专利名称：一种猪精液冷冻保存方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，具体是一种猪精液冷冻方法。
背景技术：
国内也有一些单位研究和优化猪精液冷冻保存方法，例如西北农林科技大学、浙江大学等，我们研制的方法与他们不同，本发明进一步丰富了猪精液冷冻保存的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种猪精液冷冻保存方法。本发明解决上述技术问题的技术方案如下一种猪精液冷冻保存方法，精液样品要求新鲜精液活力> 0. 7，冷冻方法按以下操 作步骤进行1.猪精液冷冻稀释液配方与稀释液的配制1. 1猪精液冷冻稀释液配方稀释液分为常温稀释液和冷冻稀释液1. 1. 1常温稀释液配方常温稀释液由葡萄糖32. 0g/L;TES 12. Og/L ；Tris 2. Og/L ；KCl 0. 8g/ L ；EDTA-Na2 1. 5g/L ；甘氨酸 5. Og/L ；青霉素(Penicillin G) 10000IU/L,硫酸链霉 (Streptomycin sulfate)0. 05g/Lo1.1. 2冷冻稀释液配方在常温稀释液的基础上加卵黄20% (ν/ν)、甘油6% (ν/ν)即为冷冻稀释液。1.2.稀释液的配制1. 2. 1常温稀释液的配制准确称量所需药品至事先经过灭菌过的圆底烧瓶中，并用封口膜封好瓶口，置于 4°C冰箱中待用。1. 2. 2冷冻稀释液的配制新鲜鸡蛋1 2只，先用75%的酒精消毒鸡蛋表面、镊子及手，待酒精干后用消毒 好的镊子轻轻敲开鸡蛋大头(气室)面，去掉蛋清，用IOml —次性注射器去掉针头抽取所 需卵黄量，置于事先消毒好的离心管中，然后放到离心机中离心去除卵黄颗粒。如需配冷冻 稀释液IOml时，取常温稀释液7. 4ml，卵黄上清2ml，甘油0. 6ml混勻即为冷冻稀释液，冷冻 稀释液为现配现用。2.精液稀释2.1常温稀释液的稀释在猪精液一经采出来后，马上用常温稀释液1 1稀释，然后快速将精液运送回实 验室，一般要求尽快把精液送回实验室。2. 2冷冻稀释液的稀释
当精液送回实验室后离心去除1/2上清，其沉淀物用II液1 1稀释后，检查活 力，如精液活力> 0. 7即可进行精液预冷平衡。3.精液预冷平衡把稀释好的精液用4 6层纱布包裹后放置4°C冰箱中平衡4h。4.精液的滴冻 把液氮倒到一个泡沫箱中，在液氮上方5cm高处放置一个铝盘，铝盘要预冷 IOmin0把平衡好的精液按0. 25ml/滴滴在铝盘上，盖上泡沫箱盖，IOmin后把颗粒铲进液氮 中。5.精液解冻和冻后活力检查从液氮中抽取1 2颗精液放进离心管或玻璃小瓶中，置于50°C的水中进行解冻， 解冻标准为精液刚好溶解1/2即可，放置37°C恒温箱中5min，然后精子图像计算机辅助分 析仪(CASA)进行活力的检查，重复检查两次结果取平均值。本发明的益效是本发明进一步丰富了猪精液冷冻保存的方法。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步描述。实施例一种猪精液冷冻方法，精液样品要求新鲜精液活力> 0. 7，冷冻方法按以下操作步 骤进行1.猪精液冷冻稀释液配方与稀释液的配制1. 1猪精液冷冻稀释液配方稀释液分为常温稀释液和冷冻稀释液1. 1. 1常温稀释液配方常温稀释液由葡萄糖32. Og/L ；TES 12. Og/L ；Tris 2. Og/L ；KCl 0. 8g/ L ；EDTA-Na2 1. 5g/L ；甘氨酸 5. Og/L ；青霉素(Penicillin G) 10000IU/L,硫酸链霉 (Streptomycin sulfate)0. 05g/Lo1. 1. 2冷冻稀释液配方在常温稀释液的基础上加卵黄20% (ν/ν)、甘油6% (ν/ν)即为冷冻稀释液。1. 2.稀释液的配制1. 2. 1常温稀释液的配制准确称量所需药品至事先经过灭菌过的圆底烧瓶中，并用封口膜封好瓶口，置于 4°C冰箱中待用。1. 2. 2冷冻稀释液的配制新鲜鸡蛋1 2只，先用75%的酒精消毒鸡蛋表面、镊子及手，待酒精干后用消毒 好的镊子轻轻敲开鸡蛋大头(气室)面，去掉蛋清，用IOml —次性注射器去掉针头抽取所 需卵黄量，置于事先消毒好的离心管中，然后放到离心机中离心去除卵黄颗粒。如需配冷冻 稀释液IOml时，取常温稀释液7. 4ml，卵黄上清2ml，甘油0. 6ml混勻即为冷冻稀释液，冷冻 稀释液为现配现用。2.精液稀释
