专利名称：大豆叶片胚性愈伤组织和体细胞胚诱导方法
技术领域：
本发明属于农业生物技术领域，是以大豆叶片为外植体诱导体细胞胚发生和植株再生的方法。
背景技术：
大豆是世界性的重要粮油作物，也是主要的植物蛋白和牲畜家禽的重要饲料来源之一。去年，全球大豆种植面积超过1亿公顷，年产量超过2亿吨。因此培育出重要目标性状突出的优良大豆新品种将会获得巨大的经济效益。然而，效率低、周期长、性状改良幅度不大的常规杂交育种很难满足生产上对大豆新品种的实际需求，而运用高效转基因技术结合常规育种程序有可能解决上述问题和达到预期目标。优良的大豆再生体系是实现大豆高效遗传转化的前提和必要条件。大豆的组织培养研究始于20世纪60年代，但当时总的看来，各种外植体的组织培养与再生植株都十分困难，直到进入80年代中后期，大豆组织培养工作才有了突破性的进展。目前，大豆从器官发生和胚胎发生两种途径均能植株再生。大豆器官发生途径所用的外植体种类较多，有下胚轴，子叶，子叶节、未成熟子叶、茎尖等。其中，子叶节不定芽器官发生再生体系是农杆菌介导的大豆遗传转化中最常用的受体系统。大豆胚胎发生常用的外植体主要有未成熟子叶、 未成熟胚和胚轴等，所用的外植体均为未成熟组织。大豆遗传转化方法主要有农杆菌介导法、基因枪法、PEG转化法、原生质体法、电击法等，还有不通过组织培养过程的子房微注射法、花粉管导入法等。但目前应用最广泛且比较成熟的大豆遗传转化方法主要有根癌农杆菌介导的子叶节方法和基因枪介导的体细胞胚方法两种。根癌农杆菌介导的子叶节法具有操作简单、转化的基因拷贝数少、取材不受限制等优点，但由此系统获得的转化植株嵌合体较多，增大了后期剔除的工作量。基因枪介导的体细胞胚法虽然不产生嵌合体问题，但转化效率低，且因转基因受体均为未成熟组织，具有外植体取材受时间和季节限制等缺点。综上所述，尽管人们对大豆组织培养再生体系和相应的遗传转化方面做了大量的研究工作，但大豆转基因研究进展还是非常缓慢，仍然存在大豆植株再生难、转化不易重复、存在嵌合体、转化效率低等诸多问题。因此，研究大豆组培再生体系和相应的转化系统对于大幅度提高其遗传转化效率具有重要意义。
发明内容
本发明提供一种以大豆成熟种子萌发形成的叶片为外植体诱导大豆体细胞胚植株再生的方法。本发明的目的是1)该再生体系所用的外植体叶片取自于大豆成熟种子萌发的材料，从而避免了现有大豆体细胞胚发生再生体系因采用未成熟组织为外植体而取材受时间和季节限制的问题；幻提供一种简便有效的大豆胚性愈伤组织诱导方法；；3)提供一种简便有效的大豆体细胞胚诱导方法。本发明大豆叶片体细胞胚诱导植株再生的方法是通过以下几个步骤进行的1)大豆种子萌发1 lid，并分别制备外植体幼叶；幻将幼叶放在诱导培养基上诱导产生胚性愈伤组织；3)诱导体细胞胚发生。为了比较不同外植体对体细胞胚的诱导效果，通过对种子的不同萌发处理， 制备了不同外植体幼叶。将大豆种子用75%乙醇表面消毒lmin，再用0. 升汞溶液消毒12min，用无菌水冲洗4次，然后放入无菌水于^TC暗中浸泡ld，或者直接接种于 1/2MS[1/2MS无机盐类為维生素、pH 5.8]或1/2MSB萌发培养基[1/2MS无机盐类、B5维生素、0. 5mg/L 6-BAP、pH 5.8]上，并于16/8h(光/暗)下，萌发7d获得幼苗，并从中切取真叶，同时把真叶的叶柄切去，便可获得外植体幼叶。将制备的外植体幼叶放在含有2，4_D或NAA的诱导培养基上诱导胚性愈伤组织和体细胞胚发生。幼叶接种后3-5d就开始膨大，表面和切口开始愈伤组织化，3 4周后产生肉眼可见的胚性愈伤组织和球形胚，大多数愈伤组织呈乳白色，少数呈淡黄绿色，而胚状体颜色为淡黄色。胚性愈伤组织形成后在其上进而形成体细胞胚，而有些体细胞胚是不经过愈伤组织途径而直接在外植体上形成，在外植体幼叶上先长成一个致密的米黄色细胞团，之后在细胞团的表面长出独立的嫩绿色的球形突起，然后球体进一步突出形成球形胚， 同时在胚状体下面形成愈伤组织。