专利名称：一种芒属植物五节芒体胚组培快速繁殖方法
技术领域：
本发明涉及五节芒(i/^ca/^Am基于胚性愈伤的组培快繁技术 领域，更具体涉及一种芒属植物五节芒体胚组培快速繁殖方法，它适应于以五节芒幼穗为 外植体通过愈伤诱导途径获得幼苗，以及增值、生根、驯化与移栽。
背景技术：
国内关于芒属植物的组培快繁技术，在20世纪90年代就有相关报道，他们分 别采用了幼叶、下胚轴、幼根，幼穗作为外植体进行芒属植物的快繁技术，但其出愈率和分 化率都各不相同，以幼穗的繁殖效率最高，但并未获得胚性愈伤。另外，在2005年也有关于 芒属植物组培快繁技术的报道，利用了茎秆扦插技术得到了幼苗，但是这也是利用的器官 发生途径，并未得到胚性愈伤。而我们的研究是利用幼穗为外植体得到了胚性愈伤，再继 续做分化、移栽等实验。因此可以直接做转基因等相关后续试验，不仅达到了快速高效的目 的，同时为五节芒的转基因操作提供了可靠的组培体系。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种芒属植物五节芒体胚组培快速繁殖方法，方法易 行，操作简便，繁殖系数大，获得的愈伤繁殖率高，约为100%。为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施
中国是芒属植物资源分布的中心，并且五节芒的分布范围较广。五节芒能在荒山、荒 坡、丘陵、江河湖滩等无敌贫瘠的地方生长，它不仅适应性非常强，而且可以解决能粮之争 的矛盾。五节芒的生长周期短，一般其生长周期在180天左右，光合作用和光形态建成相对 较短，收获后不影响生态系统的结构，生物量大，可燃性强，作为能源消耗时可以实现(X)2的 零排放。鉴于目前全世界范围内的能源危机和国内较少的相关科学研究，科研工作者应该 充分利用中国这类优质的草本生物质资源，对这类植物进入深一步的研究。本发明的内容 包括以五节芒幼穗为外植体诱导胚性愈伤的初代培养基，生苗继代培养基，以及幼苗的生 根诱导培养基。本发明建立基于胚性愈伤的五节芒组培快繁体系，增值率高(5-6倍)，增值稳定， 根系健壮，移栽成活率高，是适于商业扩繁五节芒的成熟技术。一种芒属植物五节芒体胚组培快速繁殖方法，其步骤是
1、 幼穗选取选取处于颍花原基形成期的幼穗，幼穗内种子尚未形成，中轴也比较 软，还没形成基本的分支。2、 用初代培养基进行初代诱导将其剪成2-3厘米小段，先用75% (体积比，以 下相同)酒精消毒(30-35s)，然后用0. 1% (质量体积比，以下相同)氯化汞浸泡(3-5分钟)， 再用无菌水冲洗(3-5次)，将其接种在幼穗的初代诱导培养基上。经过(30-35天)的初代 诱导，获得胚性愈伤。培养条件为2418°C，每天光照14-16小时(采用人工光源照射)，光 强为2000LX。初代培养基为以下配方选其一 A =MS培养基附加激动素KTl-5mg/L，萘乙酸ΝΑΑ0. 1-0. 5mg/L，蔗糖 30g/L，PhytagelR 3g/L 或 B =MS 培养基附加激动素 KTl_7mg/L，萘 乙酸 ΝΑΑ0. 1-0. 5mg/L，6 水氯化镁 MgCl2 ·6Η20800π^/1，蔗糖 30g/L，PhytagelR 3g/L。采 用这两种培养基中的任何一种培养基都能诱导出状态良好的胚性愈伤组织，生长9-11天 在幼穗基部开始出愈，愈伤状态良好，为白色或淡黄色松散愈伤。3、用生苗培养基对生苗继代培养所获得的胚性愈伤在继代培养基上继代生 苗，(25-30天)继代一次，增殖系数为5-6。培养条件为M_28°C，每天光照14-16小时(采用 人工光源照射)，光强为2000LX。生苗培养基配方为以下配方选其一 :k :MS培养基附加激动 素 KTl-ang/L，萘乙酸 ΝΑΑ0. 1-0. 3mg/L，蔗糖 30g/L，活性炭 3_8g/L。PhytagelR 3g/L 或 B MS培养基附加激动素KTl-ang/L，萘乙酸ΝΑΑ0. 1-0. 3mg/L, 6水氯化镁MgCl2 · 6H20800mg/ L，蔗糖30g/L，活性炭3-8g/L , PhytagelR 3g/L。