专利名称：一种诱导桉树产生愈伤组织并分化出芽的方法
技术领域：
本发明涉及桉树的组织培养技术领域域，尤其是指一种诱导桉树产生愈伤组织并 分化出芽的方法。
背景技术：
桉树是桃金娘科Myrtaceae桉属Eucalyptus植物的统称。多数桉树为常绿高大 乔木，而少数为小乔木或灌木。桉树分布于热带与亚热带地区，属于喜光植物，而且根系粗 壮发达。桉树具有速生，丰产，适应性强，生产周期短，用途广等特点，是可作为纸浆材料的 主要的速生栽培树种之一。桉树目前已被多个国家和地区广泛种植，桉树人工林面积约占 世界人工林总面积的三分之一。桉树除作为纸浆材和纤维板材的用途之外，还可以作为提 取单宁和精油的原料，因此具有广泛的开发利用价值。经过多年组织培养和扦插等无性系育苗的研究，以及杂交育种和选优等传统选种 育种工作，目前生产上广泛使用的就是巨桉和尾叶桉的杂交品种，例如DH32-29，广林九号 及其它优良无性系。由于林木生长周期长，遗传杂和性高，许多性状属于多基因控制的数量性状，常规 的育种手段难以满足定向培育桉树新品种的要求。因此人们希望利用新兴的基因工程技术 来解决桉树常规育种难以解决的问题，定向地培育出经济价值高的性状。基因工程育种是 以现代分子生物学技术为基础，将目的基因通过体外重组导入受体细胞，然后再生出完整 植株以培育出新桉树品种的一种技术手段。它具有高效性和针对性，可弥补常规育种技术 的不足，加速优质，高价值桉树新品种的选育。目前利用植物转基因技术存在几个问题一是转化效率偏低；二是主要转化技术 限于赤桉、巨桉等品种，在其他桉树品种中报道很少；三是大部分成功再生的实验材料是以 种子为基础，种子变异大，难以应用于无性系的桉树杂交种。由于广泛栽培的DH32-29、广林 九号等优良无性系通过叶盘和茎段愈伤组织的再生效率极低，难以获得较多数量的独立转 化植株从而筛选出外源基因表达良好的株系，转基因育种的发展收到极大地限制。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种诱导桉树产生愈伤组织并分化出的方 法，解决现有桉树愈伤分化出芽的转化率低，不能对杂交种进行愈伤分化出芽，从而限制基 因育种等问题。为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案一种诱导桉树产生愈伤组织并 分化出芽的方法，包括以下步骤
1)采集腋芽，进行消毒及萌芽；
2)生根诱导和白化苗诱导培养；
3)以白化苗的茎段切段为外植体进行诱导培养获得愈伤组织，该愈伤诱导培养基含有 多胺；4)将产生的愈伤组织分化出不定芽。所述第1步骤是采集2-4年生桉树杂交品种的带腋芽茎段，经消毒处理后接种在 MS培养基上萌发得到无菌芽；萌芽的培养条件是温度22-30°C，无光照；所述消毒的方法 是采用酒精和升汞消毒，并用无菌水冲洗。第2步骤具体包括以下步骤
a)将第(1)步骤获得腋芽萌发芽转移到含0.l-2mg/L细胞分裂素，0. 01-lmg/L生长素 的MS培养基上诱导产生丛生芽；
b)丛生芽中的健壮芽丛转移到含0.1-lmg/L生长素的1/2MS培养基上诱导产生生根
苗；
c)将生根苗切掉顶芽，接种在含蔗糖30-100g/L、NH4NO31650_6000mg/L、KH2PO4 170-800mg/L的MS培养基上，在黑暗中进行白化苗诱导培养。优选地，第2步骤具体包括
