专利名称：一种利用牙签接种法鉴定番茄对番茄黄化曲叶病毒抗性的方法
技术领域：
本发明涉及一种番茄黄化曲叶病毒抗性鉴定方法，属植物保护领域。
背景技术：
番茄黄化曲叶病是番茄上一种毁灭性的病毒病，该病自1964年首次报道以来，在 欧洲、非洲、亚洲、加勒比海及大洋州等地区都有发生危害的报道，特别是近年来，随着全球 气候变暖和耕作制度的改变以及国际间贸易的增加，番茄黄化曲叶病在全球范围传播，给 番茄生产造成了严重损失。1991-1992年该病在美国佛罗里达州番茄上暴发，造成的损失达 1. 4亿美元。在我国，由番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV)导致的 番茄黄化曲叶病最早于2006年在上海和浙江出现危害报道，番茄受其侵染后早期会表现 叶缘黄化、上卷，叶片变小、植株矮缩；后期整株上部呈现簇缩状，花萎蔫，座果率大大降低， 严重影响番茄的产量和质量，发病重的棚室多造成绝产绝收，经济损失巨大。2007年该病传 入江苏、安徽、山东危害，随后在河北、北京、天津、内蒙古等省市也相继出现危害，扩展蔓延 速度十分惊人，同时造成的危害也异常惨重。2008年末到2009年初仅河北邯郸市因番茄黄 化曲叶病造成的直接经济损失就近1亿元。目前该病已经逐渐成为当前我国番茄生产上一 个重要的制约因素。在大多数植物病毒病的防治中，抗性品种是最为经济有效的防治措施，而在抗性 资源的发掘及利用中，抗性鉴定方法是必不可少的一个关键环节。由于番茄黄化曲叶病毒 是一种烟粉虱传播的病毒，因此长期以来该病毒的抗性鉴定多采用烟粉虱接种鉴定法，但 是该方法操作过程中需要烟粉虱来完成传毒，因此存在一些难于克服的问题1、烟粉虱的 接种虫量难于控制，由于烟粉虱的生活周期非常短，世代重叠现象非常严重，导致其群体增 殖能力非常强，而烟粉虱的个体又非常小，因此无论是在田间还是在室内，单株上接种的烟 粉虱数量很难控制；2、带毒烟粉虱的接种数量难于控制，由于烟粉虱本身的接种虫量难于 控制，也导致了其中带毒烟粉虱的接种虫量难于计量；3、烟粉虱的传毒效率难于控制，由于 烟粉虱是一种传毒昆虫，只有在其取食的过程中才能实现传毒，而其取食受诸多因素影响， 如温度、湿度、光照、寄主等等，这些因素会影响其取食次数及取食量，对传毒效率产生影 响，进而对鉴定结果的准确性也产生影响；4、由于烟粉虱传播的病毒非常多，因此使用烟粉 虱接种番茄黄化曲叶病毒的时候，烟粉虱可能同时携带其它病毒，影响接种鉴定结果。为了解决烟粉虱接种鉴定方法上存在的问题，我们创制了一种基于侵染性克隆接 种鉴定的方法，该方法操作简便，重复性好，可控性好，效率高，结果准确，为抗番茄黄化曲 叶病毒的番茄材料的研究及利用提供了一种新方法。
发明内容
本发明克服了现有技术中的缺点，为番茄黄化曲叶病毒的抗性鉴定提供了一种快速、简便、有效的方法。1、抗性鉴定的材料含PTYjOl的农杆菌保存于江苏省农科院植保所病害室(江苏省南京市孝陵卫钟 灵街50号，210014)，YEP培养基及抗生素的配制参照《分子克隆实验指南(第三版)》。2、抗性鉴定方法a)将含有PTYjOl的农杆菌接种含50mg/ml的卡那霉素(Kanamycin)和50mg/ml 的利福平(Rifamycin)的YEP液体培养基中，28°C 150rpm培养至OD6tltl达到0. 6-0. 8。b)常规条件下育苗，2片真叶时移至一次性营养钵中，3-4片叶时进行接种处理。c)用牙签尖头蘸取菌液于3-4叶期番茄茎杆韧皮部刺伤3-4处(每刺伤1处蘸取 菌液1次)，处理后的番茄于温室(温度为25-28°C)内放置1-2天，而后移置田间或者温 室，观察发病情况。d) 15-30天统计发病情况，计算发病率，评价番茄材料对番茄黄化曲叶病毒的抗 性发病率高的材料表现感病，发病率低的材料表现抗病。本发明的有益效果是只需简单的牙签刺伤茎杆就实现了番茄黄化曲叶病毒的抗 性鉴定。避免了常规烟粉虱接种鉴定方法的上的缺陷，无需饲养烟粉虱，无需繁琐的操作， 同时该方法还具有鉴定结果准确、重复性好、效率高等优势。
