通过选择表观遗传学修饰种群改进作物产量的制作方法

专利名称：通过选择表观遗传学修饰种群改进作物产量的制作方法
技术领域：
本发明涉及农业领域。更具体地，提供用于选择植物(包括作物)种群的方法，这些种群表现出高能量使用效率或与耐旱性结合的高能量使用效率，并且它们只在它们的表观遗传状态方面有所不同，与未选择的种群相比，允许增加此类所选择的并且表观遗传学上不同的种群的产量。还提供了表现出高能量使用效率的表观遗传学上不同的植物和植物种群，这可以通过它们的结合的更低细胞呼吸速率和细胞的更高能量含量、通过它们的增加的抗坏血酸盐含量和/或增加的线粒体呼吸链中的复合体I含量来进行鉴别。进一步提供了表现出与耐旱性结合的高能量使用效率的表观遗传学上不同的植物和植物种群。可以将表观遗传学修饰固定并且传递给后代。还发现表观遗传学能量使用效率组分可以在杂种优势顶部上添加并且可以导致更高产量的杂种。背景以足够的数量和质量生产农产品并且特别是生产食品和饲料，是愈发具有挑战性的任务。一方面，由于世界人口的增长以及大部分世界人口的平均生活标准的增长，对农产品的需求存在持续的增长。另一方面，适合或可用于农业的区域持续缩小，部分因为气候条件变化，这可以导致以前适合用于农业的区域退化。对于增加农作物产量潜能存在持续需求，或者在欠佳的或不利的非生物条件下生长农作物时，至少保持这种产量潜能。到目前为止，对于增加内在产量潜能所作的努力已经主要集中在开发作物内的遗传变异性。通过传统育种技术，将现存的或诱导的变异等位基因拖入新组合。最近，已经通过分子技术扩大变异性池，分子技术允许遗传物质跨种、以及甚至跨界、跨障碍交换。然而，对于表观遗传学控制机制在决定数量性状(例如产量)方面可能起的作用投入了远远更少的关注。确实，甚至在遗传上相同的个体的一个种群内，所有数量性状(例如动物的大小和重量或作物的产量、特别是种子产量)表现出具有正常分布的变异性。观察到的表型变异性的基础是遗传组分、环境因素以及还有表观遗传学组分。已经有文件说明，在植物中，在对胁迫的短期和长期适应中，表观遗传学控制组分的重要性(Molinier 等人，2006，Transgeneration memory of stress in plants. Nature 442，1046-1049)。 此外，已经证明，改变的表观遗传状态可以被传递给未暴露于或不再暴露于产生诱导作用的触发物的连续世代(也在 Jablonka 禾口 Raz，2009 Transgenerational epigenetic inheritance !prevalence, mechanisms, and implications for the study of heredity and evolution. The Quarterly Review of Biology 84，No. 2，131—176 巾#了 ( ! )。然而没有直接证明了轮回选择允许驱动数量性状的表观遗传学组分朝向正态分布曲线的末尾。换言之，对于从一个种群(特别是一个遗传上一致的种群)中影响或者选择对于数量性状具有高于或低于平均值的值的那些个体并且在一个(亚)种群中固定所选择的表观遗传学组分的能力，现有技术保持沉默。Enfield 和同事(Enfield, F. D.，Comstock, R. E. &Braskerud, 0. Selection for pupa weight in Tribolium castaneum. I. Parameters in base populations. Genetics 54,523-533(1966) ；Kaufman,P. K. &Enfield,F. D. , Comstock, R. E. Stabilizing selectionfor pupa weight in Tribolium castaneum. Genetics 87，324-341 (1977))说明了多个实验，借此从通过具有MOOyg的平均蛹重量的两只近交的粉甲虫之间的杂交获得的一个种群开始，通过连续近交120代，他们能够选择具有5800 μ g的平均蛹重量的一个种群。