专利名称：利用小孢子培养和无性克隆技术选育甘蓝型油菜隐性核不育系的方法
技术领域：
本发明涉及甘蓝型油菜育种领域，具体涉及一种利用小孢子培养和无性克隆技术 选育甘蓝型油菜隐性核不育系的方法。
背景技术：
甘蓝型油菜游离小孢子的分离技术简单，通过游离小孢子培养技术获得胚状体和 再生苗的效率高，而且小孢子培养是研究花粉细胞分化条件、胚胎发生和形态建成机理的 一种较为理想的方法，因此该技术一直受到各国油菜育种家的普遍青睐。多年来，许多学者 对小孢子培养的培养基成份、蕾的大小、小孢子培养过程中温度的变化、提高再生苗频率等 诸方面进行了广泛的研究，使得小孢子培养技术逐步成熟并得到了广泛的应用。在常规杂交育种中，获得稳定遗传的后代或株系一般要经过5 8代性状选择。 如果对Fl代植株进行小孢子培养，再生植株为单培体，经染色体加倍后产生纯合二倍体单 株(double haploid，简称DH)，这种二倍体单株各种遗传性状已纯合，不会发生分离，因此 可以快速使性状纯合；在小孢子培养形成的DH系后代中，没有显性基因掩盖隐性基因表现 的干扰，有利于对隐性基因的筛选；DH系后代的性状理论上是按照配子体基因型(花粉基 因型)分离的，即以2n分离，而F2代的性状理论上是按照胞质体基因型分离的，即以4n分 离，为了得到目标性状单株，前者群体远远小于后者，因此甘蓝型油菜小孢子培养技术在许 多油菜育种计划中得到应用。20118A是上海市农业科学院孙超才研究员于1997年选育的一种新的隐性细胞核 雄性不育，其不育株花药空瘪，无花粉，套袋自交不结实，且不育性稳定，不受环境条件的影 响。通过普通遗传学研究证明20118A为隐性上位互作遗传模式，即其不育性受两对重叠隐 性不育基因(a和b)与一对隐性上位抑制基因(rf)互作控制，隐性上位基因纯合时对隐性 不育基因起作用。不育系可通过兄妹交保持，不育株的基因型有纯合型aabbRfRf和杂合型 aabbRfrf两种，三对基因为隐性(aabbrfrf)时可作临保系，与纯合型不育系杂交能够生产 全不育群体，然后利用全不育系与恢复系杂交生产杂交种(参见
图1)。目前由该系统选育 的三个国审双低杂交油菜品种“沪油杂1号”、“向农03”和“沪油杂4号”正在生产上大面 积的推广，说明该不育系统具有广阔的应用前景与生产利用价值。但是由于隐性核不育系是受到三对基因控制(aabbRfRf)，分离群体大，基因型多 且复杂，导致测交与测交种鉴定的工作量大，选育难度很大。利用常规育种技术，隐性核不 育系是以隐性核不育纯合两型系的形式应用于杂交种生产的，即隐性核不育系需要借助于 纯合两型系兄妹交来繁殖和保存(图2)，为了使得纯合两型系中的不育株和可育株遗传背 景一致，必须经过5代以上兄妹交，因此导致其选育周期长，而且在生产全不育系时需要在 母本行中拔除纯合两型系中50%的可育株，影响全不育系的产量与质量。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种利用甘蓝型油菜小孢子培养技术选育 隐性核不育系的方法，通过甘蓝型油菜小孢子培养技术，寻找一种简单、可行、高效技术能 够快速获得隐性核不育系(基因型为aabbRfRf)。由于通过甘蓝型油菜小孢子培养技术获得的DH隐性核不育株不能自交保存，需 借助于甘蓝型油菜无性克隆技术保存并大量繁殖所得到的DH不育株。因此，本发明利用无 性克隆技术，保存与扩繁依据本发明技术方案得到的DH隐性核不育系，直接将其用于隐性 核不育杂交油菜育种中，从而摆脱了原有隐性核不育三系法制种时对隐性核不育纯合两型 系的依赖，同时减少了全不育系生产时母本行中拔除纯合两型系内可育株的步骤，简化了 生产步骤，提高了全不育系种子的纯度。