专利名称：水稻叶片倾角控制基因sal1的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程领域。具体地说，本发明涉及一种利用水稻叶片倾角控 制基因SALl转化植物调节叶片倾角的方法，用以获得农作物的理想株型，提高农作物的产量。
背景技术：
水稻是重要的粮食作物，也是禾本科作物研究的模式植物。水稻的株型与产量和 抗病性等密切相关，其构成因素包括有效分蘖数目、分蘖角度、穗部形态、株高以及叶夹角 的大小等，合理的株型可以使一定的水稻群体最大限度地提高单产。水稻的分蘖角度决定 了植株紧凑程度，进而影响了单位面积内的播种数目，水稻的叶夹角是水稻品种的重要评 价指标，与水稻的产量和抗病性密切相关，合适的叶夹角可以减少叶片之间的相互遮蔽，使 植株具有良好的光捕获能力，进而提高植株光合作用效率，提高水稻产量。目前控制水稻株型或叶片形状的基因有水稻基因RL10，SLl 1, RLAL1，这些基因已 经公开专利申请 CN100582231A，CN1923850A, CN101386859A 中。目前的研究表明油菜素内酯(BR)和生长素均能影响叶片倾角的大小，其中参与 BR合成和信号转导途径的多个基因参与控制水稻叶片倾角的大小，这些基因中，P450家族 基因成员调节植物的形态建成、生长发育、对生物逆境和非生物逆境的反应等众多生理过 程。本发明利用水稻叶片倾角减小突变体，通过图位克隆结合T-DNA标签法在水稻中克隆 了 SALl基因，该基因编码一个P450蛋白，该P450蛋白调节水稻叶片倾角功能为首次发现。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种从水稻半矮化叶片倾角减小突变体中克隆 新基因SALl，该基因编码的蛋白，将该基因转化进入植物，尤其是水稻以调控叶片的倾角的 方法。为了解决上述技术问题，本发明提供了一种水稻叶形控制基因SAL1，该基因具有 SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。优选地，上述SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列中可以添加、取代，插入或缺失一个 或多个核苷酸形成SALl衍生物，该SALl衍生物与水稻叶形控制基因SALl具有相同的功 能。本发明还提供了一种水稻叶形控制基因编码的蛋白质，该蛋白质由SEQ IDN0. 1所 示的核苷酸序列编码，其具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。优选地，上述SEQ ID NO. 2的氨基酸序列中可以添加、取代、插入或缺失一个或多 个氨基酸或其他物种的同源序列，从而生成氨基酸序列的衍生物。本发明还提供了一种培育植物减小叶倾角的方法，该方法包括用SEQ IDN0. 1所示 的核苷酸序列转化植物细胞，再将转化的植物细胞培育成植株，其中植物细胞优选为水稻、 大麦、小麦、玉米、高粱或甘蔗细胞，尤其优选为水稻细胞。
本发明还提供了一种培育水稻减小叶倾角的方法，该方法包括用含有SEQID NO. 1 所示的核苷酸序列的质粒转化水稻细胞，再将转化的细胞培育成植株，其中质粒含有上述 基因序列SEQ ID NO. 1。优选地，本发明提供了一种培育水稻减小叶倾角的方法，该方法包括用含有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列的表达载体转化水稻细胞，再将转化的细胞培育成植株，表达载 体为含有基因序列SEQ ID NO. 1的载体pCAMBIA-35S-SALl-N0S。本发明还提供了一种宿主细胞，该宿主细胞含有基因序列SEQ ID NO. 1或其衍生 物。上述宿主细胞可以是大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或植物细胞。其中植物细胞优选 为水稻、大麦、小麦、玉米、高粱或甘蔗细胞。本发明的水稻叶形控制基因SALl (SEQ ID NO. 1)是从水稻叶片倾角减小突变体 sail中分离出来，并通过遗传分析确定控制突变体的突变性状。水稻叶片倾角减小突变体sail是通过大量筛选水稻T-DNA插入突变体库获得，通 过对TO代，Tl代和突变体与野生型水稻正反杂交实验，证明该突变体受一对显性核基因控 制，野生株与突变株的外形如图1、图2所示。