专利名称：芳香新塔花挥发油制备方法及其对油菜菌核病的防治作用的制作方法
技术领域：
本发明涉及芳香新塔 花挥发油的制备，及其对油菜菌核病的防治作用，属于农药 技术领域。
背景技术：
植物挥发油(essential oil )是广泛存在于植物体内的多组分化合物，是植物次 生代谢产物，有一定的芳香气味。具有分子量小，挥发性等特点。挥发油在植物界分布广泛， 主要集中在菊科、伞形科、唇形科、芸香科、樟科、姜科、木兰科等植物中。挥发油具有丰富的 生物活性，具体表现为抗菌驱虫、抗炎、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤、解热镇痛祛痰止咳等。目 前已知的植物挥发油有大约3000种，其中约300种已被广泛应用于制药、食品、农业、化妆 品等工业中。芳香新塔花(Z/ziMora clinopodioides Lam.)为唇形科半灌木草本植物，有薄 荷香味，分布于新疆阿尔泰山、天山、帕米尔高原及昆仑山的山地草原和砾石质坡地，中亚 及蒙古也有分布。芳香新塔花又名唇香草、小叶薄荷，为维族常用药用植物，维吾尔语称为 续则、苏则，常用于高血压、冠心病的治疗，可调节心血管系统功能。其挥发油具薄荷香味， 有较强的抗菌及抗氧化活性。油菜菌核病由核盘菌Schroiior腫(Lib.) de Bary]引起，在我 国各油菜产区，尤其在长江流域及东南沿海冬油菜产区发生最为严重，一般年份油菜菌核 病发病率为10% 30%，严重年份达80%以上，油菜感病后减产达11% 73%，含油量降低 1% 5%。核盘菌是一种危害严重、世界性的植物病害真菌，寄主超过400种植物。我国报 道的核盘菌自然寄主有36科214种植物，目前主要采用抗病品种和化学农药苯丙咪唑类或 二甲酰亚胺类等抗菌剂作为防治手段。如今，合成抗菌剂的安全性日益受到人们的关注，使 得植物源农药(挥发油、植物提取物等)需求量逐渐增加。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种芳香新塔花挥发油的制备方法，以及芳 香新塔花挥发油对油菜菌核病的防治作用 芳香新塔花挥发油的制备方法如下
将干燥的芳香新塔花地上部位粉碎，过筛，称取适量，加入蒸馏水，蒸馏，馏出物除掉水 相后，干燥得芳香新塔花挥发油。采用气相色谱_质谱(GC-MS)联用的方法，从芳香新塔花挥发油中共鉴定出了 21个化合物(表1)，占总含量的98. 29wt%。主要物质有胡薄荷酮(53. 51wt%)，异薄荷酮 (10. 37wt%)及香芹酮(5. 67wt%)等。《新疆中医药》2009年第1期公布了按《中国药典》(2005版，一部)方法提取芳 香新塔花的挥发油，经GC-MS分析，主要成分为胡薄荷酮(69. 60%)，薄荷酮(19. 94%)及乙 酸-2，2-二甲基环乙酯(3. 10%)。《质谱学报》2008年第3期公布了用水蒸气蒸馏的方法提 取的芳香新塔花的挥发油，经GC-MS分析，主要成分为胡薄荷酮(53. 82-80. 71%)，薄荷酮(8. 31-29. 69%)。《石河子大学学报(自然科学版)》2008年第4期公开了用水蒸气蒸馏的方法提取的新疆产芳香新塔花挥发油，用GC-MS鉴定了其主要成分为胡薄荷酮(84. 24 %)、/7_薄 荷酮(5. 90%)及薄荷烯酮(5. 19%)。《Food Control 2007年第5期公布了用水蒸气蒸馏的 方法提取的土耳其分布的芳香新塔花挥发油，经GC-MS鉴定，胡薄荷酮(31. 86%)，1，8-桉叶 素(12. 