2. 1常温稀释液的稀释在猪精液一经采出来后，马上用常温稀释液1 1稀释，然后快速将精液运送回实验室，一般要求尽快把精液送回实验室。2. 2冷冻稀释液的稀释当精液送回实验室后离心去除1/2上清，其沉淀物用II液1 1稀释后，检查活 力，如精液活力> 0. 7即可进行精液预冷平衡。3.精液预冷平衡把稀释好的精液用4 6层纱布包裹后放置4°C冰箱中平衡4h。4.精液的滴冻把液氮倒到一个泡沫箱中，在液氮上方5cm高处放置一个铝盘，铝盘要预冷 IOmin0把平衡好的精液按0. 25ml/滴滴在铝盘上，盖上泡沫箱盖，IOmin后把颗粒铲进液氮 中。5.精液解冻和冻后活力检查从液氮中抽取1 2颗精液放进离心管或玻璃小瓶中，置于50°C的水中进行解冻， 解冻标准为精液刚好溶解1/2即可，放置37°C恒温箱中5min，然后精子图像计算机辅助分 析仪(CASA)进行活力的检查，重复检查两次结果取平均值。6.精子的质膜完整性采用低渗肿胀实验(HOST)进行检测。取5yL解冻精液放入ImL低渗液中 (1.3512g果糖和0. 7352g 二水柠檬酸钠溶于IOOmL去离子水)混勻。孵育30min后，取 20 μ L精液滴在血细胞计数板上，在400 X相差显微镜下观察精子尾部情况，分析精子质膜 情况。7.精子的顶体完整性顶体完整率检查参照江一平等_报道的方法，用考马斯亮蓝R250染色液对解冻 精子进行染色，然后在1000Χ显微镜下检查精子畸形率和顶体完整率。每个处理制片2张， 每片记数200个以上的精子。8.精子的线粒体活性按JC-I试剂盒说明书操作。JC-I染液的配制(2. 5 μ 1 JC-I染料+100 μ L JC缓 冲液+400 μ L超纯水)/样本，避光放置。洗涤液的配制(400 μ L JC缓冲液+1600 μ L超纯 水)/样本。取8mL解冻精液加ImL PBS轻轻打勻，2000r/min离心6min，总共洗两次。然 后，加JC-I染液和PBS各0. 5mL，混勻后在37°C水浴锅中蔽光孵育30min。孵育后，再用配 制好的洗涤液洗两次(2000r/min离心6min)。400X荧光显微镜下观察。9.试验设计在冷冻稀释液基础上添加不同浓度(0，0.5g/L，lg/L，1.5g/L)的牛血清白蛋白 (BSA)作为试验组。然后根据解冻后，精子的活率、活力、质膜完整率、顶体完整率和线粒体 活性等指标来评定冻后精子的质量。10.统计分析对试验数据用SAS统计软件进行分析。把活率、活力、质膜完整率、顶体完整率和 线粒体活性的数据进行反正弦转换，再用一般线性模型下的Duncan’ s多重比较检验各组 之间差异的显著性。
结果与分析 试验重复6次。从表1的试验分析结果可知，添加不同浓度(0. 5g/L，lg/L，1. 5g/ L)的BSA与对照组相比，冻后精子的活率、活力、质膜完整率、顶体完整率和线粒体活性均 无显著差异(P >0.05)。但通过数据可以看出，0. 5g/L BSA组的冻后精子活力略高于对照 组及其他试验组；质膜完整率、顶体完整率和线粒体活性也要略高于其它各组。总体来说， 各个试验组与对照组相比均无显著差异(P > 0. 05)。表1不同浓度的BSA对猪精液冷冻效果的影响
BSA浓度(g/L) 活率(%)活力(%) 质膜完整率(%)
顶体完整率(%) 线粒体活性(%)
BSA concen.ViabilityMotility Membrane integrity 同一列数据上标不同字母表示差异显著(a、b :P < 0. 05)。Figures with different letters within columns differ significantly(a、 b :P < 0. 05).