对于经过如此多的近交世代以后仍保持如此多的遗传变异性，Enfield等人表示出惊讶。然而在选择过程的某些阶段，不是不可能为了表观遗传学变异性进行选择而不是为了遗传变异性。这进一步由从影响蛹重量的基因的纯合子的近交系开始的多个相同实验支持(Enfield, F. D. &Braskerud, 0. Mutational variance for pupa weight in Tribolium castaneum. Theor. App1. Genet. 77,416-420(1989))。已经采用不同的参数来建立与植物产量潜能的关联。在产量潜能和更低细胞呼吸速率之间已经发现正相关。Wilson说明了在黑麦草中对于成熟叶子的暗呼吸速率的选择的反应，以及它对于幼苗生长和模拟草皮的影响(Wilson Ann. Bot. 49，303-312 (1982)) Wilson和Jones说明了成熟叶子的暗呼吸速率的选择对于黑麦草CV.S23的作物产量的影响(Wilson and Jones Ann. Bot. 49，313-320 (1982))。Kraus 等人报告了取决于植株密度(Kraus et al. New Phytol. 123, 39-44 (1993))，并且取决于对于成熟叶子呼吸速率中的差异，处理选择的两个种群的黑麦草的产量的作用(Kraus et al. Physiol. Plant. 89，341-346 (1993))的黑麦草 cv. S23 的 “慢”呼吸种群胜过“快”呼吸种群的产量优势。Nunes-Nesi等人说明了，在转基因番茄植物中，由于减少了线粒体苹果酸脱氢酶活性，增强的光合性能和生长(Nunes-Nesi et al. Plant Physiol. 137，611-622 (2005))。 Juczczuk等人报告了线粒体基因组重排对于MSC16黄瓜(Cucumis sativus)突变体的呼吸活性、光合作用、光呼吸和能态的影响(Juczczuk et al，Physiol. Plant. 131， 527-541 (2007) ) 0 De Block和De Brouwer说明了用来定量油菜品系和杂种的活力的简单并且有力的体外测定方法(Plant Physiol. Biochem. 40,845-852 (2002)) W002/066972提供了用于确定具有良好的配合力的亲本近交植物品系、用于确定能够产生具有高杂种优势的杂交品系的亲本近交植物品系的良好组合、以及进一步用于确定不同植物品系的农艺学性能的方法和手段，它可以在体外在受控和胁迫条件下，通过确定在线粒体中的电子流来进行。然而，对于遗传上一致的植物种群中的低细胞呼吸速率，没有现有技术文件说明了轮回选择，这允许建立具有更高产量潜能和对不利生物条件的耐受性的植物的(亚)种群。在连续世代中，表观遗传学组分可以进一步遗传(并且表现为显性基因或共显性因子)。发明概述在本发明的一个实施方案中，一种选择具有高能量使用效率的植物(例如芸薹属油菜、番茄植物或水稻植物，或它们的种子)的种群的方法，包括以下步骤a.提供一个由遗传上一致的多株个体植物组成的种群；b.从所述种群的个体植物中分离出一个组织样本或外植体，其方式为允许所述取样的个体植物的进一步的培养；c.可任选地，在激活所述植物中新陈代谢的条件下，对所述组织样本或外植体进行培养；d.通过分析所述植物的所述样本，确定所述个体植物的细胞呼吸速率；e.选择多株植物，其中所述样本与来自所述种群的这些样本的平均细胞呼吸作用相比展示了较低的细胞呼气作用、优选地是显著地更低；f.