将胚性愈伤转到其中任何一种生苗培养 基之后2-4天，愈伤开始转绿，6-8天开始分化出芽，9-11天左右即可形成小幼苗。4、 用生根诱导培养基进行生根诱导所生幼苗在生根诱导培养基上诱导生根， 培养(25-30天)，生根率达70%以上。培养条件为M_28°C，每天光照14-16小时(采用人工 光源照射)，光强为2000LX。生根诱导培养基为以下配方选其一 A:l/2 MS培养基附加激动 素 KT2-;3mg/L，萘乙酸 ΝΑΑ0. 1-0. 5mg/L，蔗糖 30g/L，WiytagelR 3g/L 或 B :MS 培养基附加激 动素 KT2-;3mg/L，萘乙酸 ΝΑΑ0. 1-0. :3mg/L，蔗糖 30g/L，活性炭 3_8g/L，PhytagelR3g/L0 将 长到10-15厘米的幼苗转到任意一种生根培养基上，大概4-6天幼苗就会分化出大量白色 或黄色的根，且根系发达。5、驯化移栽在温室内，将生长健壮的、株高在10-15厘米的组培苗移栽到由蛭 石组成的驯化苗圃中驯化。每天早上7点定时给幼苗喷施驯化培养液和清水，大约15 - 20d 后，视幼苗长势，即可移栽到苗圃中。温室条件为15°C _25°C，照明使用卤光，光照(14-16 小时)，光照强度为2000LX。移栽到苗圃后，幼苗长势良好，生长健壮，根系发达，存活率较 高，获得了大量健壮的五节芒幼苗。本方法胚性愈伤出愈率高，愈伤再诱导生苗率高，组培苗驯化移栽后，成活率高， 适用于五节芒种苗的产业化生产以及为后续转基因奠定基础。本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果
a)本发明消毒方法简单，且效率高，初代污染率几乎为零。b)本发明得到的愈伤繁殖率高，约为100%。c)本发明一次得到了组培快繁和转基因组培体系，为后续转基因工作 打下基础。
图1为一种五节芒体胚愈伤示意图。此图为五节芒以幼穗为外植体又到处的愈伤，从图中可以看到，愈伤组织呈淡黄 色或白色，结构松散。图2为一种五节芒幼苗示意图。此图为愈伤转入分化培养基上幼苗的生长图，图中可见幼苗长势较好，生命力强， 并有根长出。图3为一种五节芒驯化移栽示意图。
此图为幼苗移栽到加有营养液的蛭石中。
具体实施例方式实施例1
一种芒属植物五节芒体胚组培快速繁殖方法，其步骤是
1、 幼穗选取选取处于颍花原基形成期的幼穗，幼穗内种子尚未形成，中轴也比较 软，还没形成基本的分支。2、 用初代培养基进行初代诱导将其剪成2-3厘米小段，先用75%酒精消毒 30s，然后用0. 1%氯化汞浸泡5分钟，再用无菌水冲洗三次，将其接种在幼穗的初代诱导培 养基上。经过35天的初代诱导，获得胚性愈伤。培养条件为25°C，每天光照16个小时，光强 为2000LX。诱导初代培养基为A :MS培养基附加激动素KTl-5mg/L，萘乙酸ΝΑΑ0. 1-0. 5mg/ L，蔗糖30g/L，，PhytagelR 3g/L。生长10天左右在幼穗基部开始出愈，愈伤状态良好，为白 色或淡黄色松散愈伤。3、用生苗培养基对生苗继代培养所获得的胚性愈伤在继代培养基上继代生 苗，30天继代一次，增殖系数为5-6。培养条件为25°C，每天光照16个小时，光强为2000LX。 生苗培养基配方为A =MS培养基附加激动素KTl-ang/L，萘乙酸ΝΑΑ0. 1-0. 3mg/L,蔗糖 30g/L，活性炭3-8g/L ,PhytagelR 3g/L。将胚性愈伤转到其中任何一种生苗培养基之后3 天左右，愈伤开始转绿，7天左右开始分化出芽，10天左右即可形成小幼苗。4、用生根诱导培养基进行生根诱导所生幼苗在在生根诱导培养基上诱导生 根，培养30天，生根率达70%以上。培养条件为25°C，每天光照16个小时，光强为2000LX。 生根诱导培养基为A 1/2 MS培养基附加激动素KT2-;3mg/L，萘乙酸ΝΑΑ0. 1-0. 5mg/L，蔗糖 30g/L, PhytagelR 3g/L。将长到10-15厘米的幼苗转到生根培养基上，大概5天左右幼苗 就会分化出大量白色或黄色的根，且根系发达。驯化移栽在温室内，将生长健壮的、株高在5-6厘米的组培苗移栽到由蛭石组成 的驯化苗圃中驯化。每天定期给幼苗喷施驯化培养液和清水，大约15d后，视幼苗长势，即 可移栽到苗圃中。温室条件20°C，照明使用卤光，光照16小时，光照强度为2000LX。移栽到 苗圃后，幼苗长势良好，生长健壮，根系发达，存活率较高，获得了大量健壮的五节芒幼苗。
