经装瓶及灭菌，得增殖培养瓶40个；由第二步所得的芦笋嫩茎取 出，切成带有腋芽的1厘米左右长的芦笋嫩茎段，取芦笋嫩茎段1000个，在光照和黑暗条件 下交替培养26天后，得芦笋嫩茎种。经检查，繁殖培养成功率在98%，其中，平均每个芦笋 嫩茎段繁殖出3或4根新嫩茎，每根新嫩茎上具有可进行下一步培养的有效腋芽 数在2 4个，其繁殖率在1 10以下。第三步、生根预分化培养上述的嫩茎种置入在装有预分化培养基溶液的培养瓶 中，在光照和黑暗条件下交替培养20天左右，得带白根嫩茎种；它包括有预分化培养基溶 液的配制、预分化培养基溶液的装瓶及灭菌、嫩茎种接种于预分化培养瓶中培养；预分化培 养基溶液的配制量取由上述组分配制而成的基本培养基溶液200ml，并按0. 08mg/L的标 准加入萘乙酸激素0. 016mg、按0. 4mg/L的标准加入吲哚丁酸激素0. 08mg、按0. 06mg/L的 标准加入激动素0. 012mg、按1. 2mg/L的标准加入嘧啶醇激素0. 24mg,充分搅拌，混合均勻， 得预分化培养基溶液200ml ；经装瓶及灭菌，得预分化培养瓶8个；取第三步已培养好的嫩 茎种切成0. 5厘米左右长的带有单个腋芽的嫩茎种段200个，再将其置入在预分化培养瓶 中，在光照下和黑暗中交替进行培养21天，得带白根嫩茎种192个，其根系分化率为96%。第四步、生根培养上述的带根嫩茎接种在生根培养基溶液中，在光照和黑暗条件 下交替培养30天左右，得芦笋苗；它包括有生根培养基溶液的配制、生根培养基溶液的装 管及灭菌、带白根嫩茎种接种于生根培养管中培养；生根培养基溶液的配制量取由上述 组分配制而成的基本培养基溶液4800ml，并按0. 15mg/L的标准加入萘乙酸激素0. 72mg、按 1. Omg/L的标准加入嘧啶醇激素4. 8mg,充分搅拌，混合均勻，得生根培养基溶液4800ml ；经 生根培养基溶液的装管及灭菌，得生根培养管192个；再将第四步所得的带根嫩茎种192个 分别接种在192个生根培养管中，然后在培养室中，在光照下和黑暗中交替进行培养30天， 其中，达移栽标准的芦笋苗为186株，均具有强大粗壮的肉质根，成功率为97%。由上述的步骤可知，诱导培养和增殖培养的繁殖率均1 10以上，生根预分化成 功率达到96%，生根培养的成功率达到97%。经上述步骤所得的芦笋苗移栽于田间，生长稳定，成活高达96 %。
权利要求
该芦笋亲本繁殖方法，是通过选取优质芦笋并切成带有一个发育良好腋芽的芦笋茎段，再经消毒、冲洗预处理后，在培养基溶液中进行培养，繁殖出可达移栽标准芦笋苗的过程，其特征在于该培养基溶液是在基本培养基溶液的基础上相对各培养阶段添加相应的激素配制而成的，该基本培养基溶液组分如下每升基本培养基溶液中含NH4NO3 1400～1800mg、KNO3 1800～2000mg、CaCl2·2H2O300～600mg、MgSO4·7H2O 250～490mg、KH2PO4 80～260mg、KI 0.5～1.2mg、H3BO3 5～7.4mg、MnSO4·4H2O 15～29mg、ZnSO4·7H2O 7～10mg、Na2MoO4·2H2O 0.1～0.4mg、CuSO4·5H2O 0.015～0.04mg、CoCl2·6H2O 0.015～0.04mg、Na2EDTA 25～50mg、FeSO4·7H2O 15～40mg、VB1 0.3～0.5mg、VB6 0.4～0.6mg、甘氨酸1～3mg、烟酸0.3～0.7mg、肌醇80～120mg、琼脂3～7g、蔗糖20～40g；上述的培养依次为诱导培养、增殖培养、生根预分化培养、生根培养，其具体步骤如下第一步、诱导培养将经预处理后的芦笋茎段置入灭菌处理后的诱导培养基溶液中，放入温度为27℃±1℃的培养室，在光照和黑暗条件下交替培养30天左右，从芦笋茎段的腋芽处培养出3～5根嫩茎，得芦笋嫩茎；所述的诱导培养基溶液是通过以下方式配制的量取由上述组分配制而成的基本培养基溶液一定量，并按0.1～0.3mg/L的标准加入萘乙酸激素、按0.4～0.6mg/L的标准加入6—苄基腺嘌呤激素，充分搅拌，混合均匀，得诱导培养基溶液；第二步、增殖培养将第一步所得的芦笋嫩茎切成带有一个腋芽的芦笋嫩茎段并置入灭菌处理后的增殖培养基溶液中，放入温度为27℃