权利要求
一种猪精液冷冻保存方法，其特征在于，精液样品要求新鲜精液活力≥0.7，冷冻方法按以下操作步骤进行1)猪精液冷冻稀释液配方与稀释液的配制1.1)猪精液冷冻稀释液配方稀释液分为常温稀释液和冷冻稀释液1.1.1)常温稀释液配方常温稀释液由葡萄糖32.0g/L；TES 12.0g/L；Tris 2.0g/L；KCl 0.8g/L；EDTA-Na2 1.5g/L；甘氨酸5.0g/L；青霉素(Penicillin G)10000IU/L，硫酸链霉(Streptomycin sulfate)0.05g/L；1.1.2)冷冻稀释液配方在常温稀释液的基础上加卵黄20％(v/v)、甘油6％(v/v)即为冷冻稀释液；1.2.)稀释液的配制1.2.1)常温稀释液的配制准确称量所需药品至事先经过灭菌过的圆底烧瓶中，并用封口膜封好瓶口，置于4℃冰箱中待用；1.2.2)冷冻稀释液的配制新鲜鸡蛋1～2只，先用75％的酒精消毒鸡蛋表面、镊子及手，待酒精干后用消毒好的镊子轻轻敲开鸡蛋大头(气室)面，去掉蛋清，用10ml一次性注射器去掉针头抽取所需卵黄量，置于事先消毒好的离心管中，然后放到离心机中离心去除卵黄颗粒。如需配冷冻稀释液10ml时，取常温稀释液7.4ml，卵黄上清2ml，甘油0.6ml混匀即为冷冻稀释液，冷冻稀释液为现配现用；2)精液稀释2.1)常温稀释液的稀释在猪精液一经采出来后，马上用常温稀释液1∶1稀释，然后快速将精液运送回实验室，一般要求尽快把精液送回实验室；2.2)冷冻稀释液的稀释当精液送回实验室后离心去除1/2上清，其沉淀物用II液1∶1稀释后，检查活力，如精液活力≥0.7即可进行精液预冷平衡；3)精液预冷平衡把稀释好的精液用4～6层纱布包裹后放置4℃冰箱中平衡4h；4)精液的滴冻把液氮倒到一个泡沫箱中，在液氮上方5cm高处放置一个铝盘，铝盘要预冷10min。把平衡好的精液按0.25ml/滴滴在铝盘上，盖上泡沫箱盖，10min后把颗粒铲进液氮中；5)精液解冻和冻后活力检查从液氮中抽取1～2颗精液放进离心管或玻璃小瓶中，置于50℃的水中进行解冻，解冻标准为精液刚好溶解1/2即可，放置37℃恒温箱中5min，然后精子图像计算机辅助分析仪(CASA)进行活力的检查，重复检查两次结果取平均值。
全文摘要
本发明公开了一种猪精液冷冻保存方法。该方法要求精液样品新鲜精液活力≥0.7，冷冻方法按以下操作步骤进行1)猪精液冷冻稀释液配方与稀释液的配制；2)精液稀释；3)精液预冷平衡；4)精液的滴冻；5)精液解冻和冻后活力检查。本发明的益效是本发明进一步丰富了猪精液冷冻保存的方法。
文档编号A01N1/02GK101869101SQ20101021615
公开日2010年10月27日 申请日期2010年7月2日 优先权日2010年7月2日
发明者卢克焕, 卢晟盛, 李林 申请人:广西大学