专利名称：2-o-葡糖糖苷抗坏血酸在制备性别控制精液中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及2-0-葡糖糖苷抗坏血酸的新用途，具体地说，涉及2-0-葡糖糖苷抗坏 血酸在制备性别控制精液中的应用。
背景技术：
2-0-葡萄糖苷抗坏血酸(AA-2G)是抗坏血酸(VC)的一种衍生物，其是将抗坏血 酸2位上的羟基用葡萄糖基取代后形成的。由于2位上有葡萄糖基掩蔽，所以AA-2G不易 发生氧化，在水溶液中特别稳定；并且AA-2G没有直接还原性，但在酶的作用下能很快的释 放出高活性的VC，VC能很快与自由基反应从而降低脂质过氧化作用。目前，AA-2G作为抗氧化剂在化妆品、准药品和食品等诸多领域具有广泛应用，且 在繁殖领域也应用于家畜精子的冷冻保存。性别控制(sex control)技术，即X/Y精子分离技术，是利用X、Y精子中DNA 含量的差异，借助特异性染色剂染色，然后根据发出的荧光强度，通过计算机预测精子类 别，给液滴附加电荷，根据静电原理，将X、Y精子分离开来(例如，Johnson LA, Pinkel D. Modificationof a laser-based flow cytometer for high resolution DNA analysis ofmammalian spermatozoa. Cytometry 1986，7 :268 273)。该技术在畜牧生产中意义重 大，该技术可以按照生产需求人为地控制动物后代的性别，快速繁育高产家畜，加速家畜育 种进程，提高畜牧业的经济效益，促进畜牧业发展。目前还没有将AA-2G应用于制备性别控制精液的制备过程中的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供2-0-葡糖糖苷抗坏血酸的新用途。为了实现上述目的，本发明提供2-0-葡糖糖苷抗坏血酸(AA-2G)在制备性别控制 精液中的应用，优选为2-0-葡糖糖苷抗坏血酸在制备哺乳动物的性别控制精液中的应用。 所述哺乳动物优选为家畜，所述家畜优选为猪或羊。本发明中所述性别控制精液是将精子进行性别分离制得的单一性别精液。其是 通过X/Y精子分离技术，利用X、Y精子中DNA含量的差异，借助特异性染色剂染色，然后根 据发出的荧光强度，通过计算机预测精子类别，然后给液滴附加电荷，根据静电原理，将X、Y 精子分离开来，从而对精子进行性别分离，制得单一性别精液。其具体操作过程如下1、取一定量原精液，用H印es缓冲液稀释至200X 106精子/mL，然后加入终浓度为 0. llmM H33342 及终浓度为 150 250 ii MAA-2G，在 34°C水浴中染色 45min ；2、用含有4% (重量体积比g/ml)提纯卵黄和5% (重量体积比g/ml)食品红的 Hepes缓冲液进一步稀释至100 X 106精子/mL ；其中，添加食品红的目的是减弱死精子上的H33342荧光，使这部分精子在分离过 程中被弃除，提高分离精子的活力；3、然后用SX-MoFlo流式细胞分离仪进行精子分离和回收，对收集得到的单一性别精子进行检测。其中，AA-2G的终浓度优选为200 u M。本发明的优点在于，本发明将AA-2G应用于性别控制精液的制备过程中，能够抑 制制备过程中产生的大量的自由氧；并且由于AA-2G在水溶液中稳定，因此能最大限度地 避免精子在制备过程中因分离和离心等处理过程造成的损伤；从而能够明显提高精子活 力、顶体完整性、质膜完整性等精子质量参数，从作用效果和作用时间上都明显优于本领域 中现有的抗氧化剂。
图1为本发明实施例3中不同抗氧化剂对猪性别控制精液的顶体完整性的影响 (17°C )。图2为本发明实施例3中不同抗氧化剂对猪性别控制精液的质膜完整性的影响 (17°C )。
