专利名称：小麦幼胚培养结合标记选择快速转育抗赤霉病主效qtl的方法
技术领域：
本发明涉及一种小麦幼胚培养结合标记选择快速转育抗赤霉病主效QTL的方法， 将植物幼胚培养与分子标记结合在小麦抗赤霉病育种中的应用。
背景技术：
小赤霉病是危害小麦高产、稳产的主要致病菌之一。80年代后期以来，由于全球气 候变化和耕作制度的影响，小麦赤霉病在欧洲、美国、加拿大、中国、南美等地频繁发生，对 小麦产量和品质造成了严重的损失，为此人们对小麦赤霉病已经进行了广泛深入的研究， 并取得了显著的成就。我国是全球小麦赤霉病受害面积最大的国家，长江中下游和华南冬 麦区及东北春麦区东部尤为严重，每年小麦赤霉病的发生面积已超过700万hm2，约占全国 小麦总面积的1/4。因此，长江中下游麦区创制抗赤霉病的种质、培育抗病小麦新品种是克 服赤霉病危害的根本途径。但是由于禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)在小麦开花期侵染麦穗，它的侵 染和扩展取决于当地、当时的天气情况即温度和湿度等天气因素(陆维忠等2000)，这对 育种家依靠表型进行抗赤性的选择带来困难。此外，小麦赤霉病是由多基因控制的数量 性状(张勇等，2005)，抗性鉴定过程易受环境影响且费时费力。分子标记辅助选择(MAS， marker-assisted selection)给育种材料中变异的选择提供了崭新的途径，分子标记是建 立在DNA基础上的一种遗传学标记它具有不受环境影响，在作物任何发育阶段以及任何器 官、组织中都可以进行检测的优点，这样就可以实现间接地对目标性状进行苗期鉴定和早 代选择，从而使目的基因的鉴定结果更加准确可靠。不仅提高了性状选择的准确性，而且加 快了性状鉴定的速度，从而达到了提高育种效率的目的(Dudley等，1993 ；Lee等，1995)。除了分子标记辅助选择在育种中的应用外，传统育种技术还是存在育种周期偏 长，育种效率不够理想等问题。尽管异地加代可以实现一年2-3代，但试验费用较高，因 此探索将育种周期缩短、加速小麦新种质的培育研究便显得十分必要和迫切(王海波等， 2003)。加快小麦育种的速度，首先必须加快小麦整个生长期的发育速度，然而现有的小麦 幼胚培养技术仍然主要用于远缘杂交胚挽救或以幼胚为外植体诱导愈伤组织植株再生和 转基因方面的研究(王海波等，2006)，对南方夏季高温多湿的条件下如何通过幼胚培养与 抗赤霉病育种的MAS回交育种相结合，实现抗赤霉病基因快速转育的研究却很少。研究表明，在抗赤霉病小麦品种或品系的3BS染色体上带有主效抗病QTL (周淼平 等，2003 ；Zhang等2004)，Xgwn493、Xgwm533为与其紧密连锁的SSR分子标记(Bai等，2002 ； 2003 ；陆维忠，2000)。近年来我们利用分子标记辅助选择在赤霉病抗性改良上已经取得初 步成效，相继育成了多个抗赤性较好的新品种。但由于回交策略中必须在高世代才能获得 背景与轮回亲本一致的抗性材料，需要采用适当方法缩短回交周期以尽早获得丰产性好并 携带抗性QTL染色体片段的丰产抗病种质。因此，如何将小麦幼胚培养与分子标记相结合 应用于回交育种策略可望缩短回交育种期限，建立高效抗赤霉病基因转育育种程序，尽快获得带有目的基因(QTL)的回交材料，一直是本领域密切关注的热点。目前，通过小麦幼胚培养与分子标记相结合技术，将抗赤霉病小麦品种或品系中 抗赤霉病主效QTL转育到农艺性状优良但感赤霉病小麦品种或品系中的方法，并未见报道。
发明内容