a)切取一定长度的腋芽，转移到含0.l-2mg/L 6-苄基嘌呤，0. 01-lmg/L萘乙酸的MS 培养基上，培养21-28天，光照12-18小时/天，光照强度1500-100001x，温度22-30°C ；
b)切取生长至一定长度的芽，转移到含0.1-lmg/L 3-吲哚丁酸的1/2MS培养基上进行 生根诱导15-30天，光照12-18小时/天，光照强度1500-100001x，温度22-30°C ；
c)将生根苗切掉顶芽，保留根和基部的若干个腋芽，接种在含蔗糖30-100g/L、NH4NO3 4500mg/L、KH2PO4 500mg/L的MS培养基上进行白化苗诱导培养，暗培养14-35天，温度 22-30 "C。第3步骤中，愈伤诱导培养基优选是含50-200mg/L腐胺、5_30mg/L亚精胺的MS培养基。第3步骤中，愈伤诱导培养基进一步包含0. 2-2mg/L细胞分裂素、0. 01-0. lmg/L 生长素。优选地，第3步骤具体包括
a)以白化苗的茎段切段为外植体，接种在含0.05-0.3mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸， 0. 1-0. 5mg/L 6-苄基嘌呤的MS培养基上进行细胞活化培养，暗培养0_6天，温度22-30°C;
b)活化后的外植体转移到含0.2-2mg/L N-苯基-N-1，2，3-噻二唑-5-脲，0. 01-0. Img/ L萘乙酸，50-200mg/L腐胺，5_30mg/L亚精胺的MS培养基上培养产生愈伤组织，暗培养5-7 天，温度22-30 0C ；
c)转移到弱光照培养12-14天，光照12-18小时/天，光照强度20-2001X，22-30°C。所述第4步骤是将第(3)步骤产生的愈伤组织转移到分化培养基上培养，使愈伤 组织分化不定芽，所述的分化培养基是含有多胺的MS培养基。其中，第4步骤的分化培养基进一步包含0.2-2mg/L细胞分裂素，0. 05_0. 5mg/L 生长素。优选地，所述第4步骤具体包括
a)将获得的愈伤组织，转移到含0.2-2mg/L 6-苄基嘌呤，0. 05-0. 5mg/L萘乙酸， 10-40mg/L腐胺，0. 5-3mg/L亚精胺的MS培养基上，每隔14-25天转移到相同的分化培养基 上继代培养，光照12-18小时/天，光照强度500-30001χ，温度22_30°C ；
b)在分化培养基上继代培养14-100天产生不定芽。
本发明的有益效果如下本发明利用白化苗的茎段，经愈伤组织再生途径分化出 芽，愈伤组织再生途径可以用于目的基因导入受体细胞等基因工程，是转基因的基础。而 且，本发明建立的诱导桉树杂交种产生愈伤组织并分化出芽的方法，以林场中生长的无性 系成年桉树的萌芽条为基础，再生系统的再生效率达30%以上，可以应用于DH32-29、广林 九号及其它优良无性系，为利用现代生物技术对桉树的遗传改良奠定了良好的基础，具有 十分重要的经济价值。
具体实施例方式本发明公开了一种诱导桉树杂交种产生愈伤组织并分化出芽的方法，包括以下步 骤
(1)采集腋芽，进行消毒及萌芽；
(2)生根诱导和白化苗诱导培养；
(3)愈伤组织的诱导；
(4)分化出不定芽。第(1)步骤中，采集2-4年生杂交桉树新生的萌芽条，优选采集腋芽开始膨大，芽 鳞片尚未开裂的萌芽条，切成1. 5-2. Ocm长的带腋芽的茎段，经消毒处理后接种在MS培养 基上萌发，得到无菌芽。茎段的消毒方法是
(a)75%乙醇浸泡20秒；
(b)无菌水冲洗2次；
(c)0.1%升汞浸泡5分钟；