生长所选择的这些植物并且从每个所选择的植物中繁殖出一个克隆的子代植物品系；g.对克隆的子代植物的每个品系确定能量使用效率；h.选择一个克隆植物的品系，其中所述能量使用效率是高于克隆的子代植物的所有品系的能量使用效率的平均值，优选地选择具有最高能量使用效率的克隆子代植物的品系；i.从所述选择的克隆子代植物的品系生长个体植物的一个种群；并且j.在所述随后的种群上将步骤b到步骤i重复至少一次。可以通过确定细胞呼吸并且确定在分离的样本中的NAD(P)H含量来确定能量使用效率，并用NAD(P)H含量除以呼吸作用以确定能量使用效率。还可以通过测量植物的抗坏血酸盐或抗坏血酸含量、或者通过测量在所述样本中的呼吸链复合体I活性来确定能量使用效率。提供的方法包括通过确定所述样本中的细胞呼吸作用和以下参数中的至少一个， 鉴别具有高能量使用效率的植物抗坏血酸盐含量；NAD(P)H含量；呼吸链复合体I活性； 或光呼吸作用；并且选择具有比对照植物(即未经对于低细胞呼吸作用的重复选择方案的原始种群的植物)更低的细胞呼吸作用和更高的抗坏血酸盐含量、或更高的呼吸链复合体 I活性或更低光呼吸作用的那些植物。典型地，细胞呼吸速率可以在对照植物的细胞呼吸速率的85 %和95 %之间，并且NAD (P) H含量可以在对照植物的NAD (P) H含量的95 %至105 % 之间。呼吸链复合体I活性可以典型地在对照植物的呼吸链复合体I活性的120%至140% 之间，并且抗坏血酸盐含量可以在对照植物的抗坏血酸盐含量的150%至220%之间。光呼吸作用优选在对照植物的光呼吸作用的80%至92%之间。本发明还提供了用于生产具有增加的产量潜能的植物或种子的种群的一种方法， 它包括根据在此展示的选择方法从遗传上一致的个体植物的种群中选择具有高能量使用效率的那些植物或者植物或种子的亚种群。选择的植物可以进一步与其他植物杂交以获得具有高能量使用效率和增加的产量潜能的子代。在本发明的另一个实施方案中，提供了用于生产具有增加的活力和/或对于不利的非生物条件的增加的耐受性的植物或种子的种群的一种方法，它包括根据在此展示的选择方法从遗传上一致的个体植物的种群中选择具有高能量使用效率的那些植物或者植物或种子的亚种群。选择的植物可以进一步与其他植物杂交以获得具有高能量使用效率并且具有增加的活力和/或对不利的非生物条件的增加的耐受性的子代。在本发明的另一个实施方案中，提供了一个用于增加收获量的方法，包括以下步骤通过对于低细胞呼吸的重复选择，从一个遗传上一致的种群生产具有高能量使用效率的植物或种子的亚种群；在田地里生长这些植物或种子；并且从那些植物或种子产生收获。在本发明的又一个实施方案中，提供了用于生产具有高产量或对于不利的非生物条件的耐受性的杂交植物或杂种种子的一种方法，该方法包括以下步骤a.根据在此提到的选择方法，选择具有高能量使用效率的植物种群用于至少一个亲本近交植物包括用于至少两个亲本近交植物；并且如果一个亲本植物是一种雄性不育植物，并且所述雄性不育植物的保持需要使用保持系，还可任选地用于该保持系；b.将所述种群的植物与另一种近交植物进行杂交；c.分离所述杂交的杂种种子；并且d.可任选地，从所述种子生长杂交植物。在本发明的又一个实施方案中，提供了通过在此说明的方法之一所选择的植物、 种子、或植物种群。因此，本发明提供了具有高能量使用效率的植物，包括杂交植物(例如芸薹属油菜、番茄植物或水稻植物、或它们的种子)，其特征在于该植物具有低细胞呼吸作用，例如细胞呼吸速率在对照植物的细胞呼吸速率的85%和95%之间，以及至少一个、多个、或全部以下特征i.可以在对照植物的抗坏血酸盐含量的150%至220%之间的高的抗坏血酸盐含量；ii.可以在对照植物的NAD(P)H含量的95%至105%之间的高的NAD(P)H含量；iii.可以在对照植物的呼吸链复合体I活性的120%至140%之间的高的呼吸链复合体I活性；或iv.可以在对照植物的光呼吸作用的80%至92%之间的低的光呼吸作用；由此对照植物是未经对于低细胞呼吸速率的重复选择方案的遗传上一致的种群的植物。附图简要说明