控制水稻叶倾角的SALl基因的克隆方法如下1、SALl基因的分子定位为了分离SALl基因，本发明首先建立了一个大的多态性高的F2定位群体，由sail 纯合体(粳稻品种中花11)为母本，选用籼稻品种9311为父本，杂交获得的F2群体中的隐 性个体组成，再通过图位克隆的方法，并利用SSR分子标记对SALl位点进行初步定位，将 其初步定位在第6染色体的长臂上，并介于RM454和RM162两SSR标记之间。然后通过对 RM454和RM162两标记之间的BAC序列进行分析，发展了新的STS标记，将SALl精确定位于 PAC克隆AP003623和AP003612之间重叠的区段上STS标记P5和P15之间IlOKb的范围之 内(图3)，随后发现突变体与T-DNA插入共分离，随即用T-DNA标签法分离SALl基因。2、T-DNA插入与突变表型的共分离检测通过PCR扩增对Tl代和T2代植株的HPT基因进行分子检测，发现T-DNA插入与 突变表型共分离，表明sail突变由T-DNA插入引起，可由T-DNA标签法分离SALl基因。3、T-DNA标签法分离SALl基因利用TAIL-PCR技术分离T-DNA插入位点处的侧翼序列，发现T-DNA插入到第6染 色体长臂上的PAC克隆AP003612的36kb处，与SALl基因定位的结果是一致的。根据BAC 克隆P0457B11序列的基因注释信息(NCBI)，T-DNA没有插入到基因内部，而是插入基因之 间，与T-DNA插入位点处下游相隔4. Ikb处有一 P450基因，推测为SALl的侯选基因(图 4)。4、定量RT-PCR技术鉴定sail突变体通过定量RT-PCR检测sail突变体和中花11野生型叶片中上述P450基因的表达 情况，发现P450基因在sail突变体的表达量比野生型显著增加(图5)，表明T-DNA插入 造成了该P450基因的超量表达，引起了 sail突变体的功能获得型突变。该P450基因即为 SALl基因。5、SALl基因的鉴定和功能分析
通过转基因技术，对SALl基因进行过量表达，结果表明本发明获得了比野生型叶 片倾角减小的转基因植株，即能够重现突变体表型(图7，图8)，证明了本发明正确克隆了 SALl基因。本发明利用水稻叶片倾角减小突变体，通过图位克隆结合T-DNA标签法克隆到了 SALl基因，该基因编码一个P450蛋白。通过对SALl基因的功能研究，进一步阐明了植物特 别是禾本科植物叶片倾角建成的遗传机制及其作用机理，为构建理想株型及创建水稻新种 质打下基础。通过植物基因工程技术将SALl基因在水稻中特定组织部位或特定时期异位表 达，从而通过调控SALl基因的时空表达模式及表达量达到调控水稻叶片倾角而改良水稻 株型的目的。此外，可以利用植物基因工程技术超量表达SALl基因的同源基因在其他禾本 科作物(如大麦、小麦、玉米、高粱、甘蔗等)中特定组织部位或特定时期异位表达，改良作 物的株型，提高植株对光合作用的利用效率，从而达到增产的目的。
图1是水稻中花11野生型和叶片倾角突变体sail的表型；箭头所示为叶倾角；左 面的植株是野生型，右面的植株是sail突变体；图2是水稻中花11野生型和叶片倾角突变体sail的倒二叶的叶角表型；箭头所 示为叶倾角；左面的植株是野生型，右面的植株是sail突变体；图3是SALl基因在水稻第6染色体上的精细定位；图4是SALl基因的T-DNA插入示意图；图5是定量RT-PCR检测sal 1突变体中P450基因表达；图 6 是 pCAMBI1300-35S-SALl-N0S 载体图谱；图7是SALl超表达实验TO转基因水稻的表型；左面的植株为空载体对照植株，右 面的植株是35S-SAL1转基因超表达植株；箭头所示为叶倾角；图8是SALl超表达实验TO转基因水稻倒二叶的叶角表型；左面的植株为为空载 体对照植株，右面的植株是35S-SAL1转基因超表达植株；箭头所示为叶倾角；图9是转基因植株的定量RT-PCR检测；WT为中花11野生型，CK为空载体对照植 株，35S-SALl(2-2)和35S-SAL1 (2-10)为两个独立的转化植株；
