专利名称：纹枯病菌毒素在水稻抗纹枯病育种中的应用方法
技术领域：
本发明公开了一种利用纹枯菌毒素开展水稻抗纹枯病育种的方法，属于水稻抗病 育种技术领域。
背景技术：
纹枯病菌在人工培养和侵染过程中均会产生多种对寄主有毒的物质，人们将其统 称为毒素。由于技术手段的局限性，长期以来，一直未有学者获得纹枯菌毒素纯品，因此，关 于纹枯菌毒素的成分是什么，至今未有定论。实际研究中采用的毒素均是粗毒素(以下统称 为毒素)，为非纯品，可能包含一些培养基成分和/或病原菌分泌的对寄主无毒的物质。少数研究结果预示，毒素可应用于品种的抗病选育。然而，关于具体应用方法，未 见报道。本专利主要介绍如何将纹枯病菌毒素应用于水稻抗纹枯病育种中，涉及的背景技 术有以下3个方面
1、毒素提取方法。不同毒素提取方法间的差异主要体现在2个方面，一是提取前的病 原菌培养液不同，常用培养液有改良Richard培养液、Czapek培养液和马铃薯蔗糖培养液。 徐敬友等(2004)研究表明，病菌在改良Richard培养液中产毒能力强于另2种培养液，且 发现在25-30°C条件下培养15天的毒素活性最高，培养过程中需要每隔12小时摇晃一次。 二是提取方法不同，常用方法有活性炭吸附法、酸度调节萃取法、活性炭吸附萃取法、乙醚 萃取法。不同方法间的差异致使获得的毒素活性或量上存在较大差异，比较显示，乙醚萃取 法获得的毒素活性最强(孟令军等，2009 )。总体而言，以上提取方法均是植物病理学专家欲分离纯毒素或分析毒素成分而提 出的方法，提取过程中均包含一定的纯化环节，即去除对寄主无毒的物质。然而，就水稻抗 病育种应用而言，在保持同样产毒量或活性基础上，这些方法可简化，使其更方便快捷、经 济实惠。2、水稻抗毒素测定方法。已报道的水稻抗毒素测定方法有3种，即胚根抑制法、幼 苗致萎法和针刺接种法。研究表明，采毒素处理破胸露白的水稻种子，可抑制种子胚根胚芽 生长，尤其对胚根生长抑制作用最明显，处理3叶期水稻幼苗时，可致幼苗萎蔫死亡；通过 针刺法将毒素接种于水稻叶片、叶鞘上，可诱发相似于纹枯病的典型症状。通过胚根抑制法 和针刺接种法，少数研究还发现，一些抗病品种对毒素的忍耐性总体强于感病品种，抗感毒 素水平与其抗感纹枯病水平间存在一定正相关性。因此，一些学者推测认为，水稻对纹枯菌 毒素的忍耐水平可用作水稻抗病品种的一个筛选标准。然而，我们研究发现，毒素浓度过高过低均不能有效揭示抗感品种间的抗毒素差 异，浓度过高可导致所有测定品种的胚根生长受抑制、幼苗萎蔫致死，受害症状相同，抗感 差异无法显示。同样，浓度过低则不产生抑制或致萎效果，也无法显示抗感差异。因此，在 水稻抗病育种中，一定要采用合适的毒素浓度才能选育到较抗品系(种)，但是至目前，还未 见到用于水稻抗纹枯病品种选育的合适的毒素浓度的确定方法。3、水稻纹枯病抗性鉴定方法。在水稻抗纹枯病遗传和育种研究领域中，已报道的
3水稻纹枯病抗性鉴定方法主要有捆扎法、撒施法、嵌入法、注射法(潘学彪等，1997)和苗期 鉴定法。除了苗期鉴定法在温室中进行以外，其他方法均在大田进行。田间鉴定的环境不 可控，耗时费力，效率低，通常一年只能鉴定一次，每次鉴定耗时也都在2个月以上。苗期温 室接种方法虽然将鉴定周期缩短至1个月左右，且减少了环境影响因素，但是对苗龄大小 或植株高矮等要求较高，增加了试验难度。总体而言，所有这些方法在大规模抗病育种中， 都显得低效、耗时、费力，尤其在低世代分离群体中，缺乏可操作性。
发明内容
本发明为了解决现有技术的不足，提供了一种纹枯病菌毒素在水稻抗纹枯病育种 中的应用方法，该方法简便快捷，尤其适合在低世代分离群体中应用。本发明所采用的技术方案是一种纹枯病菌毒素在水稻抗纹枯病育种中的应用方 法，包括以下步骤
(1)用水稻叶片和纯净水的无菌混合物为培养基培养纹枯菌并提取分泌的毒素；