21%)及柠檬烯(10. 48%)为主要成分。((Journal de Mycologie Medicale》2009 年 第19期公开了用水蒸气蒸馏方法获得的伊朗产芳香新塔花挥发油抑制白色念珠菌(ATCC 10231)的活性，用大量稀释法测得 MIC、MFC 分别为 560 μ g/ml、1120 μ g/ml。((Journal of Essential Oil Bearing Plants》2007年第4期公开了用水蒸气蒸馏的方法获得的伊朗产 芳香新塔花挥发油，用GC-MS的方法鉴定了主要成分为胡薄荷酮(44. 5%)、松油醇(14. 5%) 及乙酸甲脂(10. 9%)，并测定了对大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，绿脓杆菌，伤寒杆菌和肺炎 克雷伯菌最低抑菌浓度(分别为0. 003,0. 033,0. 033,0. 067,0. 067% (ν/ν))。中国专利 CN101524402A公开了用CO2超临界萃取技术提取挥发油的方法。这些报告都与本发明涉及 的芳香新塔花挥发油主要化学成分或含量不同。没有任何文献报道过用芳香新塔花挥发油防治油菜菌核病。在本发明中，通过体 内、体外实验证实了芳香新塔花挥发油在接触和挥发条件下对核盘菌菌丝生长有较好的 抑制作用。测定了不同浓度芳香新塔花挥发油在接触实验时对于菌丝生长的抑制作用， 在挥发油浓度低于0. 3 μ 1/ml时对核盘菌菌丝生长抑制率在20%以下，在挥发油浓度为 0. 9-1. 5 μ 1/ml时，对于菌丝生长的抑制率可达85-100%。在进行不同浓度芳香新塔花挥发 油在挥发条件下对于菌丝生长的抑制作用实验时，挥发油浓度在0.04μ 1/ml air以下时对 于核盘菌菌丝生长没有抑制作用，当挥发油浓度为0. 14-0. 18 μ 1/ml air时对于菌丝生长 的抑制率达90-100%。芳香新塔花挥发油在接触和挥发条件下对核盘菌菌核萌发有较好的抑制作用。接 触条件下，测定了不同浓度芳香新塔花挥发油对于核盘菌菌核萌发的抑制作用，当挥发油 浓度低于0. 2 μ 1/ml以下时，对于菌核萌发没有抑制作用，当挥发油浓度为1. 2-1. 4 μ 1/ml 时，菌核萌发率仅为10%至0。挥发条件下，测定了不同浓度芳香新塔花挥发油对于核盘菌 菌核萌发的抑制作用，当挥发油浓度低于0. 04 μ 1/ml air时其对核盘菌菌核萌发没有抑制 作用，而当浓度为0. 14-0. 16 μ 1/ml air时，菌核萌发率仅为10%至0。芳香新塔花挥发油对核盘菌有较强的体内抑制活性。在预防实验中，当挥发 油浓度为0.1-0. 3 μ 1/ml时，菌斑直径范围为29. 5-23. 7mm，而空白对照菌斑直径为 31. 4mm。当挥发油浓度在1. 0 μ 1/ml时，完全抑制了核盘菌菌丝在离体油菜叶片上的生长， 表现出良好的预防效果。在治疗实验中，当挥发油浓度为0. 6-1. 0 μ 1/ml时，菌斑直径为 13. 2-9. 2_，而空白对照菌斑直径为27. 5_，表现出明显的治疗效果。总之，本发明芳香新塔花挥发油的制备方法简单易行，容易操作。所制备的芳香新 塔花挥发油对核盘菌菌丝生长和菌核萌发有较好的抑制作用，可用于油菜菌核病的防治。
具体实施例方式实施例1 芳香新塔花挥发油的制备
将干燥的芳香新塔花地上部位粉碎过40目筛，称取400_500g，加入一定量的蒸馏水， 蒸馏，馏出物除掉水相后，每90-100ml挥发油用35-45g无水硫酸钠干燥。得到芳香新塔花挥发油，于4°C冰箱内密封避光保存。以此法获得的挥发油得率为1. 2% (v/m干重)以上。