具体实施例方式为了理解本发明，下面以实施例进一步说明本发明，但不限制本发明。实施例1 SALl基因的克隆1、水稻材料/JcfS (Oryza sativa ssp. zonghua 11)突变体 sail (small angle leaf!),原女台里予 生型材料为粳稻品种中花11 (来自中国农科院)(图1，图2)。2、分析和定位群体纯合sail突变体和原始野生型品种9311进行杂交，Fl代自交，得到F2群体，并 从中选出350个隐性个体(叶片倾角与野生型相似)作为定位群体。在抽穗初期每株取1 克左右的嫩叶，用来提取总DNA。
3、SALl基因的初步定位和精细定位采用水稻微量DNA的快速提取方法从水稻叶片中提取用于基因定位的基 因组DNA，该DNA抽提的方法为CTAB法(参照Liu等，A genome-wide analysisof wide compatibility in rice and the precise location of the S5 locus in the molecularmap, Theor Appl Genet，1997 :809_814)。取大约 IOOmg 水稻叶片，经液氮冷冻， 在直径5cm的小研钵中磨成粉状，转移到2ml离心管里提取DNA，获得的DNA沉淀溶解于 120 μ 1超纯水中。每一个PCR反应用1. 2 μ 1的DNA样品。在SALl基因的初步定位阶段，对由93个F2个体组成的小群体进行SSR分析，根据 公布的粳稻和籼稻创建的分子遗传图谱，选取近似均勻分布于各条染色体上的SSR引物， 根据已知的反应条件进行PCR扩增，经4%琼脂糖凝胶电泳分离和浪化乙锭(EB)染色，检测 PCR产物的多态性，将SALl初步定位在第6号染色体长臂RM454和RM162标记之间。在精细定位SALl基因时，通过对PAC克隆ΑΡ003623和ΑΡ003612的序列分析，发 展了 12个STS标记，对F2群体中选出的350个野生型中花11表型一致的个体进行STS分 析。将SALl精确定位于STS标记Ρ5和Ρ15之间，位于PAC克隆ΑΡ003623和ΑΡ003612重叠 区IlOkb的范围之内(图3)。随后发现，sail突变体与T-DNA插入共分离，随即利用T-DNA 标签法分离SALl基因。STS标记引物序列P5F 5' -GTCGGAATTGTAAATAGCAGAGG-3，(SEQ ID N0. 3)R 5' -GCAGTGGATAAATCTGAAGCG-3，(SEQ ID N0. 4)P15F 5' -TGTGAGTGTGGCGACGAAAG-3，(SEQ ID N0. 5)R 5' -AAGCTAAGCTACTTCCTACTACG-3，(SEQ ID N0. 6)4、T-DNA插入与突变表型的共分离检测为了检测sail突变体T-DNA插入与其突变表型是否共分离，本发明从20株Tl代 单株中抽提总DNA用作PCR反应模板，DNA抽提采用CTAB微量提取法。检测了 Tl代20个 单株的HPT基因，其中表现为野生型的植株均没有HPT扩增条带，而表现为sail突变体的 植株均有HPT目的条带扩出，Tl代单株收获种子，随即选取6个单株播种T2代，后代中2个 纯合突变株系所有单株均可扩增出HPT目的条带，而发生分离的4个单株中，凡是表现sal 1 突变体的单株均可扩增出HPT目的条带，而表现野生型的单株均无目的条带扩出。这表明 sail突变体是由于T-DNA单位点插入造成的显性突变体，可用T-DNA标签法分离SALl基 因。检测HPT基因所用的引物序列HptII-F :5，-CAGAAGAAGATGTTGGCGAC-3，(SEQ ID N0. 7)HptII-R :5，-ATGTCCTGCGGGTAAATAGC-3，(SEQ ID N0. 8)
5、T-DNA标签法分离T-DNA插入位点的侧翼序列利用 TAIL-PCR 技术(参照 Liu 等 Efficient isolation and mapping ofArabidopsis thaliana T-DNA insert junction by thermal asymmetric interlaced PCR，Plant J, 1995，8 =557-463所示方法和步骤)分离了 sail突变体T-DNA插入位点的