(2)以纹枯病抗病品种YSBRl、感病品种Lemont为标准品种，将上述(1)中的毒素配成 不同浓度梯度对标准品种种子进行胚根抑制法处理，取标准抗病品种YSBRl的胚根抑制率 在45-60%之间同时标准感病品种Lemont的胚根抑制率在85%以上时的毒素浓度为最佳毒 素浓度；
(3)采用最佳浓度的毒素通过胚根抑制法进行育种筛选，淘汰胚根生长明显受抑制的 品种或个体。上述步骤(1)中的培养基优选每IOOml纯净水中3_4g水稻叶片的无菌混合物。上述步骤(1)分泌的毒素通过以下方法提取过滤培养液，-20°C冷冻过夜；4°C解 冻；冷冻离心机4°C，4，OOOg离心lOmin，取上清液；50°C真空旋转蒸发上清液为原体积的 1/10，即为毒素粗提液。在胚根抑制法中，由于毒素存在，水稻种子的胚根生长会受到抑制，即生长很慢或 不生长；而在无毒素存在下，种子胚根生长正常，即在开始生长后的72小时内，正常种子的 胚根生长长度均在2. 5-4. 5cm范围内；当用合适浓度的毒素处理种子72小时后，感病品种 种子的胚根生长长度小于0. 5cm,即胚根生长受到了明显抑制。本发明具有以下优点
(1)与传统水稻抗纹枯病接种鉴定方法相比，本专利公开的方法具有鉴定效率高、影响因 素少等优点，尤其是在播种前即可淘汰多数感病个体，大大减轻后续抗病性鉴定的工作量。(2)与改良的Richand纹枯病菌培养液相比，本专利公开的方法中采用的培养液 配制方法简单、经济实惠，在毒素产量或活性上相差不明显。(3)与已报道的一些毒素提取方法相比，本专利公开的方法中涉及到的毒素提取 方法更简便快捷，在毒素产量或活性上与乙醚萃取方法相近。(4)本专利公开的方法中涉及到用于抗病育种的适宜毒素浓度的确定方法，在抗 纹枯病育种中，此前未见具有同等性质的研究报道。
图1是YSBRl品种在不同浓度毒素处理后72小时的种子胚根胚芽伸长情况；其中，91SP是YSBRl品种实验室中的简称；左至右依次为5倍和3倍毒素处理及清水对照。图2是Lemont品种在不同浓度毒素处理后72小时的种子胚根胚芽伸长情况；左 至右依次为5倍和3倍毒素处理及清水对照。图3是特青品种在不同浓度毒素处理后72小时的种子胚根胚芽伸长情况；左至右 依次为5倍和3倍毒素处理及清水对照。图4是2个标准品种在不同浓度梯度毒素处理后的胚根抑制率曲线图(垂直线为 标准误)。
具体实施例方式对于本领域技术人员可以理解，本发明中所说的纹枯病菌是指引起水稻纹枯病 (英文名rice sheath blight)的病原真菌，其学名为立枯丝核菌(英文学名为胁办 如/？化 solani Kuhn ；下述实施例中所使用的具体菌株是强致病菌株RH-9，由江苏省农业科学院植 物保护研究所陈志谊研究员于1996年采集。实施例中具体菌株仅用于对本发明方法的详 细说明，不构成对本发明保护范围的限制。本实施例中所涉及的水稻品种是已公开的品种，公众可从公开渠道获得。如 YSBRl (左示敏等，作物学报，2009)来源于申请人，目前已向国内相关育种单位公开，
承诺自申请日起向公众提供20年。Tetep 为印度传统的高杆地方水稻品种。Lemont 为美国路易斯安那州商业化水稻品种。Jasmine85 为美国商业化水稻品种。明恢63，特青，扬稻4号，窄叶青8号，中花11号和武育梗3号均是国内商业化品 种。1)确定用于抗病育种中大规模鉴定的抗毒素测定方法
对已有的3种抗毒素测定方法进行试验比较，在鉴定效率、重复性以及简便性等方面 进行比较，确定适用于抗病育种的抗毒素测定方法。采用公开的Richand培养液和乙醚萃取法提取获得纹枯菌粗毒素，将粗提液稀释 1/10的毒素浓度定义为Ix (1倍)，分别采用胚根抑制法、幼苗致萎法和针刺接种法3种抗 毒素测定方法和9种浓度的毒素(l/2x, lx, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 8x, IOx)测定高抗、中抗和高 感纹枯病水稻品种(系)YSBR1、特青和Lemont的抗毒素表型，分析不同方法识别抗感差异的 能力及在鉴定效率、精度和便利性上的差异，以此确定最适用于抗病育种的抗毒素测定方 法。