(d)倒出升汞，用无菌水冲洗4-6次；
(e)修剪成0.5-1. Ocm长的带腋芽的茎段；
(f)0.1%升汞浸泡2分钟；
(g)倒出升汞，用无菌水冲洗4-6次；
(h)接好的材料暗培养21-28天。萌芽用的培养基是，MS基本培养基含30g/L蔗糖，7g/L琼脂，以及pH5. 8。萌芽的培养条件是，温度22_30°C，无光照。第(2)步骤中，进一步包括以下培养步骤
(a)切取1.0cm长的腋芽，转移到含0.l_2mg/L细胞分裂素如6-苄基嘌呤，0. Ol-Img/ L生长素如萘乙酸的MS培养基上，培养21-28天，光照12-18小时/天，光照强度 1500-100001x，温度 22-30°C ；
(b)切取生长至1.5cm长的芽，转移到含0. 1-lmg/L生长素如3-吲哚丁酸的V2MS 培养基上进行生根诱导15-30天，光照12-18小时/天，光照强度1500-100001X，温度 22-30 0C ；
(c)将生根苗切掉顶芽，保留根和基部的1-4个腋芽，接种在含蔗糖30-100g/L、NH4NO3 1650-6000mg/L,KH2PO4 170_800mg/L的MS培养基上进行白化苗诱导培养，暗培养14-35天， 温度 22-30°C，该 MS 诱导培养基优选含 NH4NO3 4500mg/L、KH2PO4 500mg/L。其中第(3)步骤进一步包含以下步骤(a)以白化苗的3-10mm的茎段切段为外植体，接种在含0.05-0.3mg/L生长素如 2，4-二氯苯氧乙酸，0. 1-0. 5mg/L细胞分裂素如6-苄基嘌呤的MS培养基上进行细胞活化 培养，暗培养0-6天，温度22-30°C ；
(b)活化后的外植体转移到含0.2-2mg/L细胞分裂素如N-苯基_N_1，2，3-噻二 唑-5-脲，0. 01-0. lmg/L生长素如萘乙酸，多胺如50_200mg/L腐胺、5_30mg/L亚精胺的MS 培养基上培养产生愈伤组织，暗培养5-7天，温度22-30°C ；
(c)转移到弱光照培养12-14天，光照12-18小时/天，光照强度20-2001X，22-30°C。在该步骤中，以白化苗的不带芽原基的茎段进行培养，使分化的体细胞经活化及 脱分化形成愈伤组织。而第(4 )步骤进一步包括
(a)将获得的愈伤组织，转移到含0.2-2mg/L细胞分裂素如6-苄基嘌呤，0. 05-0. 5mg/ L生长素如萘乙酸，多胺如10-40mg/L腐胺、0. 5_3mg/L亚精胺的MS培养基上，每隔14-25 天转移到相同的分化培养基上继代培养。再分化培养的条件为光照12-18小时/天，光照 强度 500-30001x，温度 22-30 0C ；
(b)在分化培养基上继代培养14-100天产生不定芽。本发明的方法，主要利用白化苗的茎段，经愈伤组织再生途径分化出芽，其中再生 途径包含由分化的体细胞经脱分化形成愈伤组织，然后再分化形成芽。该愈伤组织经再生 途径可以用于将目的基因导入受体细胞，然后再生出完整植株，从而可实现对桉树，特别是 对杂交品种的桉树，如DH32-29、广林九号及其它优良无性系，进行定向的遗传改良。下面结合实例详述描述本发明的实施方案。需要说明的是，下述实例是说明性的， 不是限定性的，不能以下述实例来限定本发明的保护范围。实例1 结合表1所示愈伤组织分化率，本例中诱导桉树茎段产生愈伤组织并分化 出芽的方法，具体包括以下步骤