6侧翼序列。经过序列分析发现，该侧翼序列定位于水稻第6染色体上，对应NCBI克隆登陆 号为AP003612，与SALl基因的精细定位结果一致，根据RiceAutotation Systemftittp:// RiceGAAS. dna. affrc. ro. id)的预测，发现在插入位点下游4. 1Kb处有一编码P450蛋白的 基因。本发明将该基因命名为SAL1。该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，它包括5 个外显子和4个内含子，T-DNA插入在起始密码子前4083bp处(见图4)。Tail-PCR技术分离得到的sail突变体T-DNA插入位点的侧翼序列如下TCGTTTGGCCCAGAAGTACACAACCGCGCGCGATGATTGACCGGCCGGCTGCATATCGCTGCCGACGTC AACGTCGCGAGCTAAGCTAATAAGCTAGTAGCCACCACACGCACTATCACAAAATATGTGATGCATTGTGTACATTT GCAGACTAAAATTGCCTACGTCTCTAAAATAACACCAGAAACTCGTGGAATATATAACAACATAGTCCATATATCTG TGATAACTAGCTTTCTTGGTTGAGGCCGAATTAATCCTCTCTTGACCAATCATCACGGACGCGTACATATATAGAAG AATCATACTTGTACACGATATATATTGGACACAGACGCATGCCTGTAACCACCGTTCTGATGGACGCTGCTAGCTAA CCTATACCCGTGTCTGTGTGATGAACGTTAACCCCGTATGTAA(SEQ ID NO. 15)实施例2 =SALl基因的定量RT-PCR分析定量RT-PCR的实验具体步骤参照Huang等的实验方法进行(Huang等， Down-regulation of SLIENT INFORMATION REGULAT0R2_related histonedeacetylase gene, OsSRTl, induces DNA fragmentation and cell death in rice, PlantPhysiol, 2007 :1508-1519)。具体步骤如下(I)RNA材料准备挑选约100株sail纯合型单株的种 子和100株野生型中花11的种子播种于小钵中。播种15天后每份样品取1克左右的新鲜 叶片提取RNA，每份RNA样品各取3个生物学重复。(2)RNA样品抽提及反转录方法如下 用Axygen公司的Trizol试剂分别提取总RNA。每份材料各取IygS RNA用于逆转录。 逆转录过程如下在0. 2μ 1的离心管中加入1μ g总RNA, 1 μ 1 oligo(dT)18(Promega公 司)，加无RNA酶水至8 μ 1，在70°C水浴变性5分钟，冰上冷却5分钟，稍离心后加入4 μ 1 的 5 X First strand Buffer (Promega 公司)、5 μ 1 的 2. 5mM dNTPs (Takara 公司)、1 μ 1 RNase inhibitor (Takara 公司)及 1 μ 1 MMLV Reverse Transcriptase (Promega 公司)， 轻轻混勻，42°C反应1小时，70°C5分钟，终止反应。逆转录产物用于定量PCR扩增。(3)定 量RT-PCR方法如下在LightCycler Systems (Roche,瑞士)上进行，采用2_Δ Δετ相对定 量的方法进行表达量的比较。20yL反应体系包含1μ反转录产物。反应参数设置如下 950C /IOsec, (95°C /5sec，55°C /10sec，745°C /lOsec)，45cycles。所有定量 RT-PCR 引物 如下定量RT-PCR弓丨物序列为UBQ F :ACCAGGACAAGATGATCTGC, (SEQ ID NO. 9)R TGATCTTCTTCTTGGGCCTC ； (SEQ ID N0. 10)SALl F :ATCTCAGCCGTCCAATTAGC, (SEQ ID NO. 11)R:TGTCACTATGCACACAACGG(SEQ ID NO. 12)定量RT-PCR结果如图5，sail突变体中P450基因的表达量比野生型中花11的表 达量显著增加，表明T-DNA插入增强了 sail突变体中这一 P450基因的表达，为一功能获得 型突变，这一现象与sail突变体为显性的表型是吻合的，该P450基因即为SALl基因。