权利要求
1. 一种芒属植物五节芒体胚组培快速繁殖方法，其步骤是A、幼穗选取选取处于颍花原基形成期的幼穗；B、用初代培养基进行初代诱导将其剪成2-3厘米小段，先用75%体积比的酒精消 毒30-3 ，然后用0. 1%质量体积比的氯化汞浸泡3-5分钟，再用无菌水冲洗3-5次，将 其接种在幼穗的初代诱导培养基上，经过30-35天的初代诱导，获得胚性愈伤，培养条 件为2448°C，每天光照14-16，光强为2000LX，初代培养基为A =MS培养基附加激动素 KTl-5mg/L，萘乙酸 ΝΑΑ0. 1-0. 5mg/L，蔗糖 30g/L，PhytagelR 3g/L 或 B :MS 培养基附加激 动素 KTl-7mg/L，萘乙酸 ΝΑΑ0. 1-0. 5mg/L，6 水氯化镁 MgCl2 · 6H20800mg/L,蔗糖 30g/L, PhytagelR 3g/L，采用这两种培养基中的任何一种培养基都能诱导出胚性愈伤组织，生长 9-11天在幼穗基部开始出愈，为白色或淡黄色松散愈伤；C、用生苗培养基对生苗继代培养所获得的胚性愈伤在继代培养基上继代生苗，25-30 天继代一次，增殖系数为5-6，培养条件为M-28°C，每天光照14-16小时，光强为2000LX， 生苗培养基配方为A =MS培养基附加激动素KTl-ang/L，萘乙酸NAAO. 1-0. 3mg/L,蔗糖 30g/L，活性炭3-8g/L，PhytagelR 3g/L或B =MS培养基附加激动素KTl_2mg/L，萘乙酸 ΝΑΑ0. 1-0. 3mg/L, 6 水氯化镁 MgCl2 ·6Η20800π^/1，蔗糖 30g/L,活性炭 3_8g/L，PhytagelR 3g/L，将胚性愈伤转到其中任何一种生苗培养基之后2-4天，愈伤开始转绿，6-8天开始分 化出芽，9-11天形成小幼苗；D、用生根诱导培养基进行生根诱导所生幼苗在生根诱导培养基上诱导生根，培养 25-30天，培养条件为M_28°C，每天光照14-16小时，光强为2000LX，生根诱导培养基为 A 1/2 MS 培养基附加激动素 KT2-;3mg/L，萘乙酸 ΝΑΑ0. 1-0. 5mg/L,蔗糖 30g/L，PhytagelR 3g/L或B =MS培养基附加激动素KT2-;3mg/L，萘乙酸ΝΑΑ0. 1-0. 3mg/L,蔗糖30g/L，活性炭 3-8g/L，WiytagelR3g/L，长到10-15厘米的幼苗转到任意一种生根培养基上，4_6天幼苗分 化出白色或黄色的根；E、驯化移栽在温室内，将生长健壮的、株高在10-15厘米的组培苗移栽到由蛭石组成 的驯化苗圃中驯化，每天定期给幼苗喷施驯化培养液和清水，15 - 20d后，移栽到苗圃中， 温室条件为15°C -25°C，照明使用卤光，光照14-16小时，光照强度为2000LX，获得五节芒幼田ο
全文摘要
本发明公开了一种芒属植物五节芒体胚组培快速繁殖方法，其步骤是A、幼穗选取选取处于颍花原基形成期的幼穗；B、用初代培养基进行初代诱导剪成小段，用酒精消毒，用氯化汞浸泡，冲洗，接种在初代诱导培养基上；C、用生苗培养基对生苗继代培养所获得的胚性愈伤在继代培养基上继代生苗，继代，增殖系数，每天光照；D、用生根诱导培养基进行生根诱导所生幼苗在生根诱导培养基上诱导生根，培养，每天光照；E、驯化移栽在温室内，组培苗移栽到由蛭石组成的驯化苗圃中驯化，每天定期给幼苗喷施驯化培养液和清水，移栽到苗圃中，获得五节芒幼苗。方法易行，操作简便，繁殖系数大，到的愈伤繁殖率高，约为100%。
文档编号A01H4/00GK102090338SQ20101058990
公开日2011年6月15日 申请日期2010年12月15日 优先权日2010年12月15日
发明者刁英, 周发松, 胡中立, 胡小虎, 胡晖, 赵玲玲 申请人:湖北光芒能源植物有限公司