专利名称：一种简化无核葡萄胚挽救的方法
技术领域：
本发明涉及一种简化无核葡萄胚挽救的方法，有效简化培养步骤，加速了成苗过程。
背景技术：
胚挽救技术即配制一种培养基——成分类似于胚囊环境中周围组织供给胚的营 养成分，在合子胚败育之前进行离体培养，使即将败育的胚继续发育，最终萌发成完整植 株。这项技术实现了常规杂交育种所无法得到的无核植株。自1902年HaberIandt根据细胞 理论提出植物细胞“全能性”假设以来，植物胚培养得以快速发展。1904年Harming第一次 成功地用萝卜和辣根菜的胚在人工培养基上做了系统性植物胚培养。而1929年，Laibach 利用胚培养挽救了宿根亚麻和奥地利亚麻的杂交胚，为离体胚培养解决种属间杂交不育奠 定了基础。20世纪30-40年代，该项技术开始广泛应用于果树的胚挽救研究上。迄今已在 柑桔、葡萄、苹果、梨及核果类的杏、梅、桃、樱桃等多种果树树种上获得成功。胚挽救技术的 应用不仅克服了胚败育问题，还大大缩短了育种周期，对推动果树育种发挥了重要作用。有关无核葡萄胚挽救的研究已有很多报道，最早始于80年代初。如1982年， Ramming等首次报道了利用改良White培养基进行无核葡萄胚的胚珠培养，并获得了 2株实 生苗。以后田莉莉等、郝燕等、王飞等、潘学军等、刘小宁等对无核葡萄进行了胚挽救，并获 得了幼苗，但以上所有挽救培养过程中均需依次设计三种培养基——发育培养基、萌发培 养基、成苗培养基，才能最终挽救成功。到目前为止，自始至终仅用一种培养基进行无核葡 萄胚挽救即可成功获得幼苗的还未见报道。
发明内容
鉴于上述技术的现状，本发明提供了一种简化无核葡萄胚挽救的方法，旨在将发 育培养基、萌发培养基、成苗培养基合为一体的简化培养基的方法，将会大大方便操作过 程，既简化培养步骤，又加速成苗过程。这对于种质创新、远缘杂交、三倍体育种、杂交不亲 和、缩短育种周期、品种改良能保证高效率的获得无核葡萄杂交后代，为种质创新、远缘杂 交、三倍体育种方面提供了 一种新的技术平台。本发明的一种简化无核葡萄胚挽救的方法，其方法步骤包括1、综合培养基的制备，选取下述浓度配比的原料硝酸钾0. 095%、硝酸铵0. 072%、磷酸二氢钾0. 0068%、硫酸镁0. 0185%,氯化 钙 0. 0166%、硼酸 0. 0003%、硫酸猛 0. 00223%、硫酸锌 0. 001%、钼酸钠 0. 000025%、硫 酸铜0. 000008%、烟酸0. 00005%、盐酸硫胺素0. 00005%、盐酸吡哆醇0. 00005%、甘氨酸 0. 0002%、柠檬酸铁0. 001%,GA3O. 00001% -0. 0003%,IAA 0. 00001 %-0. 0003%混合成含 有激素的混合母液，将混合母液中加入蔗糖0、003% _0、006%、琼脂0. 0003% -0,0006%, 待混合母液溶解完毕定容形成综合培养基，将综合培养基PH值调制5. 8 6. 5，然后将分 装好的综合培养基放入高压灭菌锅中灭菌，灭菌条件压强1. 05MPa，温度121°C，灭菌时间15 20min备用；2、外植体选择与预处理，选取盛花后72d的种子败育型无核葡萄幼果，流水冲洗， 在超净工作台前分别用升汞、酒精消毒，无菌条件下剥出胚珠；3、胚珠培养，将无菌胚珠接种在综合培养基上，暗培养，培养基pH5. 8 6. 2，培养 温度25 30°C ；4、胚培养，胚珠培养40 60d后，对其进行剥胚处理，继续接种在综合培养基上， 并采用光照培养2000 4000LX，20 30d胚开始萌发，下部长出胚根，上部逐渐长出两片 子叶，最后成苗。