本发明所述的利用小孢子培养技术选育甘蓝型油菜隐性核不育系的方法，首先以 优良的品种/系与隐性核不育系或临保系杂交，获得F1代；然后以甘蓝型油菜小孢子培养 技术对F1代植株的游离小孢子进行诱导培养而获得DH株系；再以表现为不育的DH株系与 临保系测交，测交种为100%不育，则对应的不育DH株系为本发明所述的隐性核不育系 ’然 后借助于无性克隆技术保存并扩繁不育的DH株系，应用于杂交种生产。所述方法具体包括以下步骤a、以F1代植株为供体，在花蕾期，每次从油菜花序上取3 4mm大小的蕾，表面 消毒后用无菌水清洗3次；加入B5培养液研磨，用40 μ m尼龙网过滤，滤液经过IOOg离心 5-8min，吸去上清液后，再向离心管中加含秋水仙碱的NLN-16培养液密封，置于32°C的恒 温箱中暗培养48h，然后重复上述步骤离心，吸去上清液，加入NLN-13培养液分装到培养皿 中，密封，置于25°C的恒温箱中暗培养，当肉眼可见到胚状体后转到25°C摇床上继续暗培 养1-2周。b、将上述a步中的胚状体转移到固体B5培养基上，在10°C的光照培养室中诱导形 成小植株，然后置于25°C的光照培养室中培养，并将每个不同基因型的小植株扩繁多个拷 贝，以保证每个基因型都能存活。C、将上述b步中的小植株分不同基因型种植到田间，到花期，将加倍成功的不育 DH株系与隐性核不育临保系测交。d、将上述c步中测交种进行鉴定，若测交种为全部不育，则对应的单株即为本发 明的隐性核不育系。f、将上述d步中鉴定的优良隐性核不育系进行无性克隆，并扩繁得到生产上需要 的大量不育株，用于生产全不育系，进而生产商用杂交种。由于甘蓝型油菜种子的繁殖系数为1 1000左右，所以利用无性克隆扩繁不育株 的方法无论是在理论上还是实践中都有可行性，利用小孢子培养和无性克隆技术快速获得 甘蓝型油菜隐性核不育系在甘蓝型油菜隐性核不育杂交育种体系中的应用价值很高。所述F1代是以优良的品种/系为母本，以隐性核不育临保系为父本杂交而成。所述优良的品种/系母本为沪油15，系上海市农业科学院孙超才研究员选育而 成，是上海市第一个通过国家油菜品种审定和获得国家植物新品种保护的甘蓝型双低油菜 品种，被国家科技部和农业部列为国家级成果重点推广品种之一，含油率为42. 43%，芥酸 含量为0. 38%，硫苷含量为19. 01 ymol/g，农艺性状优良。
所述隐性核不育临保系为临保系M-6029，基因型为aabbrfrf，可育，与隐性核不 育20118A(aabbRfRf)杂交，其后代基因型为aabbRfrf，仍不育，但是该不育性只能保持 一代，其后代会发生育性分离，故称基因型aabbrfrf的M-6029为甘蓝型油菜隐性核不育 20118A的临保系，系上海市农业科学院孙超才于1999年在隐性核不育20118A的测交组合 中通过连续的自交，测交选育而成。利用上述隐性核不育临保系M-6029对不育株的DH株系进行基因型鉴定。其中，上述方法中所用到的B5培养液为B5基本组份+130g蔗糖/L ；固体B5培养 基为B5基本组份+25g蔗糖+7g琼脂粉/L ；NLN-13培养液为NLN基本组份+130g蔗糖/L ； NLN-16培养液为NLN基本组份+160g蔗糖+IOOmg秋水仙素/L。B5基本组份和NLN基本组 份的配方如下表1所示。 表IB5基本组份和NLN基本组份的配方(mg/L)
名称B5NLN大 I=TKNO3 CaCl,2H202500 150125里MgS04.7H20250125元KH2PO4-125素(NH4)2SO4134-NaH2P04'2H20150-(20 X )Ca(NO3)2 ·4Η20-500铁盐FeS04.7H2027.827.8(20 X )Na2.EDTA37.337.3微KI0.750.83I=IH3BO336.2里MnS04.H201017.37元ZnSOWH2O210.59素Na2Mo04.2H200.250.25CaS04'5H200.0250.025(200X )COC12.6H200.0250.025肌醇0.10.1烟酸15有廿氨酸 盐酸硫氨(Bi)102 0.5机盐酸吡哆素(B6)10.5物 (200 X )丝氨酸 谷胱甘肽 叶酸 生物素 谷氨酸胺-0.1 0.03 0.5 0.05 0.8