首先，选取DH32-29的3年生植株，砍掉树冠部分，保留1_1. 5m高的树桩。1个月后采 集新生的萌芽条，切成2. Ocm长的带腋芽的茎段，70%乙醇中浸泡20秒，无菌水冲洗2次， 然后在0. 1%氯化汞中消毒5分钟，无菌水冲洗4次，修剪成1. Ocm长的带腋芽的茎段，再于 0. 1%氯化汞中消毒2分钟，无菌水冲洗6次。晾干后接种在MS培养基中，每瓶接1-2颗， 25°C暗培养28天，得到萌发的腋芽。第二步，切取1.0cm长的腋芽，转移到含0. lmg/L 6_苄基嘌呤，0. 01mg/L萘乙酸 的MS培养基上，每隔23天转移到相同的培养基上继代培养，光照16小时/天，光照强度 30001x，温度 25 0C ο第三步，切取生长至1. 5cm长的芽，转移到含0. 5mg/L 3_吲哚丁酸的1/2MS培养 基上进行生根诱导20天，光照16小时/天，光照强度30001x，温度25°C。第四步，将生根苗切掉顶芽，保留根和基部的2个腋芽，接种在含蔗糖70g/L、 NH4NO3 4500mg/L、KH2PO4 500mg/L的MS培养基上进行白化苗诱导培养，暗培养23天，温度 25 °C，从而获得白化苗。第五步，以白化苗的5mm的茎段切段为外植体，本实例中共505块外植体，接种在 含0. lmg/L 2，4- 二氯苯氧乙酸，0. 25mg/L6-苄基嘌呤的MS培养基上，暗培养5天，温度 25°C，从而活化体细胞。
第六步，转移到含0. 7mg/L N-苯基-N-1，2，3_噻二唑_5_脲，0. 02mg/L萘乙酸， 80mg/L腐胺，15mg/L亚精胺的MS培养基上，暗培养5天，温度25 °C。第七步，转移到弱光照培养14天，光照16小时/天，光照强度501x，温度25°C，从 而获得脱分化的愈伤组织共505块。第八步，将获得的愈伤组织，转移到含0. 5mg/L 6_苄基嘌呤，0. lmg/L萘乙酸， 15mg/L腐胺，1. 5mg/L亚精胺的MS培养基上，每隔21天转移到相同的分化培养基上继代培 养，光照16小时/天，光照强度15001x，温度25°C。最后，在分化培养基上继代培养40天产生不定芽，共184块。具体见表1
表1本发明实例中的愈伤组织分化率
本实例中，愈伤组织再生系统的再生效率达36. 4%。实例2 结合表2所示愈伤组织分化率，本例中诱导桉树茎段产生愈伤组织并分 化出芽的方法，具体包括以下步骤
首先，选取广林九号的3年生植株，砍掉树冠部分，保留1-1. 5m高的树桩。1个月后采 集新生的萌芽条，切成2. Ocm长的带腋芽的茎段，70%乙醇中浸泡20秒，无菌水冲洗2次， 然后在0. 1%氯化汞中消毒5分钟，无菌水冲洗4次，修剪成1. Ocm长的带腋芽的茎段，再于 0. 1%氯化汞中消毒2分钟，无菌水冲洗6次。晾干后接种在MS培养基中，每瓶接1-2颗， 25°C暗培养28天，得到萌发的腋芽。第二步，切取1.0cm长的腋芽，转移到含0. lmg/L 6_苄基嘌呤，0. 01mg/L萘乙酸 的MS培养基上，每隔23天转移到相同的培养基上继代培养，光照16小时/天，光照强度 30001x，温度 25 0C ο第三步，切取生长至1. 5cm长的芽，转移到含0. 5mg/L 3_吲哚丁酸的V2MS培养 基上进行生根诱导30天，光照16小时/天，光照强度30001x，温度25°C。第四步，将生根苗切掉顶芽，保留根和基部的2个腋芽，接种在含蔗糖50g/L、 NH4NO3 4500mg/L、KH2PO4 500mg/L的MS培养基上进行白化苗诱导培养，暗培养30天，温度 25 °C。