根据本发明的就是方案，所指的综合培养基的原料组分及浓度配比为硝酸钾0. 095%、硝酸铵0. 072%、磷酸二氢钾0. 0068 %、硫酸镁0. 0185 %、氯 化钙 0. 0166%,硼酸 0. 0003 %、硫酸锰 0. 00223 %、硫酸锌 0. 001%,钼酸钠 0. 000025 %、 硫酸铜0. 000008 %、烟酸0. 00005 %、盐酸硫胺素0. 00005 %、盐酸吡哆醇0. 00005 %、 甘氨酸 0. 0002 %、VB5O. 000025 %、柠檬酸铁 0. 001 %、GA3O. 00001 % -0. 0003 %、IAA 0. 00001% -0. 0003%、蔗糖 0,003% _0、006%、琼脂 0. 0003% -0,0006% 进一步地，硝酸钾0.095 %、硝酸铵0.072 %、磷酸二氢钾0.0068 %、硫酸镁 0. 0185%,氯化钙0. 0166%,硼酸0. 0003 %、硫酸锰0. 00223 %、硫酸锌0. 001%,钼酸钠 0. 000025 %、硫酸铜0. 000008 %、烟酸0. 00005 %、盐酸硫胺素0. 00005 %、盐酸吡哆醇 0. 00005%、甘氨酸 0. 0002%,VB5O. 000025%、柠檬酸铁 0. 001%,GA3O. 00001% -0. 0003%, IBA 0. 00001% -0. 0003%、蔗糖 0,003% _0、006%、琼脂0. 0003% -0,0006% 进一步地，硝酸钾0.095 %、硝酸铵0.072 %、磷酸二氢钾0.0068 %、硫酸镁 0. 0185%,氯化钙0. 0166%,硼酸0. 0003 %、硫酸锰0. 00223 %、硫酸锌0. 001%,钼酸钠 0. 000025 %、硫酸铜0. 000008 %、烟酸0. 00005 %、盐酸硫胺素0. 00005 %、盐酸吡哆醇 0. 00005%、甘氨酸 0. 0002%,VB5O. 000025%、柠檬酸铁 0. 001%,GA3O. 00001% -0. 0003%, 6-BA0. 00001% -0. 0003%,蔗糖 0,003% -0,006%,琼脂 0. 0003% -0,0006%。进一步地，硝酸钾0.095 %、硝酸铵0.072 %、磷酸二氢钾0.0068 %、硫酸镁 0. 0185%,氯化钙0. 0166%,硼酸0. 0003 %、硫酸锰0. 00223 %、硫酸锌0. 001%,钼酸钠 0. 000025 %、硫酸铜0. 000008 %、烟酸0. 00005 %、盐酸硫胺素0. 00005 %、盐酸吡哆醇 0. 00005%、甘氨酸 0. 0002%,VB5O. 000025%、柠檬酸铁 0. 001%,GA3O. 00001% -0. 0003%, L-半胱氨酸 0. 0001% -0. 0003% + 水解酪蛋白 0. 01% -0. 06%、蔗糖 0、003% _0、006%、琼 脂 0. 0003% -0,0006% ο本发明中，所述的外植体品种是选用金田皇家无核葡萄和克瑞森无核葡萄。晚熟 金田皇家无核葡萄是产自河北科技师范学院新选育的晚熟葡萄无核新品种，该品种继承 了父本皇家秋天的无核特性，且在无核品种中属于大粒品种，未经药剂处理下，平均粒重 6. 3g，可溶性固形物含量达19. 6%。该品种种子退化晚，且在果实成熟时留下核的残迹，但 均不影响口感。克瑞森无核葡萄是一个晚熟的鲜食葡萄品种，因为外表有着靓丽的颜色所 以也被称为淑女红。它的果穗中等偏大，平均穗重500克，平均粒重4克。