专利名称：一种香蕉吸芽茎尖接种的方法
技术领域：
本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及香蕉外植体接种并获得无菌材料的 方法，即香蕉吸芽茎尖接种的方法。
背景技术：
广义的香蕉包括了香蕉(Banana)和大蕉(Plantain)两大类，同属于芭蕉科 (Musaceae)芭蕉属(Musa)。香蕉栽培种(Musa sp.)属于单性三倍体(AAA，AAB，ABB)，具 有高度不育性。香蕉是世界重要的水果，也是我国岭南四大佳果之一。由于香蕉没有种子，所以传 统的繁殖方法是靠挖取吸芽种植，而吸芽种植会带来许多问题，如容易造成病害传播、种质 退化、生产管理困难等等。在二十世纪八十年代初，我国就开始了香蕉组织培养技术研究， 优质试管苗得到了极大的推广种植。到目前为止，香蕉主栽区基本全部都采用香蕉试管苗 种植，主要种植品种有巴西、威廉斯、广东2号、广粉1号、顺德中巴大蕉、新北蕉等。香蕉组织培养外植体主要有吸芽茎尖、花序轴和雄花分生组织等。以花序轴和雄 花分生组织作为外植体的培养方法通过诱导愈伤组织途径产生丛生芽，然后进行增殖培 养。这两种方法都经过植物组织细胞“脱分化——再分化”的过程，在此过程中容易引起基 因变化而产生较高的变异率。因此通过诱导愈伤组织途径产生丛生芽的方法不适宜用来繁 殖香蕉等经济作物种苗。而诱导吸芽茎尖直接产生不定丛芽的方法不经过“脱分化——再 分化”过程，对基因不会产生太大影响，在较低浓度6-BA浓度(2 2. Omg/L)下，继代次数 控制在12代以内的条件下，生产出来的试管苗变异率较低。因此目前香蕉试管苗工厂化生 产基本上都是采用吸芽茎尖直接诱导不定丛芽的方法。在香蕉吸芽茎尖接种方法上，传统的做法是先将选取的香蕉吸芽切成约5厘 米X3厘米X3厘米大小，然后在超净工作台上再小心地将茎尖切成1 2厘米大小，大约 用0. 1 %升汞溶液浸泡，进行表面消毒15 20分钟，再用无菌水冲洗3次，经削去消毒过的 表面组织，最后接种到诱导培养基上进行诱导培养。该方法存在几个缺点(1)不够环保一般采用的外植体表面消毒剂为升汞，是一 种剧毒物质，消毒完后的废弃液会造成环境污染。同时，残留有消毒剂会影响茎尖诱导培 养。(2)较繁琐、耗时在进行表面消毒前，需要将茎尖组织进行严格的切割，要切得表面十 分光滑，切割过程中必须要经常换消毒过的刀和镊子，操作繁琐，因此也十分的耗时。据观 察，比较熟练的人员一天也只能接种50 60个香蕉吸芽。(3)不够简易，很难获得较高的 接种成功率。该方法表面上看似乎很简单，但实际操作起来很难熟练掌握。采用该方法接 种香蕉外植体，一般人员的接种成功率50 60%，甚至更低，熟练人员能获得80 85%的 接种成功率已是非常不错。
发明内容
为克服上述技术缺陷，本发明的目的是提供一种香蕉吸芽茎尖接种的方法，该方
3法简便易行、高效、环保。为实现上述目的，本发明采用如下方案挑取无菌的茎尖接种到诱导培养基中进 行诱导培养，而所述无菌的茎尖是通过无菌剥离叶鞘操作而获得的。具体来说，是用经高温 消毒的手术刀小心地将香蕉吸芽叶鞘沿着其与球茎交界线环割，力度把握应该不使刀尖划 破该层叶鞘而碰到里面相邻一层的叶鞘，依次层层环剥，这样操作就不会将外面叶鞘的杂 菌带到里面的叶鞘；最后，把全部包住的叶鞘都剥离开，便可轻易挑取无菌的茎尖接种到诱 导培养基中进行诱导培养。以下对本发明作进一步的描述，具体方法步骤如下