第五步，以白化苗的4mm的茎段切段为外植体共321块，接种在含0. lmg/L 2，4- 二氯苯氧乙酸，0. 25mg/L 6-苄基嘌呤的MS培养基上，暗培养6天，温度25°C。第六步，转移到含0. 7mg/L N-苯基-N-1，2，3_噻二唑_5_脲，0. 02mg/L萘乙酸， 80mg/L腐胺，15mg/L亚精胺的MS培养基上，暗培养5天，温度25 °C。第七步，转移到弱光照培养14天，光照16小时/天，光照强度501x，温度25°C。第八步，将获得的愈伤组织共321块，转移到含0. 5mg/L 6_苄基嘌呤，0. lmg/L萘 乙酸，15mg/L腐胺，1. 5mg/L亚精胺的MS培养基上，每隔21天转移到相同的分化培养基上 继代培养，光照16小时/天，光照强度15001x，温度25°C。最后，在分化培养基上继代培养30天产生不定芽，共136块。具体见表2
表2本发明实例中的愈伤组织分化率
本实例中，愈伤组织再生系统的再生效率达42. 4%。
实例3 结合表3所示愈伤组织分化率，本例中诱导桉树茎段产生愈伤组织并分化 出芽的方法，选取按传统方法自行育种的一种巨桉和尾叶桉杂交种的2年生植株，其余步 骤和实例1相同。本例中，含有分化的体细胞的白化苗茎段外植体共396块，经脱分化形成 愈伤组织396块，然后愈伤组织再分化出不定芽，共148块。具体见表3 表3本发明实例中的愈伤组织分化率
本实例中，该再生系统的再生效率达37. 4%。
由上述实例可见，本发明利用白化苗的茎段，经愈伤组织再生途径分化出芽，再生 率在30%以上。相应地，本发明的愈伤组织经共培养导入目的基因，再分化成芽，转基因愈 伤组织的再生率也可达30%以上，从而能实现对桉树，特别是杂交品种的的桉树进行遗传 改造。
权利要求
一种诱导桉树产生愈伤组织并分化出芽的方法，包括以下步骤1)采集腋芽，进行消毒及萌芽；2)生根诱导和白化苗诱导培养；3)以白化苗的茎段切段为外植体进行诱导培养获得愈伤组织，该愈伤诱导培养基含有多胺；4)将产生的愈伤组织分化出不定芽。
2.如权利要求1所述的诱导桉树产生愈伤组织并分化出芽的方法，其特征在于所述 第1步骤是采集2-4年生桉树杂交品种的带腋芽茎段，经消毒处理后接种在MS培养基上萌 发得到无菌芽；萌芽的培养条件是温度22-30°C，无光照；所述消毒的方法是采用酒精和 升汞消毒，再用无菌水冲洗。
3.如权利要求1所述的诱导桉树产生愈伤组织并分化出芽的方法，其特征在于第2 步骤包括a)将第1步骤获得腋芽萌发芽转移到含0.l-2mg/L细胞分裂素，0. 01-lmg/L生长素的 MS培养基上诱导产生丛生芽；b)丛生芽中的健壮芽丛转移到含0.1-lmg/L生长素的1/2MS培养基上诱导产生生根苗；c)将生根苗切掉顶芽，接种在含蔗糖30-100g/L、NH4NO31650_6000mg/L、KH2PO4 170-800mg/L的MS培养基上，在黑暗中进行白化苗诱导培养。
4.如权利要求3所述的诱导桉树产生愈伤组织并分化出芽的方法，其特征在于第2 步骤具体包括a)切取一定长度的腋芽，转移到含0.l-2mg/L 6-苄基嘌呤，0. 01-lmg/L萘乙酸的MS 培养基上，培养21-28天，光照12-18小时/天，光照强度1500-100001x，温度22-30°C ；b)切取生长至一定长度的芽，转移到含0.1-lmg/L 3-吲哚丁酸的1/2MS培养基上进行 生根诱导15-30天，光照12-18小时/天，光照强度1500-100001x，温度22-30°C ；c)将生根苗切掉顶芽，保留根和基部的若干个腋芽，接种在含蔗糖30-100g/L、NH4NO3 4500mg/L、KH2PO4 500mg/L的MS培养基上进行白化苗诱导培养，暗培养14-35天，温度 22-30 "C。