本发明的目的在于针对目前应用分子标记技术将抗赤霉病主效QTL转育到抗赤 霉病差，但其他综合性状优良的品种中的育种周期过长的实际问题，提供一种新的小麦幼 胚培养结合标记选择快速转育抗赤霉病主效QTL的方法。本发明的目的是这样实现的一种小麦幼胚培养结合标记选择快速转育抗赤霉病 主效QTL的方法，其特征在于包括抗赤霉病回交转育、幼胚壮苗培养、标记辅助选择、快速 成苗技术相结合的快速转育抗赤霉病主效QTL，具体步骤如下a)以农艺性状优良但感赤霉病小麦品种或品系为受体亲本，以抗赤霉病小麦品种 或品系为抗源父本，受体亲本抽穗期去雄与抗源父本杂交后剥取幼胚；b)4°C下春花培养7d后转移到昼/夜25V /15°C光照培养成苗，成苗5d后，移栽 到昼/夜28°C /15°C温室中生长，同时取半张叶片提取DNA，以SSR引物Xgwn493、Xgwm533 为标记对DNA样品进行PCR检测，留取含有标记的植株继续生长；c)植株抽穗期去雄与回交亲本进行杂交，所述的回交亲本为感赤霉病小麦品种受 体亲本；d)授粉后12d，在实验室无菌操作下剥取幼胚；e)按照b至d步骤轮回重复4 5次，最后一次轮回重复在b步骤结束后直接进入f;f)扬花期自交，选育具有抗赤霉病主效QTL且农艺性状优良的新种质。在本发明中所述的剥取幼胚是指花后12d的仔粒经75%酒精消毒30s和0. 1% 升汞消毒10 15min，无菌水洗3次；在无菌条件下将幼胚剥出；所述的春化培养是指将 幼胚尖端向下在添加0. 3%麦芽提取物的1/2MS培养基中4°C培养7天。在本发明中成苗5d后，移栽到昼/夜28°C/15°C温室中生长是指成苗5d后，将 幼胚苗移栽到营养土中，遮荫2 3d，缓苗后在昼夜温度28°C /18°C温室中培养，拔节期叶 面喷每隔5d喷一次0.3%磷酸二氢钾，连续喷施二次；所述的营养土由大田土、泥炭土和珍 珠岩按照631的体积比混合而成。在本发明中所述的农艺性状优良但感赤霉病小麦品种或品系为扬麦15号或扬 麦13或淮麦18 ；抗赤霉病小麦品种或品系为苏麦3号或宁894037或宁7840。本发明的优点在于通过将小麦幼胚培养与分子标记相结合，建立了一种抗赤霉 病转育、轮回重复幼胚壮苗培养、幼苗移栽快育、分子标记辅助选择，在感性赤霉病小麦品 种或品系中快速转育抗赤霉病主效QTL，大大缩短了培育周期，有效地提高小麦新种质选育 效率。
具体实施例方式实施例1
1、受体亲本和轮回亲本优质弱筋小麦扬麦152、抗源父本抗赤霉病小麦品种苏麦3号3、培养基采用l/2MS(pH 5.8)固体培养基中添加0. 3 %麦芽提取物(malt extract)。4、营养土 大田土、泥炭土、珍珠岩以6 3 1的体积比混合均勻。5、引物的设计与合成Qfhs. ndsu. 3BS 引物 Xgwn493、Xgwm533 序列参见R0der等(1998)发表，由上海生
工公司合成。6、叶片DNA提取剪取各幼胚苗半张叶片，放入研钵中加入液氮后磨成粉末，分装到 1. 5mlenpperdof管中，加入0. 6ml 65°C预热的CTAB提取液，65°C水浴60min。样品取出 后，置于室温，加入等体积的氯仿异戊醇(24 1)混合液，小心翻转后，IOOOOrpm离心 IOmin (25°C )。离心后上清液转入另一含有0. 6体积的预冷的异戊醇的enpperdof管中，轻 轻摇动至DNA沉淀析出，静置后钩出DNA沉淀。加入0. 7ml70%乙醇洗涤3次，倾去上清， 将DNA贴壁晾干。加入适量的TE缓冲液，溶解DNA沉淀。加入3_5ulRNase (5mg/ml)，37°C 水浴60min。加入等体积的氯仿异戊醇(24 1)，轻摇，12000rpm离心lOmin。