萌发培养基中添加BAP与否均能在诱导培养基上诱导出胚性愈伤组织，但萌发培养基中添加BAP时比不添加时的成愈率要高。激素种类及浓度对胚性愈伤组织的诱导及其重要，在诱导培养基中应至少含有一种激素2，4-D或NAA。2，4-D 浓度至少在ang/L以上，当2，4-D浓度为5mg/L时诱导效果最好，诱导率为70. 8% ；随着浓度的提高诱导率逐渐下降，当浓度为20mg/L时诱导率仅为10. 7%，而且多数愈伤组织逐渐变黑最终死亡。在诱导培养基中添加NAA时也能诱导出胚性愈伤组织，虽然使用NAA比使用2，4-D时胚性愈伤组织诱导率低，但正常胚形成比率高。
图1为大豆种子萌发5d时切取的幼叶外植体；图2为幼叶外植体上诱导的胚性愈伤组织和部分体细胞胚；图3为诱导出的体细胞胚。
具体实施例方式[实例一]大豆种子萌发与幼叶外植体制备为了比较不同外植体对体细胞胚的诱导效果，本发明制备了不同的外植体幼叶。将‘小粒黄，大豆种子用75%乙醇表面消毒lmin，再用0. 升汞溶液消毒12min， 用无菌水冲洗4次后，放入1/2MSB5[1/2MS无机盐类、&维生素、3%蔗糖、pH 5.8]或者 l/2MSB5+0. 5mg/L 6-BAP的两种萌发培养基上，且在16/8h (光/暗)下，萌发7d获得幼苗，并从幼苗中切取真叶，同时把真叶的叶柄切除，便可获得外植体幼叶。将获取的外植体幼叶放在诱导培养基上诱导体细胞胚发生。[实例二]萌发培养基中BAP浓度对大豆幼叶胚性愈伤组织诱导的影响为了确定最佳外植体，本发明比较了萌发培养基中添加BAP与否对幼叶胚性愈伤组织诱导的影响。萌发培养基采用1/2MS培养基和1/2MSB。在萌发培养基上添加BAP和不添加BAP时均能在诱导培养基上诱导出胚性愈伤组织，但诱导率差异不大，添加BAP时的诱CN 102524057 A
导率略高于不添加时(表1)。当BAP浓度大于lmg/L时，下胚轴发育良好，但是叶片发育缓慢，甚至有些幼苗的叶片不能发育，因此BAP浓度应低于0. 5mg/L。表1萌发培养基中BAP浓度对大豆幼叶胚性愈伤组织的诱导效果
权利要求
1.一种大豆叶片体细胞胚诱导植株再生方法，其特征在于外植体叶片取自于萌动的成熟种子或已萌发的幼苗，并将其放在诱导培养基上诱导体细胞胚发生，然后经成熟、萌发形成完整植株的方法。
2.根据权利要求1所述，其特征在于叶片取自于不含有BAP的萌发培养基上萌发7d的大豆幼苗。
3.根据权利要求1所述，其特征在于叶片取自于含有BAP的萌发培养基上萌发7d的大豆幼苗。
4.根据权利要求2所述，其特征在于萌发培养基上不含有BAP。
5.根据权利要求3所述，其特征在于萌发培养基上含有BAP，其浓度至少0.5mg/L。
6.根据权利要求1所述，其特征在于诱导培养基上至少含有一种激素2，4-D或NAA。
7.根据权利要求1所述，其特征在于在诱导培养基上由幼叶诱导出胚性愈伤组织。
8.根据权利要求7所述，其特征在于在诱导培养基上由幼叶诱导出体细胞胚发生。
全文摘要
大豆叶片胚性愈上组织和体细胞胚诱导方法，本发明涉及植物组织培养技术，是一种以大豆叶片为外植体诱导大豆胚性愈伤组织和体细胞胚发生的方法。本发明提供如何从萌发的大豆成熟种子中制备外植体叶片，以及如何从外植体诱导大豆胚性愈伤组织和体细胞胚发生的方法。采用大豆成熟叶片作为外植体建立体细胞胚植株再生体系，避免了采用未成熟组织作为外植体时取材受季节限制、操作难的问题。本发明为大豆转基因新技术体系的建立提供了强有力的组培技术保障，对大豆高效分子育种和功能基因组研究具有重要的现实意义。
文档编号A01H4/00GK102524057SQ20101028502
公开日2012年7月4日 申请日期2010年9月14日 优先权日2010年9月14日
发明者孙明杰, 曹荣, 皱丹丹, 蔡春梅, 薛仁镐, 赵春梅, 金圣爱 申请人:青岛农业大学