由于这种葡萄的 可溶性固形物达到19%，糖酸比可以达到20 1，所以特别清香甘甜，口感很好。本发明具有的有益效果是，通过对无核葡萄胚珠培养在简化培养基上，自始至终 不经过转换培养基即可获得杂交后代，首次实现了将发育培养基、萌发培养基、成苗培养基三个步骤改变为一种综合培养基，即在同一种培养基上实现了无核葡萄的胚挽救，利用此 方法简化了试验步骤、不需要多次更换培养基种类、节省了人力物力。因此，这种方法将会 大大方便操作过程，既简化培养步骤，又加速成苗过程，为建立一套系统、完善、高效的无核 葡萄胚挽救技术奠定坚实基础，这对于种质创新、远缘杂交、三倍体育种、杂交不亲和、缩短 育种周期、品种改良等方面的研究都具有十分重要的意义。
具体实施例方式下面将结合本发明的实施例作进一步说明。实施例1首先选用硝酸钾950mg/L、硝酸铵720mg/L、磷酸二氢钾68mg/L、硫酸镁185mg/L、 氯化钙166mg/L、硼酸3mg/L、硫酸锰22. 3mg/L、硫酸锌10. Omg/L、钼酸钠0. 25mg/L、硫酸铜 0. 08mg/L、烟酸0. 5mg/L、盐酸硫胺素0. 5mg/L、盐酸吡哆醇0. 5mg/L、甘氨酸2. Omg/L、VB5+ 柠檬酸铁+GA33. 0mg/L+IAA3. Omg/L的母液和激素，加入蔗糖SOg/L—1、琼脂Sg/L—1，培养基 溶解完毕定容后将PH值调制6，然后将分装好的培养基放入高压灭菌锅中灭菌，灭菌条件 压强1.05MPa，温度121°C，灭菌时间15min(达到要求压强以后开始计时)制得综合培养 基，再选取盛花后72d的种子败育型无核葡萄幼果，采用流水冲洗，在超净工作台前分别用 升汞、酒精消毒，无菌条件下剥出胚珠，将无菌胚珠接种在综合培养基上暗培养，培养基PH 5. 8，培养温度25°C，胚珠培养40d对其进行剥胚处理，继续接种在综合培养基上，并采用光 照培养2000LX，20d时胚开始萌发，下部逐渐发出胚根，上部逐渐长出两片子叶见，最后成
田ο实施例2综合培养基的原料组分及浓度配比为硝酸钾950mg/L、硝酸铵720mg/L、磷酸 二氢钾68mg/L、硫酸镁185mg/L、氯化钙166mg/L+硼酸3mg/L、硫酸锰22. 3mg/L、硫酸锌 10. Omg/L、钼酸钠0. 25mg/L、硫酸铜0. 08mg/L+烟酸0. 5mg/L、盐酸硫胺素0. 5mg/L、盐酸 吡哆醇 0. 5mg/L、甘氨酸 2. 0mg/L+VB50. 25mg/L+ 柠檬酸铁 10mg/L+GA30. 1 3. 0mg/L+IAA 0. 1 3. 0mg/L、蔗糖SOg/dOg/L-1、琼脂Sg/L-ieOg/L—1。其无核葡萄的胚挽救方法步骤 同上述实施例1相同，故省略描述。实施例3综合培养基的原料组分及浓度配比为硝酸钾950mg/L、硝酸铵720mg/L、磷酸 二氢钾68mg/L、硫酸镁185mg/L、氯化钙166mg/L+硼酸3mg/L、硫酸锰22. 3mg/L、硫酸锌 10. 0mg/L、钼酸钠0. 25mg/L、硫酸铜0. 08mg/L+烟酸0. 5mg/L、盐酸硫胺素0. 5mg/L、盐酸 吡哆醇 0. 5mg/L、甘氨酸 2. 0mg/L+VB50. 25mg/L+ 柠檬酸铁 10mg/L+GA30. 1 3. 0mg/L+IBA 0. 1 3. 0mg/L、蔗糖SOg/dOg/L-1、琼脂Sg/L-ieOg/L—1。其无核葡萄的胚挽救方法步骤 同上述实施例1相同，故省略描述。实施例4综合培养基的原料组分及浓度配比为硝酸钾950mg/L、硝酸铵720mg/L、磷酸 二氢钾68mg/L、硫酸镁185mg/L、氯化钙166mg/L+硼酸3mg/L、硫酸锰22. 