图1 用于分离低芥酸菜籽中细胞呼吸和能量使用效率不同的低芥酸菜籽亚种群的选择方案。从一个同基因双单倍体品系开始选择。让约五株分别具有最低最高呼吸的选择的个体植物自交，并且各自测试子代的呼吸和能量使用效率。对分别具有最高最低能量使用效率的种群继续选择。图2 六株选择的低芥酸菜籽种群对比原始起始种群的呼吸作用。这些值是对比起始品系“Simon”的平均数而标准化的％值。每一点代表从一株个体植物获得的数据。每一种群含有约200株植物。框中的条代表该种群的中位数。这些条代表具有均值的指示的标准差。图3 六个选择的低芥酸菜籽种群的能量使用效率。这些值是对比起始品系 “Simon”的平均数而标准化的％值。中间的灰色条(左)代表获得的呼吸值；浅灰色条(中) 代表获得的能量含量(NAD(P)H含量)值；深灰色条(右)代表能量使用效率(NAD(P)H含量除以呼吸作用)。图4:选择的低芥酸菜籽种群对高温的耐受性。在拍照前，植物经过在 45摄氏度下10天。在左侧的植物是来自选择的具有低能量使用效率的种群；右侧的植物是来自选择的具有高能量使用效率的种群。图5 在选择的低芥酸菜籽种群中，能量使用效率和种子产量之间的关联。这些值是对比起始品系“Simon”的平均数而标准化的％值。浅灰色条代表标准化的能量使用效率而深灰色条代表种子产量。图6 在选择的低芥酸菜籽种群中，能量使用效率和抗坏血酸含量之间的关联。用mg/L表示抗坏血酸含量；**p < 0. 01。
图7 在选择的低芥酸菜籽种群中的光呼吸速率。这些值是对比起始品系“Simon” 的平均数而标准化的％值。图8 从选择的分别具有低、高能量使用效率的品系与未选择的品系之间的杂交衍生的子代植物的细胞呼吸速率。这些值是对比起始品系“Simon”的平均数而标准化的％ 值。在每一条目的左侧的条(中灰色)代表从具有高(左半边)或低(右半边)能量使用效率的自交品系获得的子代的值。在每一条目的中间的条(浅灰色)代表从具有高(右半边)或低(左半边)能量使用效率的品系与未选择的Simon品系的杂交获得的子代的值， 其中Simon品系是父本。在每一条目的右侧的条(深灰色)代表从具有高(右半边)或低 (左半边)能量使用效率的品系与未选择的Simon品系的杂交获得的子代的值，其中Simon 品系是母本。图9 用于高能量使用效率父本、母本和保持系亲本和杂交世代的轮回选择的选择方案。
图10 通过未选择的父本和母本的杂交产生的商用杂交植物(左侧)与通过对于高能量使用效率进行选择的父本和母本的杂交产生的杂交植物(右侧)之间的比较。
图11 通过对于标准化的高能量使用效率(％ )进行选择的父本和母本的杂交产生的杂交品系的种子产量与通过未选择的父本和母本的杂交产生的对照杂交植物对比。
图12 对于高能量使用效率和耐旱性进行选择的亚品系的生长。播种选择的亚品系和对照品系的种子。一半植物经过正常灌溉制度。8天以后，在“干旱制度，，下的植物不再给提供水，持续8天，直至开始出现枯萎症状。弄湿土壤。约3天以后植物开始再次枯萎。 灌溉植物并且在1天以后确定这些植物的鲜重。图示1代表在正常灌溉下，对照植物和耐旱的选择品系(LR-PEG_1574)的数据。简
图1代表在干旱制度下，对照植物和耐旱的选择品系(LR-PEG_1574)的数据。