具体实施例方式以下通过具体实施例来进一步说明本发明，但不用来限制本发明的范围。(注实 施例中的百分数均为重量体积比，单位g/ml)实施例11、取一定量猪的原精液，用H印es缓冲液稀释至200X 106精子/mL，然后加入终浓 度为 0. llmM H33342 及终浓度为 200 u M AA-2G (0. 068mg/ml)，在 34°C水浴中染色 45min ；2、用含有4% (g/ml)提纯卵黄和5%食品红(g/ml)的H印es缓冲液进一步稀释 至 100X 106 精子 /mL ；3、然后用SX-MoFlo流式细胞分离仪进行精子分离和回收，对收集得到的单一性 别精子进行检测，制得猪性别控制精液。实施例21、取一定量猪的原精液，用H印es缓冲液稀释至200 X 106精子/mL，然后加入终浓 度为 0. llmM H33342 及终浓度为 250 u M AA-2G(0. 085mg/ml)，在 34°C水浴中染色 45min ；2、用含有4% (g/ml)提纯卵黄和5%食品红(g/ml)的H印es缓冲液进一步稀释 至 100X 106 精子 /mL ；3、然后用SX-MoFlo流式细胞分离仪进行精子分离和回收，对收集得到的单一性 别精子进行检测，制得猪性别控制精液。用荧光显微镜检测制得的猪性别控制精液，结果表明，精子的顶体完整性、质膜完 整性均良好。实施例3与实施例1方法相同，只是将AA-2G的终浓度调整为150 uM(0. 051mg/ml)，制得猪 性别控制精液。用荧光显微镜检测制得的猪性别控制精液，结果表明，精子的顶体完整性、质膜完 整性均良好。实施例4
用羊的原精液代替猪的原精液，按照实施例1方法，制得羊性别控制精液。用荧光显微镜检测制得的羊性别控制精液，结果表明，精子的顶体完整性、质膜完 整性均良好。实施例5为了进一步说明本发明的效果，根据实施例1的猪性别控制精液的制备方法，进 行了 8组试验，分别在步骤1中染色前添加不同的抗氧化剂，其中，对照组不添加任何抗氧 化剂、也不添加精清；P组不添加任何抗氧化剂、只添加10%精清；A组添加AA-2G、不添加 精清；E组添加维生素E、不添加精清；G组添加谷胱甘肽(GSH)、不添加精清；P+A组添加 AA-2G及10%精清；P+E组添加VE及10%精清；P+G组添加GSH及10%精清。抗氧化剂的 用量如表1所示，各组添加药品用等量hepes缓冲液进行溶解，其余步骤均与实施例1方法 相同。其中，GSH及VE的剂量是在参考现有文献的基础上，通过预实验确定得到的；在该剂 量下，GSH及VE对猪精子的保护效果最好，当剂量大于或小于该值时，GSH及VE对猪精子的 保护效果均比该值时差。将制得的猪性别控制精液在37°C条件下，荧光显微镜检测精子活力、顶体完整性、 质膜完整性。结果如表1、图1 2所示。表1不同抗氧化剂对猪精子活力及存活时间的影响
权利要求
2 O 葡糖糖苷抗坏血酸在制备性别控制精液中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用是指2-0-葡糖糖苷抗坏血酸在 制备哺乳动物的性别控制精液中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述哺乳动物为家畜。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述家畜为猪或羊。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的应用，其特征在于，所述性别控制精液是将精子 进行性别分离制得的单一性别精液。
全文摘要
本发明提供了2-O-葡糖糖苷抗坏血酸在制备性别控制精液中的应用。本发明的优点在于，本发明将AA-2G应用于性别控制精液的制备过程中，能够抑制制备过程中产生的大量的自由氧；并且由于AA-2G在水溶液中稳定，因此能最大限度地避免精子在制备过程中因分离和离心等处理过程造成的损伤，从而能够明显提高精子活力、顶体完整性、质膜完整性等精子质量参数，从作用效果和作用时间上都明显优于本领域中现有的抗氧化剂。
文档编号A01K67/02GK101971797SQ20101027792
公开日2011年2月16日 申请日期2010年9月9日 优先权日2010年9月9日
发明者夏春梅, 扬升, 田见晖 申请人:中国农业大学