采用日本SHIMADZU GCMS-QP2010型气相色谱-质谱联用仪。GC条件Rtx -5MS 毛细管柱(30mX0. 25mmX0. 25 mm)；进样口温度280°C ；分流进样，分流比20 1 ；用实施例 1所述的方法制备挥发油，挥发油进样量ι μ 1 ；载气(99. 999%的高纯氦)恒线速度40 cm/ sec ；吹扫气流量3 ml/min。升温程序初始温度70 °C，保持2 min ；再以10 V /min程序 升温至250°C，保持lOmin。MS条件电子轰击源(Electron Impact, EI)，电子能量为70 eV,离子源温度200°C，接口温度220°C。选取SCAN模式时，质量扫描范围为3(T500(m/z)， 溶剂延迟2. 5 min。根据保留时间，同时对各化合物质谱在NIST数据库进行相似检索，对各 组分进行定性分析，其相对含量采用面积归一化法进行计算。GC-MS分析结果见表1。从芳 香新塔花挥发油中共鉴定出了 21个化合物(表1)，占总含量的98. 29wt%。主要物质有胡薄 荷酮(53. 51wt%)，异薄荷酮(10. 37wt%)及香芹酮(5. 67wt%)等。表1芳香新塔花挥发油主要化学成分__
呆留时间I化合物名称I相对峰面积(％)
1_5. 759 二丙酮醇_^36_
29.435梓檬烯0.28
311.554薄荷酮3.36
411. 724异薄荷酮10.37
511. 783龙脑0. 53
611.858薄荷脑0.61
711.902—异胡薄荷酮2.02
812. 143α . - 松油醇0. 70
912.426马鞭草烯酮0.89
10~ 12. 608 —1-异丙烯基-2-苯甲醚2.67—
Tl 12.882胡薄荷酮53. 51
12 12.943香芹酮5.67
13~13.051叔丁氧基-6-甲基环己烯1.51
14 13. 107胡椒酮3.27
了5 14. 377菊油环酮3.23
T6 14. 4923, 7- 二 甲基-6-壬烯 -1- 醇0. 42
17~ 16. 376‘十二烷基二甲基氧化胺0. 42
T8 16. 530石竹烯1.84
T9 17.487匙叶桉油烯醇0.29
20~17. 571—石竹烯氧化物0.45
21 17.947芹菜脑0.89
—I总计+98.29%
实施例2 芳香新塔花挥发油对核盘菌菌丝生长的抑制作用
在体外用接触、挥发实验测定了芳香新塔花挥发油对核盘菌菌丝生长的抑制作用。马 铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基。供试植物病原真菌核盘菌sclerotiorum)0在接触实验中，在直径90mm的培养皿中加入温度为40°C的PDA培养基20ml，再加 入一定量溶有0. lvol%吐温20的挥发油溶液与之混勻，获得挥发油终浓度为0. 1-1. 8 μ 1/ ml，待培养基凝固后接种活化好的核盘菌菌落边缘菌丝块(直径为6mm)，培养皿用 Parafilm密封置于20°C培养箱中培养4天后用十字交叉法测量菌丝生长直径，并计算菌丝 生长抑制率。在挥发实验中，在直径为70mm滤纸片上分别加入溶有0. 5vol%乙醇的不同浓度挥发油溶液1ml，在直径为90mm的培养皿加入20mlPDA培养基后将提供80ml的空间，将滤 纸片置于培养皿盖中央，此时培养皿中挥发油的终浓度为0.02-0. 