图13是在限制供水条件下生长的对照植物和耐旱植物的一幅图。下面的图示代表对照植物和耐旱植物的鲜重的测量。本发明的不同实施方案的详细说明本发明基于发明者的以下出乎意料的观察a.在低呼吸，特别是低呼吸和高能量含量(即高能量使用效率)以及产量潜能之间，甚至在遗传上一致的种群中的个体植物之间存在关联。b.可以通过对于具有高能量使用效率的个体植物的轮回选择并且繁殖此类植物的子代而导致植物亚种群，其中这些植物亚种群的能量使用效率高于原始起始种群，并且其中高能量使用效率表型被稳定地传递给连续世代，来固定在遗传上一致的种群中的控制高能量使用效率的表观遗传学化合物。c.在与未选择的种群的杂交时，表观遗传学决定的高能量使用效率表型可以被传递，并且表现为显性或共显性性状。d.可以选择表观遗传学控制的高能量使用效率表型用于亲本近交系(和/或保持系)，并且在杂交后代中提供额外的产量潜能增加(超过杂种优势)。e.高能量使用效率表型与高复合体I活性和抗坏血酸含量有关，因此可以被认为是高能量使用效率的指示物。f.高能量使用效率表型和光呼吸反相关。
在本发明的一个第一实施方案中，提供了一个方法，它允许从遗传上一致的个体植物的最初种群中选择具有高能量使用效率(“EUE”)和由此而来的高产量(特别是种子产量潜能)的植物的(亚)种群。高能量使用效率是数量性状，为此在遗传上一致的植物的种群内存在变异性(沿正态分布曲线)。该方法包括以下步骤a.提供一个由遗传上一致的多株个体植物组成的种群；b.从所述种群的个体植物中分离出一个组织样本或外植体，其方式为允许所述取样的个体植物的进一步的培养；c.可任选地，在激活所述植物中新陈代谢的条件下，对所述组织样本或外植体进行培养；d.通过分析所述植物的所述样本，确定所述个体植物的细胞呼吸速率；e.选择多株植物，其中所述样本与来自所述种群的这些样本的平均细胞呼吸作用相比展示了较低的细胞呼气作用、优选地是显著地更低；f.生长所选择的植物并且从每个所选择的植物中繁殖出一个克隆的子代植物品系；g.对克隆的子代植物的每个品系确定能量使用效率；h.选择一个克隆植物的品系，其中所述能量使用效率是高于克隆的子代植物的所有品系的能量使用效率的平均值，优选地选择具有最高能量使用效率的克隆子代植物的品系；i.从所述选择的克隆子代植物的品系生长个体植物的一个种群；并且j.在所述随后的种群上将步骤b到步骤i重复至少一次。如在此使用的那样，“一个遗传上一致的植物的种群”是一个植物种群，其中个体植物是纯种的，即在基因组核苷酸序列水平显示很小的或没有变异，至少对于数量性状相关的遗传因子，特别是高能量使用效率和低细胞呼吸速率相关的遗传因子是如此。遗传上一致的植物可以是近交植物，但是还可以是遗传上相同的植物(例如双单倍体植物)的种群。双单倍体植物是通过在单倍体植物品系(它可以从配子或它的前体细胞(例如小孢子)产生)中，自发的或诱导的单倍体基因组加倍而获得的植物。通过染色体加倍，在自交双单倍体植物的一个世代和所有子代植物中可以产生的完全纯和的植物是基本遗传相同的(安全的，罕见突变、缺失或基因组重排)。通过植物繁殖或增殖(例如像马铃薯、甘蔗、 包括白杨或桉树的树)获得其他遗传上一致的植物。如在此使用的那样，“能量使用效率”是“能量含量”和“细胞呼吸”的商。在植物细胞的能量含量保持约等于对照植物的值时，在植物中可以达到高能量使用效率，但是在通过更低的细胞呼吸达到这样的能量含量时。“细胞呼吸”是指使用氧作为一种电子受体，并且可以便利地通过测量通过线粒体呼吸链的电子转移来定量，例如通过测量组织样本还原2，3，5氯化三苯基四氮唑(TTC)的能力。虽然认为是为了在此定义的测定的目的，TTC是最合适的物质，但是其他指示物分子 (例如MTT (3- (4，5- 二甲基噻唑-2-基)-2，5联苯-2H-四唑鐺)可以用于测量在线粒体电子传递链中的电子、流(参见 Musser 禾口 Oseroff，1994 Photochemistry and Photobiology 59，pp 621-626)。TTC还原发生在复合体IV在线粒体呼吸链的末端。因此，TTC还原反映通过线粒体呼吸链(包括替代的氧化呼吸通路)的总电子流。电子通过复合体I、复合体II、以及内部的和外部的替代的NAD(P)H脱氢酶进入线粒体电子传递链。已经由De Block 和 De Brouwer, 2002 (Plant Physiol. Biochem. 