1)、香蕉吸芽预处理。将取回的香蕉吸芽用刀小心切去球茎和假茎外层，切去多少组织要视香蕉吸芽大 小而定，经处理后的吸芽大小一般要求为球茎、假茎部分各长6 10厘米，底部直径大约 2 3厘米的圆柱体；比较小的吸芽经处理后为球茎、假茎部分各长2 3厘米，底部直径 约1厘米的圆柱体。切去吸芽多余部分时要注意几点①尽量避免将吸芽带的泥土弄脏切成的圆柱 体。②切的时候应该沿着叶鞘垂直向球茎从上往下切，不能向茎尖方向偏切，如果偏切太 深，切口太靠近茎尖，吸芽就不能用了。如果吸芽呈弯曲状，要把吸芽平放，侧向切去内弯部 分球茎，然后用手小心撕去叶鞘。③需要检测花叶心腐病的香蕉品种，切好的吸芽要做好分组。2)、吸芽茎尖无菌接种。首先用干布(或报纸)抹干切后吸芽球茎部分渗出的汁液，以防在接种操作时滑 手，如果切好的吸芽比较脏，可用75%的酒精擦拭干净。第二，叶鞘环割。待接种刀具消毒彻底后，吸芽茎尖无菌接种就可开始。用左手握 住吸芽圆柱体球茎部分(如果吸芽较小，也可用左手拇指、食指和中指抓住)，露出部分球 茎，以手术刀刀尖从假茎最外层叶鞘包口处下刀，沿着叶鞘与球茎交界线逆时针环割，环割 时左手拇指及食指要配合地将吸芽圆柱体顺时针转动，让刀尖划一圈。环割时要注意用刀 力度，视叶鞘厚薄及时调整用力轻重，原则是刀尖既不接触内层叶鞘，又能刚好使环割后的 叶鞘容易剥离。而且越靠近茎尖叶鞘越薄，环割力度也要越轻。这需要稍加练习即可做到。第三，叶鞘剥离。剥离叶鞘时，右手拇指、食指和中指抓住假茎部分，从环割后的叶 鞘包口开始，顺时针方向拧假茎，使整层叶鞘沿着切口拧离球茎后，用力将脱离球茎的叶鞘 拉开，露出里面一层叶鞘，然后依次剥离下一层叶鞘。这一步操作中需要注意①当右手拧假茎时不能用力过猛，以防将整个假茎部分 拧断。②应该先将叶鞘外面边缘拧开一个口子，然后顺着这个口子拧，直到将整层叶鞘拧离 球茎。③如果环割时有些地方划得太浅，叶鞘就不容易拧离球茎。④如果不小心将全部假 茎拧断了，操作就会变得复杂繁琐。这是需要在环割后，换大号手术刀(如23号刀)小心 挑开叶鞘，挑叶鞘时刀尖不能触及里面叶鞘，更不能碰到外面球茎，如果到外面球茎，必须 更换消毒过的手术刀接着操作。⑤需要剥离叶鞘层数的多少，要根据吸芽大小及预处理时 切除叶鞘多少而定。如果切除的叶鞘越多，切得越靠近茎尖，则需要剥离的叶鞘层数可相对 少些，一般需要剥离大约3 5层叶鞘即可。⑥每剥离一层叶鞘后，重新换消毒过的刀。第四，吸芽茎尖挑取和接种。经过剥离层层叶鞘后，剩下直径大约0. 4 0. 8厘米的茎尖(视吸芽大小而定)。用消毒好的手术刀切去所述假茎，留0.3-0. 7cm长，然后以 刀尖在最后剥离叶鞘内侧、茎尖边缘的地方，斜向逆时针插刀一圈，最后以刀尖将茎尖挑出 来，接种到诱导培养基上进行诱导培养。诱导培养基以MS培养基为基本培养基，添加6-苄 氨基嘌呤(6-BA)至其终浓度为4 5mg/L，添加萘乙酸(NAA)至其终浓度为0. 05mg/L，添 加白糖至其终浓度为35g/L。