±1℃的培养室，在光照和黑暗条件下交替培养25天左右，从芦笋嫩茎段的腋芽处增殖培养出3～5根嫩茎，得嫩茎种；所述的增殖培养基溶液是通过以下方式配制的量取由上述组分配制而成的基本培养基溶液一定量，并按0.1～0.3mg/L的标准加入萘乙酸激素、按0.2～0.4mg/L的标准加入激动素，充分搅拌，混合均匀，得增殖培养基溶液；第三步、生根预分化培养将第二步所得的嫩茎种切成带有一个腋芽的嫩茎种段，并置入在灭菌处理后的预分化培养基溶液中，放入温度为27℃±1℃的培养室，在光照和黑暗条件下交替培养20天左右，在该嫩茎种段的腋芽与茎的结合部位处分化生长出粗壮的白根，得带根嫩茎种；所述的预分化培养基溶液是通过以下方式配制的量取由上述组分配制而成的基本培养基溶液一定量，并按0.05～0.15mg/L的标准加入萘乙酸激素、按0.4～0.6mg/L的标准加入吲哚丁酸激素、按0.05～0.15mg/L的标准加入激动素、按1.0～2.0mg/L的标准加入嘧啶醇激素，充分搅拌，混合均匀，得预分化培养基溶液；第四步、生根培养将第三步所得的带根嫩茎种接种在灭菌处理后的生根培养基溶液中，并放入温度为27℃±1℃的培养室中，在光照强度为3000Lx左右下光照16小时和在黑暗中放置8小时，交替培养30天左右，该嫩茎种的腋芽将培养成3根左右的嫩茎，在腋芽与茎的结合部位培养出3条左右的粗壮的肉质根，达到移栽标准，得芦笋苗；所述的生根培养基溶液是通过以下方式配制的量取由上述组分配制而成的基本培养基溶液一定量，并按0.1～0.3mg/L的标准加入萘乙酸激素、按1.0～2.0mg/L的标准加入嘧啶醇激素，充分搅拌，混合均匀，得生根培养基溶液；上述各步骤中的灭菌处理是在0.105Mp大气压和121℃±1℃的条件下进行20分钟的灭菌过程；上述第一至第三步骤中的光照和黑暗条件下交替培养是指在光照强度为3000Lx左右下光照14小时和在黑暗中放置10小时。
2.根据权利要求1所述的繁殖方法，其特征在于上述基本培养基溶液的组分如下 每升溶液中含 NH4NO3 1650mg、KN03 1 900mg、CaCl2 · 2H20 440mg、MgSO4 · 7H2O 370mg、KH2PO4 170mg、KI 0. 83mg、H3BO3 6. 2mg、MnSO4 · 4H20 22. 3mg、ZnSO4 · 7H20 8. 6mg、Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg、CuSO4 ·5Η20 0. 025mg、CoCl2 · 6H20 0. 025mg、Na2EDTA 37. 3mg、FeSO4 · 7H20 27. 8mg、 VBl 0. 4mg、VB6 0. 5mg、甘氨酸 2. Omg、烟酸 0. 5mg、肌醇 lOOmg、琼脂 5g、蔗糖 30g。
3.根据权利要求1或2所述的繁殖方法，其特征在于上述基本培养基溶液的Ph值为 6. O 士 0. 1，是通过0. IM的NaOH溶液或0. IM的HCl溶液进行调整的。
4.根据权利要求3所述的繁殖方法，其特征在于上述预处理包括芦笋茎的选取，切 段，浸泡消毒及冲洗；其浸泡消毒是依次在70%酒精溶液中浸泡15 20秒，15%的次氯酸 钠溶液中浸泡15分钟。
5.根据权利要求3所述的繁殖方法，其特征在于上述的置入是采用腋芽朝上平放的 方式；上述的接种是采用根系朝下的方式。
全文摘要
本发明为芦笋亲本繁殖方法，主要解决在芦笋器官组织培养过程中，所遇到的生根率低、根系质量差、移栽成活率低等问题。它是通过选取优质芦笋笋茎段，在培养基溶液中进行培养，繁殖出可达移栽标准芦笋苗的过程。该培养基溶液是在基本培养基溶液的基础上相对各培养阶段添加相应的激素配制而成的，该培养依次为诱导培养、增殖培养、生根预分化培养、生根培养。本发明与目前的器官培养相比，其繁殖率高，生根率达100％，根系质量好，其中强大粗壮肉质根的分化率提高到96％，从而保证了移栽后的成活率。
文档编号A01H4/00GK101843220SQ20101016931
公开日2010年9月29日 申请日期2010年5月12日 优先权日2010年5月12日
发明者叶劲松, 尹俊玉, 赵卫星 申请人:北京先农科芦笋研发中心;北京农科院种业科技有限公司