具体实施例方式实例一以番茄材料合作903大红、001、002、747为研究对象，通过牙签接种法鉴定其对番 茄黄化曲叶病毒的抗性。1、实验处理a)将含有PTYjOl的农杆菌接种含50mg/ml的卡那霉素(Kanamycin)和50mg/ml 的利福平(Rifamycin)的YEP液体培养基中，28°C 150rpm培养至OD6tltl达到0. 6-0. 8。b)常规条件下育苗，2片真叶时移至一次性营养钵中，3-4片叶时进行接种处理。c)用牙签尖头蘸取菌液于3-4叶期番茄茎杆韧皮部刺伤3-4处(每刺伤1处蘸取 菌液1次)，处理后的番茄于温室(温度为25-28°C)内放置1-2天，而后移置田间或者温 室，观察发病情况。d) 15-30天统计田间发病情况，计算发病率，评价番茄材料对番茄黄化曲叶病毒的 抗性。2、实验结果处理后的番茄于接种后15天左右出现症状(叶缘黄化、上卷)，与田间番茄黄化曲 叶病病株症状一致，20-25天统计发病率合作903 大红100% (30/30)；001 100% (24/24)；002 100% (19/19)；747 0% (0/22)；
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由发病率可以看出4份番茄材料中，合作903大红、001、002全部发病(发病率为 100% ),为感病材料；而747没有一棵发病(发病率为0% )，为抗病材料。
权利要求
一种利用牙签接种法鉴定番茄对番茄黄化曲叶病毒抗性的方法，包括以下步骤(1)将含有PTYj01的农杆菌接种含50mg/ml的卡那霉素(Kanamyein)和50mg/ml的利福平(Rifamycin)的YEP液体培养基中，28℃150rpm培养至OD600达到0.6 0.8。(2)常规条件下育苗，2片真叶时移至一次性营养钵中，3 4片叶时进行接种处理。(3)用牙签尖头蘸取菌液于3 4叶期番茄茎杆韧皮部刺伤3 4处(每刺伤1处蘸取菌液1次)，处理后的番茄于温室(温度为25 28℃)内放置1 2天，而后移置田间或者温室，观察发病情况。(4)15 30天统计发病情况，计算发病率，评价番茄材料对番茄黄化曲叶病毒的抗性发病率高的材料表现感病，发病率低的材料表现抗病。
2.根据权利要求1所述的牙签接种鉴定番茄黄化曲叶病毒抗性的方法，其特征在于番 茄接种及接种后放置的温室温度为25-28°C。
3.根据权利要求1所述的牙签接种鉴定番茄黄化曲叶病毒抗性的方法，其特征在于番 茄接种后于温室内放置的天数为1-2天。
4.根据权利要求1所述的牙签接种鉴定番茄黄化曲叶病毒抗性的方法，其特征在于接 种用的工具为牙签。
5.根据权利要求1所述的牙签接种鉴定番茄黄化曲叶病毒抗性的方法，其特征在于接 种用的方法为刺伤。
6.根据权利要求1所述的牙签接种鉴定番茄黄化曲叶病毒抗性的方法，其特征在于接 种鉴定的病毒为番茄黄化曲叶病毒。
全文摘要
本发明提供一种快速、简捷、有效的番茄黄化曲叶病毒抗性鉴定方法，属植物保护领域。番茄黄化曲叶病毒是一种烟粉虱传播的病毒，传统的抗性鉴定多采样烟粉虱接种鉴定法，而烟粉虱接种鉴定法由于受到烟粉虱的影响(如烟粉虱接种虫量、带毒率、取食特性等)，很难提供稳定一致的接种压力，同时还会受其它粉虱传病毒的干扰，从而导致鉴定结果准确性和重复性差。而牙签接种鉴定法很好的克服了这些问题，利用构建好的侵染性克隆，通过牙签刺伤韧皮部接种番茄黄化曲叶病毒，鉴定番茄材料对番茄黄化曲叶病毒的抗性，该方法无需饲养烟粉虱、操作简单、效率高、重复性好、可控性好，能提供相对一致的接种压力，结果准确，是一种简便有效的接种鉴定方法。
文档编号A01G1/00GK101946607SQ201010251220
公开日2011年1月19日 申请日期2010年8月12日 优先权日2010年8月12日
发明者周彤, 周晓伟, 周益军, 季英华, 程兆榜 申请人:江苏省农业科学院