5.如权利要求1所述的诱导桉树产生愈伤组织并分化出芽的方法，其特征在于所述 第3步骤中，愈伤诱导培养基是含50-200mg/L腐胺、5_30mg/L亚精胺的MS培养基。
6.如权利要求5所述的诱导桉树产生愈伤组织并分化出芽的方法，其特征在于所述 第3步骤中，愈伤诱导培养基进一步包含0.2-2mg/L细胞分裂素、0. 01_0. lmg/L生长素。
7.如权利要求6所述的诱导桉树产生愈伤组织并分化出芽的方法，其特征在于所述 第3步骤具体包括a)以白化苗的茎段切段为外植体，接种在含0.05-0.3mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸， 0. 1-0. 5mg/L 6-苄基嘌呤的MS培养基上进行细胞活化培养，暗培养0_6天，温度22-30°C;b)活化后的外植体转移到含0.2-2mg/L N-苯基-N-1，2，3-噻二唑-5-脲，0. 01-0. Img/ L萘乙酸，50-200mg/L腐胺，5_30mg/L亚精胺的MS培养基上培养产生愈伤组织，暗培养5-7 天，温度22-30 0C ；c)转移到弱光照培养12-14天，光照12-18小时/天，光照强度20-2001X，22-30°C。
8.如权利要求1所述的诱导桉树产生愈伤组织并分化出芽的方法，其特征在于所述 第4步骤是将第3步骤产生的愈伤组织转移到分化培养基上培养，使愈伤组织分化不定芽， 所述的分化培养基是含有多胺的MS培养基。
9.如权利要求8所述的诱导桉树产生愈伤组织并分化出芽的方法，其特征在于所述 第4步骤的分化培养基进一步包含0. 2-2mg/L细胞分裂素、0. 05-0. 5mg/L生长素。
10.如权利要求9所述的诱导桉树产生愈伤组织并分化出芽的方法，其特征在于所述 第4步骤具体包括a)将获得的愈伤组织，转移到含0.2-2mg/L 6-苄基嘌呤，0. 05-0. 5mg/L萘乙酸， 10-40mg/L腐胺，0. 5-3mg/L亚精胺的MS培养基上，每隔14-25天转移到相同的分化培养基 上继代培养，光照12-18小时/天，光照强度500-30001χ，温度22_30°C ；b)在分化培养基上继代培养14-100天产生不定芽。
全文摘要
本发明涉及一种诱导桉树产生愈伤组织并分化出芽的方法，包括以下步骤采集腋芽，进行消毒及萌芽；生根诱导和白化苗诱导培养；以白化苗的茎段切段为外植体进行诱导培养获得愈伤组织，该愈伤诱导培养基含有多胺；以及，将产生的愈伤组织分化出不定芽。本发明利用白化苗的茎段经愈伤组织再生途径分化出芽，愈伤组织再生途径可以用于目的基因导入受体细胞等基因工程，是转基因的基础。而且，以林场中生长的无性系成年桉树的萌芽条为基础，再生系统的再生效率达30%以上，可以应用于DH32-29、广林九号及其它优良无性系，为利用现代生物技术对桉树的遗传改良奠定了良好的基础，具有十分重要的经济价值。
文档编号A01H4/00GK101897298SQ201010249030
公开日2010年12月1日 申请日期2010年8月10日 优先权日2010年8月10日
发明者孟丽娜, 张兰英, 李凝, 李 浩, 江淑珍, 王利芳, 陈方 申请人:普罗米绿色能源(深圳)有限公司