胚根抑制法操作流程用10%(v/v)84消毒液对水稻种子表面消毒一分半钟，后用 无菌水在30°C下浸种催芽48小时；然后将毒素处理的种子放置铺有两层滤纸含10 ml纹 枯菌粗毒素液的培养皿中，每皿20-30粒种子，30°C下黑暗培养60小时；重复三次，以空白 培养液为对照，测量胚根长度。幼苗致萎法操作流程3叶期稻苗，洗净根部，以无菌水处理后移入盛有立枯丝核 菌粗毒素液的试管中，以空白培养液为对照；置于28-30°C自然光照下，观察幼苗发生萎蔫 的时间。针刺接种法操作流程取5叶期水稻植株，针刺叶片造成伤口，然后将浸有立枯丝
5核菌粗毒素的脱脂棉覆盖在伤口上，置于28-30°C下，12小时后观察叶片的病变情况。按照以上技术方案，发现采用胚根抑制法可在播种前完成抗毒素鉴定试验，鉴定 周期为7天，鉴定过程中的环境可控，结果重演性高，效率高，鉴定后的种子可继续播种；幼 苗致萎法在幼苗期进行试验，从播种至鉴定结束所需时间15-20天；针刺接种法通常针对5 叶期植株接种，鉴定周期在20-25天。胚根抑制法是通过测定胚根生长受抑制率来显示品种间的抗感毒素差异，表型值 可直接用直尺测量，结果精确；而另外两种方法的表型值测定中均是通过肉眼进行的，以主 观标准评定抗感差异，准确性低于胚根抑制法；在抗感差异的识别能力上，胚根抑制法高于 另两种方法，需要的毒素量也少于另两种方法。水稻抗病育种中需要鉴定的种质规模通常较大，因此，在综合考虑鉴定效率、鉴定 精确度和毒素需要量等方面后，认为胚根抑制法最适用于抗病育种。2)纹枯菌培养液的配方改进
以不同克数的(1、2、3、4、5克)剪碎的感病水稻叶片和IOOml纯净水的无菌混合物为纹 枯病菌培养液，同时设置改良Richand培养液、未接菌混合液以及清水对照，各培养液接菌 后分别在28°C暗培养条件下培养10、15、20天，后续比较不同方法间及试验设置间的毒素 活性差异，探讨简单的叶片_纯净水混合培养液培养纹枯菌并提取到较高活性的毒素的可 行性。通过以上技术方案的试验对比，发现以IOOml纯净水和3至4g水稻叶片的无菌混 合物最适宜纹枯病菌培养和产毒，所得毒素的量和活性高于IOOml纯净水中带有1至2克 和5克以上的水稻叶片的培养液。改良Richand培养液的纹枯菌产毒量或产毒活性仅略高于IOOml纯净水和3至4g 的无菌培养液的产毒量，但前者在培养液的配制和耗费上分别复杂和高于后者。3)简化毒素提取方法
简化毒素提取方法，如去除一些有机物的抽提步骤，分析简便方法提取的毒素量或活 性与对照乙醚萃取法间的差异，确定简便方法的可行性。乙醚萃取法的操作流程为过滤培养液，60度真空旋转蒸发为原体积的1/5得到 浓缩液；加等体积甲醇离心，取上清液；40度旋转蒸发去甲醇，取水相；加等体积乙醚萃取， 保存有机相，取水相再加等体积乙醚萃取，分别得到有机相和水相；保存有机相，取水相再 加等体积乙醚萃取，再次保存有机相；将三次保存的不同的有机相混合，旋转蒸发至水相呈 焦油状，加无菌水定量(以每50ml培养液Iml水为标准)，即得毒素粗提液(以下简称毒素)。简便毒素提取法的操作流程过滤培养液，-20°C冷冻过夜；4°C解冻；冷冻离心机 44, OOOg离心lOmin，取上清液；50°C真空旋转蒸发上清液为原体积的1/10，即为毒素粗 提液。利用简化的毒素提取方法和乙醚萃取法分别提取相同培养液的培养产物，利用提 取的毒素测定标准品种的抗毒素能力，结果显示，在利用简化得到毒素提取方法时使用于 抗病育种的最佳毒素浓度为4x，而在乙醚萃取法中则为3x，这表明简化的毒素提取方法获 得产毒活性仅略低于乙醚萃取法，但是，简化的毒素提取方法操作简单、快捷。因此，比较而 言，简化的毒素提取方法在抗病育种中更为适用。4)抗纹枯病育种中适宜毒素浓度的确定方法用于测定毒素相对浓度的标准品种的确定。选用水稻种质资源中最抗和最感纹枯病的 代表性水稻品种(系)作为测定毒素浓度(活性)的标准品种，采用其他品种的抗病性覆盖度 一般不够。