3mg/L、硫酸锌 10. 0mg/L、钼酸钠0. 25mg/L、硫酸铜0. 08mg/L烟酸0. 5mg/L、盐酸硫胺素0. 5mg/L、盐酸吡哆 醇 0. 5mg/L、甘氨酸 2. 0mg/L+VB50. 25mg/L+柠檬酸铁 10mg/L+GA30. 1 3. Omg/L+6-BAO. 1 3. Omg/L、蔗糖SOg/L-i-eOg/L—1、琼脂Sg/L-i-eOg/L—1。其无核葡萄的胚挽救方法步骤同上述 实施例1相同，故省略描述。实施例5综合培养基的原料组分及浓度配比为硝酸钾950mg/L、硝酸铵720mg/L、磷酸 二氢钾68mg/L、硫酸镁185mg/L、氯化钙166mg/L+硼酸3mg/L、硫酸锰22. 3mg/L、硫酸锌 10. Omg/L、钼酸钠0. 25mg/L、硫酸铜0. 08mg/L+烟酸0. 5mg/L、盐酸硫胺素0. 5mg/L、盐酸吡 哆醇 0. 5mg/L、甘氨酸 2. 0mg/L+VB50. 25mg/L+ 柠檬酸铁 10mg/L+GA30. 1 3. 0mg/L+L-半胱 氨酸 1. 0 3. 0mg/L+ 水解酪蛋白 100 600mg/L、蔗糖 SOg/I^-eOg/L-1、琼脂 Sg/I^-eOg/ Γ1。其无核葡萄的胚挽救方法步骤同上述实施例1相同，故省略描述。
权利要求
一种简化无核葡萄胚挽救的方法，其方法步骤是(1)综合培养基的制备，首先选取原料硝酸钾0.095％、硝酸铵0.072％、磷酸二氢钾0.0068％、硫酸镁0.0185％、氯化钙0.0166％、硼酸0.0003％、硫酸锰0.00223％、硫酸锌0.001％、钼酸钠0.000025％、硫酸铜0.000008％、烟酸0.00005％、盐酸硫胺素0.00005％、盐酸吡哆醇0.00005％、甘氨酸0.0002％、柠檬酸铁0.001％、GA30.00001％ 0.0003％、IAA 0.00001％ 0.0003％混合成含有激素的混合母液，将混合母液中加入蔗糖0、003％ 0、006％、琼脂0.0003％ 0、0006％混合成含有激素的母液，待母液溶解完毕定容形成综合培养基，将综合培养基pH值调制5.8～6.5，然后将分装好的综合培养基放入高压灭菌锅中灭菌，灭菌条件压强1.05MPa，温度121，灭菌时间15～20min备用；(2)选取盛花后72d的种子败育型无核葡萄幼果，流水冲洗，在超净工作台前分别用升汞、酒精消毒，无菌条件下剥出胚珠；(3)将无菌胚珠接种在综合培养基上，暗培养，培养基pH 5.8～6.2，培养温度25～30℃；(4)胚珠培养40～60d时对其剥胚处理，继续接种在综合培养基上，并采用光照培养2000～4000LX，20～30d时胚开始萌发，下部逐渐发出胚根，上部逐渐长出两片子叶，最后成苗。
2.根据权利要求1所述的简化无核葡萄胚挽救的方法，其特征是，所述步骤(1)综合 培养基原料的浓度配比是硝酸钾0. 095%、硝酸铵0. 072%、磷酸二氢钾0. 0068%、硫酸 镁0. 0185%,氯化钙0. 0166 %、硼酸0. 0003%、硫酸锰0. 00223 %、硫酸锌0. 001 %、钼酸 钠0. 000025%、硫酸铜0. 000008%、烟酸0. 00005%、盐酸硫胺素0. 00005%、盐酸吡哆醇 0. 00005%、甘氨酸 0. 0002%,VB5O. 000025%、柠檬酸铁 0. 001%,GA3O. 00001% -0. 0003%, IAA 0. 00001% -0. 0003%、蔗糖 0,003% _0、006%、琼脂0. 0003% -0,0006%