上清液转 入另一含有2倍体积(800ul)的无水乙醇和1/10体积(40ul)的3M NaAc的enpperdof管 中，缓慢翻转，混勻，-20°C静置2h后，钩出DNA沉淀，加入0. 7ml 70%乙醇洗涤3_5次，将 DNA贴壁晾干。加入适量的TE缓冲液，溶解DNA沉淀。对DNA进行0. 8%的琼脂糖电泳，确 定DNA质量与浓度。7、琼脂糖电泳检测DNA提取后，采用0. 8%的琼脂糖电泳，确定DNA的质量和浓度。8、分子标记电泳检测PCR 反应在 PTC-100TM Programmable Thermal Controller (MJ Research, INC.) 上进行，反应体积为20 μ 1。反应混合液包括1 Xbuffer，1. 5mmol/L MgC12,2. Ommol/ L dNTPs，250ymol/L 引物，50-100ng 模板 DNA，1U Taq 酶。反应程序为94 °C，5min ； 94°C 45sec，55-60°C，45sec，72°C，45sec，40 个循环；72°C, IOmin0 4°C保存。扩增产物经 6 %聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色成像。具体过程田间以受体亲本(母本)抽穗期去雄与抗源父本杂交，2007年4月10日田间授 粉，4月22日(花后12d)剥取幼胚培养。取幼胚的方法是刚抽穗的仔粒经75%酒精消毒 30s和0. 升汞消毒10 15min，无菌水洗3次；在无菌条件下将幼胚剥出(取幼胚的方 法下同)。第一代4月22日取幼胚培养，4月26日春化处理(将幼胚尖端向下在添加0. 3% 麦芽提取物的1/2MS培养基中4°C培养7天，下同)，成苗5d后，将幼胚苗移栽到营养土中， 遮荫2 3d，缓苗后在昼夜温度28°C/18°C温室中培养，5月10日移栽，并取半张叶片提取 DNA,以SSR引物Xgwn493、Xgwm533为标记对DNA样品进行PCR检测，留取含有标记的植株 继续生长，拔节期叶面喷每隔5d喷一次0.3%磷酸二氢钾，连续喷施二次，6月15日扬花，6 月28日取12d幼胚培养。(生育期67d)(第二代到第五代部分过程相同，仅以时间为线索简述)第二代2007年6月28日胚培养，7月1日春化处理，7月16日移栽(分子标记检测)，9月1日扬花抽穗期去雄与回交亲本回交，9月14日取幼胚(生育期78d)。第三代2007年9月14日胚培养，9月18日春化，10月2日移栽于大棚(分子标 记检测)，11月8日扬花抽穗期去雄与回交亲本回交，11月23日可以取幼胚培养(生育期 71d)，第四代2007年11月23日胚培养，11月27日春化，12月12日移栽温室(分子 标记检测)，2008年2月24日扬花抽穗期去雄与回交亲本回交，3月8日取12d幼胚(生育 期103d)。由于冬季温室加温条件较差，生育期延长。第五代2008年3月8日胚培养，3月11日春化，3月25日移栽于大棚营养钵(分 子标记检测)，4月27日扬花自交，6月1日收获种子(生育期84d)，秋季播种到大田筛选、鉴定。2009年4月25日对移栽到田间的具有标记的后代进行赤霉病抗性鉴定，在87个 BC4F2后代株系中检测到具有来自抗性亲本Xgwm 493等位位点的株系21个，抗性标记检 出率24. 1% ；具有抗性亲本Xgwm533标记的株系16个，抗性标记检出率18. 4% ；同时具有 两种标记的株系12个，标记检出率13. 8%，对检测出具有标记的株系进行赤霉病接种鉴定 表明，同时含有Xgwm493、Xgwm533标记的株系中抗到高抗赤霉病植株比例达到75% ；含有 Xgwm533标记的株系中抗赤霉病株系占68. 7%，其次是含有Xgwm493的株系中有14个抗赤 霉病达中抗以上水平，标记筛选的有效率达到66. 7% ；可见在小麦赤霉病抗性主效QTL转 育中采用分子标记辅助选择结合幼胚培养是高效的。以上实施例不是对本发明的具体限制，本领域的普通技术人员结合依据本发明公 开方法，选择不同的受体亲本、轮回亲本和抗源父本，均落入本发明的保护范围。