这一步需要注意①插刀时不应插太深，约插进5毫米深即可。②插刀方向应该和 圆柱体中轴线呈40 45°角，不能顺着圆柱体中轴线插刀。③挑取茎尖时用力不能太大， 要把全部的球茎组织插离后，轻轻将茎尖挑出。如果用力太大，很容易将茎尖弄掉到台面 上，结果前功尽弃。④挑出的茎尖必须带有球茎组织，否则茎尖就会失去根基，不能成功培养。香蕉茎尖是由许多层叶鞘紧密包围住，层层叠叠的叶鞘可把茎尖与外界完全隔离 开来，从而起到保护茎尖的作用。从最外层的叶鞘向内层叶鞘，其受杂菌污染的程度越来越 低，茎尖及附近几层叶鞘是不受杂菌污染的。采用本发明的方法能直接挑取出叶鞘内的茎 尖，不需要经过表面消毒就可获得无菌茎尖了。与现有技术相比，本发明的方法主要有以下优点(一)不使用消毒剂，不污染环 境。传统接种方法采用的消毒剂是0. 的升汞溶液，具有剧毒，用后的废弃液会对水源等 环境造成污染。而采用新的接种方法不采用任何消毒剂，不会对环境产生任何不良影响，而 且茎尖接种后不会因为消毒剂没冲洗干净而生长受到影响。(二)操作简单，易学易用。该 方法不用准备消毒器皿、无菌水和消毒剂等，不需要经过繁琐的切割过程，不用记消毒时间 等等在传统接种方法时需要做的事情，在这里你只要把手术刀消毒好就可开始接种，且沿 着假茎与球茎交界处，层层环剥，十分容易。(三)快速高效。新接种方法操作起来十分简 便快捷，一般熟练人员大约7 8刀就可接种一个吸芽，一天可接种香蕉吸芽100个左右。
具体实施例方式为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这 些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下面举例说明具体实施步骤1材料与用具1. 1材料预处理将选取回来的巴西蕉(香蕉品种)吸芽先切留假茎10 15厘米 长，然后从切口往球茎方向垂直下切，把外层叶鞘连球茎组织一起切除。最后切成假茎、球 茎部分各长6 10厘米，底部直径为2 3厘米的圆柱体。1. 2用具3把11号手术刀和1把23号手术刀，1台300°C电热消毒器(也可用酒 精灯)。2操作步骤2. 1叶鞘环割左手抓住吸芽圆柱体，右手拿手术刀。以消毒过的手术刀刀尖从叶鞘 包口处开始下刀，沿着外层叶鞘与球茎交界线逆时针轻划一圈至起刀的位置。2. 2叶鞘剥离右手抓住假茎部分，向顺时针方向拧叶鞘，先拧起叶鞘外边缘，然后 把整层叶鞘逐步拧离球茎。当叶鞘完全与球茎脱离后，右手用力将脱离的叶鞘拉开，或者将 叶鞘一片一片地撕开。按上述方法依次剥离其他叶鞘(约3 5层)。
2. 3茎尖挑取用消毒过的手术刀切去假茎，仅留约0. 5cm长，然后以刀尖在最后剥 离的叶鞘内侧、茎尖边缘的地方，与茎尖成45°夹角逆时针插刀一圈，轻轻地将带有部分球 茎组织的茎尖挑离球茎。 2. 4茎尖接种将茎尖接种到添加有6-苄氨基嘌呤(6-BA) 4 5mg/L、萘乙酸 (NAA)O. 05mg/L、白糖35g/L的MS诱导培养基，接种深度以刚好插入球茎组织为宜。2. 5茎尖转接培养20 25天后，将茎尖切口处形成的愈伤组织切去，然后将茎尖 切成4等份，接种在上述诱导培养基上。3接种结果 茎尖接种10天后观察，平均成功率在85%以上，茎尖开始膨大。再转接1次培养 20天后开始诱导出丛生芽。