3.根据权利要求1所述的简化无核葡萄胚挽救的方法，其特征是，综合培养基原料的 浓度配比是硝酸钾0. 095%、硝酸铵0. 072%、磷酸二氢钾0. 0068%、硫酸镁0. 0185%、氯 化钙 0. 0166%,硼酸 0. 0003 %、硫酸锰 0. 00223 %、硫酸锌 0. 001%,钼酸钠 0. 000025 %、 硫酸铜0. 000008 %、烟酸0. 00005 %、盐酸硫胺素0. 00005 %、盐酸吡哆醇0. 00005 %、 甘氨酸 0. 0002 %、VB5O. 000025 %、柠檬酸铁 0. 001 %、GA3O. 00001 % -0. 0003 %、IBA 0. 00001% -0. 0003%、蔗糖 0,003% _0、006%、琼脂0· 0003% -0,0006%
4.根据权利要求1所述的简化无核葡萄胚挽救的方法，其特征是，综合培养基 原料的浓度配比是硝酸钾0. 095 %、硝酸铵0. 072 %、磷酸二氢钾0. 0068 %、硫酸镁 0. 0185%,氯化钙0. 0166%,硼酸0. 0003 %、硫酸锰0. 00223 %、硫酸锌0. 001%,钼酸钠 0. 000025 %、硫酸铜0. 000008 %、烟酸0. 00005 %、盐酸硫胺素0. 00005 %、盐酸吡哆醇 0. 00005%、甘氨酸 0. 0002%,VB5O. 000025%、柠檬酸铁 0. 001%,GA3O. 00001% -0. 0003%, 6-BA0. 00001% -0. 0003%,蔗糖 0,003% -0,006%,琼脂 0. 0003% -0,0006%。
5.根据权利要求1所述的简化无核葡萄胚挽救的方法，其特征是，综合培养基原料的 浓度配比是硝酸钾0. 095%、硝酸铵0. 072%、磷酸二氢钾0. 0068%、硫酸镁0. 0185%、氯 化钙 0. 0166%,硼酸 0. 0003 %、硫酸锰 0. 00223 %、硫酸锌 0. 001 %、钼酸钠 0. 000025 %、 硫酸铜0. 000008 %、烟酸0. 00005 %、盐酸硫胺素0. 00005 %、盐酸吡哆醇0. 00005 %、 甘氨酸 0. 0002%, VB5O. 000025%、柠檬酸铁 0. 001%, GA3O. 00001 % -0. 0003%, L-半胱氨酸 0. 0001 % -0. 0003% + 水解酪蛋白 0. 01 % -0. 06%、蔗糖 0、003% _0、006%、琼脂 0. 0003% -0、0006%。
全文摘要
一种简化无核葡萄胚挽救的方法，通过无核葡萄胚的离体胚挽救，包括综合培养基的制备、幼果的选取、消毒、胚珠离体培养、剥胚、胚培养，选取盛花后72d的种子败育型无核葡萄幼果，流水冲洗，在超净工作台分别用升汞、酒精消毒，无菌条件下剥出胚珠。然后接种在综合培养基上，暗培养，培养基pH 5.8～6.2，培养温度25～30℃。胚珠培养40～60d时对其剥胚处理，继续接种在综合培养基上，并采用光照培养2000～4000LX，20～30d时胚开始萌发，下部逐渐发出胚根，上部逐渐长出两片子叶，最后成苗。利用本发明的方法，使发育培养基、萌发培养基、成苗培养基合为一体，简化并加速了无核葡萄胚挽救。
文档编号A01H4/00GK101982065SQ20101027855
公开日2011年3月2日 申请日期2010年9月7日 优先权日2010年9月7日
发明者王娜, 闫淑芳, 项殿芳 申请人:河北科技师范学院