权利要求
一种小麦幼胚培养结合标记选择快速转育抗赤霉病主效QTL的方法，其特征在于包括抗赤霉病回交转育、幼胚壮苗培养、标记辅助选择、快速成苗技术相结合的快速转育抗赤霉病主效QTL，具体步骤如下a)以农艺性状优良但感赤霉病小麦品种或品系为受体亲本，以抗赤霉病小麦品种或品系为抗源父本，受体亲本抽穗期去雄与抗源父本杂交后剥取幼胚；b)4℃下春花培养7d后转移到昼/夜25℃/15℃光照培养成苗，成苗5d后，移栽到昼/夜28℃/15℃温室中生长，同时取半张叶片提取DNA，以SSR引物Xgwn493、Xgwm533为标记对DNA样品进行PCR检测，留取含有标记的植株继续生长；c)植株抽穗期去雄与回交亲本进行杂交，所述的回交亲本为感赤霉病小麦品种受体亲本；d)授粉后12d，在实验室无菌操作下剥取幼胚；e)按照b至d步骤轮回重复4～5次，最后一次轮回重复在b步骤结束后直接进入f；f)扬花期自交，选育具有抗赤霉病主效QTL且农艺性状优良的新种质。
2.根据权利要求1所述的小麦幼胚培养结合标记选择快速转育抗赤霉病主效QTL的方 法，其特征在于所述的剥取幼胚是指花后12d的仔粒经75%酒精消毒30s和0. 升汞 消毒10 15min，无菌水洗3次；在无菌条件下将幼胚剥出；所述的春化培养是指将幼胚 尖端向下在添加0. 3%麦芽提取物的1/2MS培养基中4°C培养7天。
3.根据权利要求2所述的小麦幼胚培养结合标记选择快速转育抗赤霉病主效QTL的方 法，其特征在于成苗5d后，移栽到昼/夜28°C /15°C温室中生长是指成苗5d后，将幼胚 苗移栽到营养土中，遮荫2 3d，缓苗后在昼夜温度28°C /18°C温室中培养，拔节期叶面喷 每隔5d喷一次0.3%磷酸二氢钾，连续喷施二次；所述的营养土由大田土、泥炭土和珍珠岩 按照631的体积比混合而成。
4.根据权利要求1 3之一所述的小麦幼胚培养结合标记选择快速转育抗赤霉病主 效QTL的方法，其特征在于所述的农艺性状优良但感赤霉病小麦品种或品系为扬麦15号 或扬麦13或淮麦18 ；抗赤霉病小麦品种或品系为苏麦3号或宁894037或宁7840。
全文摘要
本发明涉及一种小麦幼胚培养结合标记选择快速转育抗赤霉病主效QTL的方法，其特征在于包括抗赤霉病回交转育、幼胚壮苗培养、标记辅助选择、快速成苗技术相结合的快速转育抗赤霉病主效QTL，它以农艺性状优良但感赤霉病小麦品种或品系为受体亲本，以抗赤霉病小麦品种或品系为抗源父本，受体亲本抽穗期去雄与抗源父本杂交后剥取幼胚；将幼胚培养成苗后提取叶片提取DNA，以SSR引物Xgwn493、Xgwm533为标记对DNA样品进行PCR检测，留取含有标记的植株继续生长，再剥取幼胚，采用相同的方法经过多轮回交，最后自交，获得转育抗赤霉病主效QTL的新种质。其优点是培育周期短，新种质选育效率高。
文档编号A01H4/00GK101828521SQ201010175150
公开日2010年9月15日 申请日期2010年5月18日 优先权日2010年5月18日
发明者任丽娟, 余桂红, 姚金保, 张平平, 张旭, 张鹏, 马鸿翔 申请人:江苏省农业科学院