40，845-852)说明了合适的 TTC 还原测定。植物细胞的“能量含量”是指通常用于储存能量的分子(例如ATP、NADH和NADPH) 的量。可以便利地通过测量样本的NAD (P)H含量来确定样本的能量含量。已经由Nakamura 等人在 2003 年说明了合适的测定(Quantification of intracellular NAD(P)H can monitor an imbalance of DNA single strand break repair in base excision repair deficient cells in real time. Nucl. Acids Res. 31,17el04)。应选择其中能量使用效率至少与确定的对照植物的能量使用效率一样好的植物或植物亚种群，优选高于对照植物的能量使用效率。虽然认为能量使用效率不存在具体上限，但是已经观察到可以获得具有约5%至约15%、特别是约10%高于对照植物的能量使用效率的能量使用效率的亚种群或植物。如在此使用的那样，对照植物或对照种群是遗传上一致的但未经对具有更高能量使用效率的植物的反复选择的植物的种群。可以最初选择对于细胞呼吸，低于确定的对照植物的细胞呼吸的植物或植物亚种群。典型地，具有高能量使用效率的植物具有在对照植物的细胞呼吸速率的85%和95% 之间的细胞呼吸速率。已经观察到，使具有更低呼吸速率的一个种群经过产生具有甚至更低的呼吸速率的植物种群的附加循环的选择通常是可行的，然而其中能量含量水平也下降了。这样选择的植物种群具有不优于未选择的对照植物种群的产量潜能，并且在具体情况下，产量可能甚至更糟。特别是在伴随能量含量水平的下降时，选择具有太低细胞呼吸的种群不是有益的。呼吸速率低于对照植物的呼吸速率的75%，特别是结合低于对照植物的能量含量的75%的能量含量，优选应当是避免的。典型地重复用来选择具有在此说明的高能量使用效率的植物亚种群或植物的方法至少一次；然而植物可能经过至少三或四或五个循环的选择。为了避免选择具有太低呼吸循环的植物或植物种群，期待应当避免多于五个循环的选择(取决于植物种类)。已经观察到，选择的具有高能量使用效率的种群的特征还在于与对照植物相比， 增加的呼吸链复合体I活性，特征还在于与对照植物相比，增加的抗坏血酸含量。这些特征可以用作用来选择具有增加的能量使用效率的植物或植物(亚)种群的替代的或补充的标记。可以使用来自Merck (Darmstadt，德国)的反射测量抗坏血酸测试定量抗坏血酸盐含量。可以使用 Mitc^ciences (Eugene，oregon，美国)的复合体 I 活性MitoProf ile Dipstick 测定试剂盒定量复合体I活性。已经观察到，选择的亚种群比选择的对照植物更耐受不利的非生物条件。因此，本发明还提供了通过根据在此说明的方法选择植物或植物种群、用于生产具有对不利的非生物条件的增加的耐受性的植物种群或种子的方法。如在此使用的那样，“不利的非生物条件”包括干旱、缺水、低氧或缺氧条件、洪水、高或低的欠佳温度、高盐度、低养分水平、高臭氧浓度、高或低光浓度等等。此外，可以通过在模仿的不利的生长条件下，同时选择高能量使用效率来改进根据本发明的选择方法。可以选择具有高能量使用效率的耐旱植物，例如通过包括聚乙二醇 (polyethyleenglycol)，例如PEG6000，优选以4%至8%的范围，特别是5%至7. 5%，加入在此说明的选择方案中使用的介质。通过在含有PEG的介质上生长而单独选择的植物(没有确定和选择能量使用效率)通常具有致密的生长表型并且发育厚的角皮和细胞壁。通过结合在PEG6000上生长与高能量使用效率而选择的植物具有正常的生长表型，但是干旱条件下胜过对照植物(参见例如