2μ1/πι1 air。待培养基 凝固后接入活化好的核盘菌菌落边缘菌丝块(直径为6mm)，培养皿用Parafilm密封，置于 20°C培养箱中培养。以十字交叉法测量菌圈，并计算菌丝生长抑制率。 上述实验分别在培养基中加入等量的0. lvol%吐温20溶液(接触实验)及在滤纸 片上加入等量的0. 5vol%无菌乙醇溶液(挥发实验)作为空白组，进行对照。通过下列公式 计算菌丝生长抑制率(%) MGI=[(之一4)/之]\100，公式中之、為分别表示空白组及处理 组菌丝生长直径。每个浓度处理2个培养皿，整个实验重复3次。使用SPSS (13. 0)软件对数据进行处理分析。在接触条件下，在挥发油浓度低于 0. 3 μ 1/ml时对核盘菌菌丝生长抑制率在20%以下，在挥发油浓度为0. 9-1. 5 μ 1/ml时，对 于菌丝生长的抑制率可达85-100%。在挥发条件下，挥发油浓度在0.04 μ 1/ml air以下时 对于核盘菌菌丝生长没有抑制作用，当挥发油浓度为0. 14-0. 18 μ 1/ml air时对于菌丝生 长的抑制率达90-100%。实施例3 芳香新塔花挥发油对于核盘菌菌核萌发的抑制作用
在体外用接触、挥发实验测定了芳香新塔花挥发油对核盘菌菌核萌发的抑制作用。马 铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基。供试植物病原真菌核盘菌sclerotiorum)0在接触实验中，将无菌沙土 20ml与一定量的挥发油溶液(含吐温20 0. lvol%)在 直径为90mm的培养皿内混勻，获得挥发油的终浓度为0. 1-1. 6 μ 1/ml，每个浓度的培养皿 内沙土 (沙土含水量约为70% (w/w))深度为0. 5cm处放置10粒菌核，用Parafilm密封， 在20°C培养箱内培养10天后，观察菌核萌发菌丝情况，以长出菌丝的菌核即认为是萌发菌 核，计算萌发率。在挥发实验中，在直径为90mm的培养皿内放入灭菌沙土 (沙土含水量约为70%(w/ w))，在直径为70mm滤纸片上分别加入溶于0. 5vol%乙醇的不同浓度挥发油1ml，再将滤纸 片置于培养皿盖中央，获得挥发油的终浓度为0.02- 0. 18 μ 1/ml air。每个浓度的培养皿 内沙土表面放置10粒菌核，培养皿用Parafilm密封在20°C培养箱内培养10天后，观察菌 核萌发菌丝情况，以长出菌丝的菌核即认为是萌发菌核，计算萌发率。在以上实验中，在培养基中加入等量的0. lvol%吐温20溶液(接触实验)及在滤纸 片上加入等量的0. 5vol%无菌乙醇溶液(挥发实验)作为空白组，进行对照。通过下列公式 计算萌发率萌发率(％)=菌核萌发数/菌核总数X 100。每个浓度处理2个培养皿，整个 实验重复3次。使用SPSS (13. 0)软件对数据进行处理分析。在接触条件下，当挥发油浓度低于 0. 2 μ 1/ml以下时，对于菌核萌发没有抑制作用，当挥发油浓度为1. 2-1. 4 μ 1/ml时，菌核 萌发率仅为10%至0。在挥发条件下，当挥发油浓度低于0.04 μ 1/ml air时其对核盘菌菌 核萌发没有抑制作用，而当浓度为0. 14-0. 16 μ 1/ml air时，菌核萌发率仅为10%至0。实施例4 芳香新塔花挥发油对油菜菌核病的防治实验