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本发明与原有隐性核不育系(原有的隐性核不育系是以隐性核不育纯合两型系 的形式应用于杂交种生产的)的选育相比具有以下优势1.与原有隐性核不育系的选育相比效率更高从原有的以优良的品种(系)与 隐性核不育临保系或不育系杂交，获得F1代，以基因型为AaBbRfrf为例，利用常规的育种 方法自交，从F2代植株中获得不育系的概率为1/64 (参见表2)，而利用甘蓝型油菜小孢子 技术选育不育系，其DH后代实际上为8种雄配子基因型中的一个，故不育系的出现频率为 1/8，因此选育效率更高。表2F1自交后代的表现型
权利要求
一种利用小孢子培养和无性克隆技术选育甘蓝型油菜隐性核不育系的方法，其特征在于，包括以下步骤a、以F1代植株为供体，在花蕾期，每次从油菜花序上取3～4mm大小的蕾，表面消毒后用无菌水清洗3次；加入B5培养液研磨，用40μm尼龙网过滤，滤液经过100g离心5 8min，吸去上清液后，再向离心管中加含秋水仙碱的NLN 16培养液密封，置于32℃的恒温箱中暗培养48h，然后重复上述步骤离心，吸去上清液，加入NLN 13培养液分装到培养皿中，密封，置于25℃的恒温箱中暗培养，当肉眼可见到胚状体后转到摇床上继续培养1 2周；b、将上述a步中的胚状体转移到固体B5培养基上，在10℃的光照培养室中诱导形成小植株，然后置于25℃的光照培养室中培养，并将每个不同基因型的小植株扩繁多个拷贝；c、将上述b步中的小植株分不同基因型种植到田间，到花期，将加倍成功，且表现为不育的DH株系与隐性核不育临保系测交；d、将上述c步中测交种进行鉴定，若测交种为全部不育，则对应的单株即为隐性核不育系。
2.根据权利要求1所述的利用小孢子培养和无性克隆技术选育甘蓝型油菜隐性核不 育系的方法，其特征在于，所述F1代是以优良的品种/系与隐性核不育系或临保系杂交而 成。
3.根据权利要求2所述的利用小孢子培养和无性克隆技术选育甘蓝型油菜隐性核不 育系的方法，其特征在于，所述优良的品种/系为沪油15。
4.根据权利要求2所述的利用小孢子培养和无性克隆技术选育甘蓝型油菜隐性核不 育系的方法，其特征在于，所述隐性核不育临保系为临保系M-6029，基因型为aabbrfrf，可育。
5.根据权利要求2所述的利用小孢子培养和无性克隆技术选育甘蓝型油菜隐性核不 育系的方法，其特征在于，利用隐性核不育临保系M-6029对表现为不育的DH株系进行基因型鉴定。
6.根据权利要求1所述的利用小孢子培养和无性克隆技术选育甘蓝型油菜隐性核不 育系的方法，其特征在于，通过无性克隆技术对所获得的隐性核不育系进行永久保存，并扩 繁得到生产上需要的大量不育株，用于生产全不育系，进而生产商用杂交种。
全文摘要
本发明公开了一种利用小孢子培养和无性克隆技术选育甘蓝型油菜隐性核不育系的方法，通过优良的品种/系与隐性核不育不育系或临保系杂交，获得F1代；然后以甘蓝型油菜小孢子培养技术对F1代植株的游离小孢子进行诱导培养，从而获得DH株系；再以表现为不育性状的DH株系和临保系测交，测交种为100％不育，对应的不育DH株系即为本发明所述的隐性核不育系，然后利用无性克隆技术可以快速获得大量用于全不育生产的不育系植株。本发明可以快速获得遗传背景稳定优良的不育系并在甘蓝型油菜隐性核不育杂交育种上得到应用。
文档编号A01H4/00GK101946715SQ20101027467
公开日2011年1月19日 申请日期2010年9月8日 优先权日2010年9月8日
发明者周熙荣, 周音, 孙超才, 庄静, 张智奇, 李延莉, 杨立勇, 王伟荣, 蒋美艳, 顾龙弟 申请人:上海市农业科学院