实施例3 转基因实验1、超量表达载体的构建由于sail突变体是一功能获得型突变，所以本发明构建SALl基因的超量表达载 体验证SALl基因的功能。设计一对分别带BamHI和PstI酶切位点的引物扩增SALl基因 含ORF的cDNA序列，电泳检测后切胶回收，回收产物用BamHI和PstI酶切，连接至同样酶切 的pCAMBIA-35S-N0S载体上，构建后的载体结构图为pCAMBIA_35S-SALl_N0S (图6)，把构建 好的载体电转入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) EHA105 (购自 CAMBIA 公司，http // www, cambia. org/daisy/cambia/home. html)菌株中，将含有载体 pCAMBIA_35S-SALl_N0S 的菌株命名为35S-SAL1。扩增ORF序列的引物序列为SALl-BamHI :CGACCGGATCCCTCTGCGTTTGTG (SEQ ID NO. 13)SALl-PstI :GCCACCTGCAGAGCCTTTTGTTAG(SEQ ID NO. 14)2、遗传转化采用农杆菌介导的遗传转化方法(Hiei等，Efficient transformation of rice(Oryza sativa L. )mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundariesof T-DNA. Plant J, 1994,6 271-282)利用中花11成熟胚诱导的愈伤组织，经 过诱导培养基培养3周后，挑选生长旺盛愈伤用作转化的受体，将PCAMBIA-35S-N0S空载体 和35S-SAL1载体的EHA105菌株侵染水稻愈伤，在黑暗、25°C条件下共培养3天后，在含有 40mg/L Hygromycin的筛选培养基上培养。筛选抗性愈伤在含有50mg/L预分化培养基上培 养10天左右。将预分化的愈伤转至分化培养基上在光照条件下培养。一个月左右得到抗 性转基因植株。对植株进行鉴定和连续的观察，发现转空载体的转基因植株表型与野生型 相比不发生变化，而转35S-SAL1菌株的阳性转基因植株表现出与sail突变体同样的表型， 即叶倾角明显减小，附图7，图8。3、转基因植株的分子鉴定为鉴定转35S-SAL1植株的表型突变确实由SALl基因的超量表达引起，选取1株 空载体转化植株和2株独立的转35S-SAL1基因阳性株进行定量RT-PCR检测，RNA抽提及 定量RT-PCR的步骤和方法参加事实例2，转空载体植株的SALl基因表达与野生型相比没 有发生变化，而2株转35S-SAL1的转基因阳性株SALl基因的表达量比野生型均显著增加 (图9)，结果表明，SALl基因的超量表达确实引起sail突变表型，使叶片倾角减小。本发明所描述的基因、蛋白及其应用的方法已经通过具体的实施例进行了描述。 本领域技术人员可以借鉴本发明的内容适当改变原料、工艺条件等环节来实现相应的其它 目的，其相关改变都没有脱离本发明的内容，所有类似的替换和改动对于本领域技术人员 来说是显而易见的，都被视为包括在本发明的范围之内。
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权利要求
一种培育水稻减小叶倾角的方法，该方法包括用含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的表达载体转化水稻细胞，再将转化的细胞培育成植株，表达载体为含有基因序列SEQ ID NO.1的载体pCAMBIA 35S SAL1 NOS。
全文摘要
本发明涉及一种水稻叶片倾角控制基因SAL1的应用，水稻叶片倾角控制基因SAL1具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，其编码的P450蛋白质具有SEQID NO.2所示的氨基酸序列。本发明还涉及含有基因SAL1的质粒、植物表达载体和宿主细胞。本发明还公开了培育植物叶倾角减小的方法用含有基因SAL1的植物表达载体转化植物细胞，再将转化的植物细胞培育成植株。该方法能改变植物叶片的倾角，改良植物株型，最终能提高产量。
文档编号A01H5/00GK101921777SQ20101026763
公开日2010年12月22日 申请日期2010年8月31日 优先权日2010年8月31日
发明者汪得凯, 陶跃之 申请人:浙江省农业科学院