权利要求
一种香蕉吸芽茎尖接种的方法，所述方法为挑取无菌的茎尖接种到诱导培养基中进行诱导培养，其特征在于，所述无菌的茎尖是通过无菌剥离叶鞘操作而获得的。
2.根据权利要求1所述的一种香蕉吸芽茎尖接种的方法，其特征在于，所述无菌剥离 叶鞘操作是用经高温消毒的手术刀将香蕉吸芽叶鞘沿着其与球茎交界处层层环割，直至全 部包住的叶鞘都剥离开。
3.根据权利要求2所述的香蕉吸芽茎尖接种的方法，其特征在于，所述无菌剥离叶鞘 操作包括如下步骤1)香蕉吸芽预处理用经高温消毒的手术刀切去香蕉吸芽的球茎和假茎外层，处理后 的吸芽为圆柱体；2)叶鞘环割；3)叶鞘剥离；4)吸芽茎尖挑取；以上操作都在超净工作台上进行。
4.根据权利要求3所述的香蕉吸芽茎尖接种的方法，其特征在于，所述步骤2操作如 下握住所述吸芽圆柱体球茎部分，露出所述叶鞘及所述球茎交界位置，以刀尖从叶鞘包口 处下刀，沿着所述叶鞘与所述球茎交界线逆时针环割。
5.根据权利要求3所述的香蕉吸芽茎尖接种的方法，其特征在于，所述步骤3操作如 下抓住所述假茎部分，向顺时针方向拧所述假茎，先拧起所述叶鞘外边缘，然后把整层叶 鞘拧离球茎；当所述叶鞘完全与所述球茎脱离后，用力将脱离的叶鞘拉开，或者将叶鞘一片 一片地撕开；按上述方法依次剥离其他叶鞘，每剥离一层叶鞘需要重新换消毒过的手术刀。
6.根据权利要求3所述的香蕉吸芽茎尖接种的方法，其特征在于，所述步骤4操作如 下用消毒过的手术刀切去所述假茎，留0. 3-0. 7cm长，然后以刀尖在最后剥离的叶鞘内 侧、茎尖边缘的地方，逆时针插刀一圈，将带有部分球茎组织的茎尖挑离球茎。
7.根据权利要求1所述的香蕉吸芽茎尖接种的方法，其特征在于，所述诱导培养包括 如下步骤1)茎尖接种；2)茎尖转接；以上步骤都在都在超净工作台进行。
8.根据权利要求7所述的香蕉吸芽茎尖接种的方法，其特征在于，所述步骤1为将茎尖 接种到所述诱导培养基上，接种深度以刚好插入球茎组织为宜；所述诱导培养基以MS培养 基为基本培养基，添加6-苄氨基嘌呤(6-BA)4 5mg/L、萘乙酸(NAA)O. 05mg/L、白糖35g/ L0
9.根据权利要求8所述的香蕉吸芽茎尖接种的方法，其特征在于，所述步骤2为培养 20 25天后，将茎尖切口处形成的愈伤组织切去，然后将茎尖纵切成4等份，接种在所述诱导培养基中。
全文摘要
本发明提供了一种香蕉吸芽茎尖接种的方法，该方法为将香蕉吸芽预处理，切成吸芽圆柱体后，用经高温消毒的手术刀将香蕉吸芽叶鞘沿着其与球茎交界处环割，依次层层环剥，直至把全部包住的叶鞘都剥离开，便可轻易挑取无菌的茎尖接种到添加有6-BA 4～5mg/L、NAA 0.05mg/L、白糖35g/L的MS诱导培养基中进行诱导培养。本方法克服了传统方法中需要使用消毒剂，材料预处理过程繁琐、效率不高等缺陷，达到简便易行、高效、环保的效果。
文档编号A01H4/00GK101869076SQ20101021842
公开日2010年10月27日 申请日期2010年7月6日 优先权日2010年7月6日
发明者汤亚飞, 苏海, 蔡时可, 谢梅新 申请人:广东省农业科学院作物研究所