用离体叶片，测定了芳香新塔花挥发油对核盘菌菌丝在叶片上生长的抑制作用。供试 油菜(Sral5lSica campestris L.，品种“中油821”)于8月上旬在室外环境条件下种植油 菜。具体种植方法如下，取用75vol%乙醇消毒后的油菜种子10粒埋于装有湿润栽培土的 花盆内(直径为80mm)内，覆盖种子的土壤厚度约为20mm。长出子叶时要适当遮阴，防治种苗晒伤，待油菜长出真叶后，可增加光照时间，促进其生长。油菜生长5周后，长出叶片 约4-6片时，可用于莳萝子挥发油抑制核盘菌生长体内实验。供试植物病原真菌核盘菌 {Sclerotinia sclerotioruni) 在预防实验中，取“中油821”油菜叶片2片放置于培养皿中(直径为90mm)，叶片 底垫滤纸(直径90_)，将不同浓度(0. 1-1. 0μ 1/ml)挥发油溶液(0. lvol%吐温20) 5ml用 IOml注射器喷洒于叶片上，培养皿用封口膜(Parafilm)密封置于20°C培养箱中培养，12h 后，在叶片上接种活化好的核盘菌菌落边缘菌丝块(直径为6 mm)，每片叶片上接种1块。培 养3天后用十字交叉法测量叶片上的菌斑大小。在治疗实验中，取“中油821”油菜叶片2片放置于培养皿中(直径为90mm)，叶 片底垫滤纸(直径90mm)，先接种活化好的核盘菌菌落边缘菌丝块(直径为6mm)，每片叶 片上接种1块。用封口膜(Parafilm)密封置于20°C培养箱中培养，12h后，将不同浓度 (0. 1-1. 0μ 1/ml)挥发油溶液(0. 1%吐温20) 5ml用IOml注射器喷洒于叶片上，密封继续 培养3天后，用十字交叉法测量叶片上的菌斑大小。使用SPSS (13.0)软件对数据进行处理分析。芳香新塔花挥发油对核盘菌有较强 的体内抑制活性。在预防实验中，当挥发油浓度为0.1-0. 3 μ /ml时，菌斑直径范围为 29. 5-23. 7mm，而空白对照菌斑直径为31. 4mm。当挥发油浓度在1. 0μ 1/ml时，完全抑制了 核盘菌菌丝在离体油菜叶片上的生长，表现出良好的预防效果。在治疗实验中，当挥发油浓 度为0. 6-1.0 μ 1/ml时，菌斑直径为13. 2-9. 2mm，而空白对照菌斑直径为27. 5mm，表现出明 显的治疗效果。
权利要求
1.一种芳香新塔花挥发油的制备方法，其特征在于将干燥的芳香新塔花地上部位粉 碎，称取粉碎后的芳香新塔花，加入蒸馏水，进行水蒸气蒸馏，馏出物除掉水相后，干燥得芳 香新塔花挥发油。
2.如权利要求1所述的芳香新塔花挥发油的制备方法，其特征在于将干燥的芳香新 塔花地上部位粉碎过40目筛。
3.如权利要求1所述的芳香新塔花挥发油的制备方法，其特征在于馏出物除掉水相 后，每90-100ml挥发油用35-45g无水硫酸钠干燥。
4.芳香新塔花挥发油用于抑制核盘菌菌丝的生长。
5.芳香新塔花挥发油用于抑制核盘菌菌核的萌发。
6.芳香新塔花挥发油用于油菜菌核病的防治。
全文摘要
本发明属于农药技术领域，提供了一种芳香新塔花挥发油的制备方法将干燥的芳香新塔花地上部位粉碎，称取粉碎后的芳香新塔花，加入蒸馏水，进行水蒸气蒸馏，馏出物除掉水相后，干燥得芳香新塔花挥发油。本发明的制备方法简单易行，容易操作。分别在接触、挥发实验条件下测定芳香新塔花挥发油对核盘菌菌丝生长及菌核萌发的抑制作用。结果证明芳香新塔花挥发油核盘菌菌丝生长和菌核萌发有较好的抑制作用，体内抑制核盘菌菌丝生长也表现出较好活性，可用于油菜菌核病的防治。
文档编号A01N33/24GK102093932SQ20101057999
公开日2011年6月15日 申请日期2010年12月9日 优先权日2010年12月9日
发明者何敬胜, 曾红, 王有为, 班小泉, 田俊, 陈玉欣, 黄博 申请人:武汉大学