通过大批种质资源的抗病性测定，本方法确定YSBRl可作为最抗水稻纹枯病的 代表性品种(系)，Lemont为最感水稻纹枯病的代表性品种，故将这2个品种设定为测定毒 素相对浓度的标准品种。利用标准品种确定最佳毒素浓度的方法。毒素浓度过高过低均不能有效识别品种 间的抗感差异(图1-3)。将毒素粗提液稀释1/10的毒素浓度定义为lx(l倍)，设计l/3x、 l/2x、lx、2x、3x、4x、5x、7x和IOx等9个浓度梯度处理标准品种(图1_3)，将最抗和最感品 种间的抑制率值差异最大时的毒素浓度确定为最佳浓度。采用最佳浓度的毒素测定9个已 知抗感纹枯病水平的水稻品种，以及2个标准品种间的杂交种F1的自交种子(F2)的抗性水 平，验证最佳浓度毒素在抗感差异上的鉴别能力和在抗病育种中的应用潜力。确定标准品种对合计418份水稻种质进行大田人工接种鉴定，这些材料来源于 中国农科院水稻核心种质库、国内外代表性抗感品种和国内近年主推的水稻品种。结果 显示，YSBRl和Tetep为最抗水稻纹枯病的2个品种，前者为本专利申请者选育的具改良 株型的抗性品系，后者为印度早期传统高杆品种(>160cm)，育种利用难度大，因此，我们将 YSBRl确定代表抗病品种的标准品种；高感纹枯病水稻品种较多，我们将其中在国内水稻 抗纹枯病研究中普遍采用的品种Lemont确定为标准品种。两个标准品种间的抗感差异极 显者ο利用标准品种确定最佳毒素浓度的方法通过上述不同浓度梯度的毒素处理2个 标准品种，结果显示标准抗感品种间胚根抑制率差异最大可达40% (表1-2，图4)，因此，本 方法确定对标准抗病品种YSBRl的胚根抑制率在45-60%之间同时标准感病品种Lemont的 胚根抑制率在85%以上时的毒素浓度为最佳毒素浓度。
权利要求
一种纹枯病菌毒素在水稻抗纹枯病育种中的应用方法，包括以下步骤(1)用水稻叶片和纯净水的无菌混合物为培养基培养纹枯菌并提取分泌毒素；(2)以纹枯病抗病品种YSBR1、感病品种Lemont为标准品种，将上述(1)中的毒素配成不同浓度梯度对标准品种种子进行胚根抑制法处理，取标准抗病品种YSBR1的胚根抑制率在45 60%之间同时标准感病品种Lemont的胚根抑制率在85%以上时的毒素浓度为最佳毒素浓度；(3)采用最佳浓度的毒素通过胚根抑制法进行育种筛选，淘汰胚根生长明显受抑制的品种或个体。
2.根据权利要求1所述纹枯病菌毒素在水稻抗纹枯病育种中的应用方法，其特征在 于，步骤(1)中的培养基是每IOOml纯净水中3-4g水稻叶片的无菌混合物。
3.根据权利要求1所述纹枯病菌毒素在水稻抗纹枯病育种中的应用方法，其特征在 于，步骤(1)分泌的毒素通过以下方法提取过滤培养液，_20°C冷冻过夜；4°C解冻；冷冻离 心机4°C，4，OOOg离心lOmin，取上清液；50°C真空旋转蒸发上清液为原体积的1/10，即为毒 素粗提液。
全文摘要
本发明涉及纹枯病菌毒素在水稻抗纹枯病育种中的应用，该应用包括以下步骤(1)用水稻叶片和纯净水的无菌混合物为培养基培养纹枯菌并提取分泌毒素；(2)以纹枯病抗病品种YSBR1、感病品种Lemont为标准品种，将提取的毒素配成不同浓度梯度对标准品种种子进行胚根抑制法处理，取标准抗病品种YSBR1的胚根抑制率在45-60%之间同时标准感病品种Lemont的胚根抑制率在85%以上时的毒素浓度为最佳毒素浓度；(3)采用最佳浓度的毒素通过胚根抑制法进行育种筛选，淘汰胚根生长明显受抑制的品种或个体。本发明鉴定效率高，操作简单易行，成本低，能快速提升水稻品种的纹枯病抗性水平，降低环境污染，实现农民增收。
文档编号A01G16/00GK101953281SQ20101029479
公开日2011年1月26日 申请日期2010年9月28日 优先权日2010年9月28日
发明者左示敏, 张亚芳, 徐敬友, 潘学彪, 陈夕军, 陈宗祥, 顾世梁, 顾芳 申请人:扬州大学