图13)。因为在有性杂交中，通过选择具有高能量使用效率的植物亚种群或植物获得的产量改进可以传递给后代(表现为显性或共显性因子)，并且因为由于杂种优势，此外在杂交植物中的产量改进被附加至正常产量增加，本发明的一个进一步实施方案提供了用于生产具有高产量或对不利的非生物条件的耐受性的杂交植物或杂种种子的方法，包括a.根据在此说明的方法，选择具有高能量使用效率的植物种群用于至少一个亲本近交植物；b.将该种群的植物与另一种近交植物进行杂交；c.分离该杂交的杂种种子；并且d.可任选地，从该种子生长杂交植物。该选择方案可以进一步施用于两个亲本品系并且如果杂交生产涉及需要使用保持系用于保持母本的雄性不育，那么在保持系上还可以有益地使用在此说明的选择方案。优选地，组织样本或外植体是下胚轴外植体，但是可以使用其他外植体(例如愈伤组织、苗、叶圆片或整叶)产生相同效果。对于单子叶植物，第一真叶的叶基是合适的组织样本或外植体。进一步优选的是，外植体应当衍生自无菌的具有高呼吸速率或活性新陈代谢的体外生长材料。通过首先在包括一种合适的碳水化合物(例如蔗糖)的培养基上培养或孵育这些外植体来增强呼吸速率或新陈代谢，可以达到这点。更优选地，在诱导愈伤组织的培养基上培养外植体一段足以活化新陈代谢的时间，特别是培养约0至10天，优选约4 至6天，特别是约5天。优选地，这种诱导愈伤组织的培养基包括蔗糖，特别是约2%至3% 表用于培养外植体的优选的温度范围是约至25°C。当在此说明的方法被施用于有性繁殖的植物时，可以通过自花传粉(自交)并且收获产生的种子来达到从每一选择的植物至产生一个品系的克隆的子代植物的繁殖步骤。 当在此说明的方法被施用于营养繁殖的植物时，可以通过将植物分为合适的繁殖单元并且将它们栽培直至获得完整植物来达到从每一选择的植物至产生一个品系的克隆的子代植物的繁殖步骤。本发明还提供了具有高能量使用效率的选择的植物或植物种群，如可以通过在此说明的选择方法获得。这样的植物特征在于低细胞呼吸(低于如在此说明的对照植物的细胞呼吸)和至少一种以下特征高于对照植物的抗坏血酸；高于对照植物的NAD(P)H含量； 高于对照植物的呼吸链复合体I活性；以及低于对照植物的光呼吸。该选择方案已经成功地施用于水稻植物种群、欧洲油菜植物种群和番茄植物种群。然而，在此说明的方法和手段被认为适合所有植物细胞和植物、裸子植物和被子植物、 全部双子叶和单子叶植物细胞和植物，包括但不局限于拟南芥属、苜蓿、大麦、豆、玉米或玉蜀黍、棉花、亚麻、燕麦、豌豆、油菜、水稻、黑麦、草红花、高粱、大豆、向日葵、烟草和其他烟草属种类(包括本塞姆氏烟草)、小麦、芦笋、甜菜、青花椰菜、甘蓝、胡萝卜、花椰菜、芹菜、 黄瓜(cucmber)、茄子、莴苣、洋葱、油菜、胡椒、马铃薯、南瓜、小萝卜、菠菜、南瓜类植物、番茄、西葫芦、扁桃、苹果、杏、香蕉、黑莓、蓝莓、可可、樱桃、椰子、酸果蔓、海枣、葡萄、葡萄柚、 番石榴、猕猴桃、柠檬、青柠、芒果、甜瓜、油桃、橙子、番木瓜、西番莲、桃、花生、梨、菠萝、阿月浑子、李子、覆盆子、草莓、橘子、核桃和西瓜，芸薹属植物、甘蔗、蔬菜(包括菊苣、莴苣、番茄)、浮萍科(包括来自浮萍属、扁平无根萍属(Wolffiella)、多根紫萍属(Spirodela)、 少根紫萍属(Landoltia)、芜萍属(Wolffia)的种类)和甜菜。以下非限制性实例说明了根据本发明的方法和手段。除非在实例中另外阐明，所有技术都根据本领域的方案标准进行。实例实例1.研究方法用于呼吸作用和EUE的人工选择。籽苗在体外在补充有2%蔗糖的琼脂培养基半浓缩的Murashige和Skoog培养基(MS培养基)上生长两周。将这些籽苗的芽尖放在上面的培养基上用来生根，同时将每个籽苗的五个下胚轴外植体在诱导愈伤组织的培养基上培养五天(补充有3%蔗糖和lmg/L 2，4-D、0. 25mg/L NAA和lmg/L BAP的MS培养基)。对这些下胚轴外植体的细胞呼吸作用进行了测定。将分别具有最高最低呼吸作用的大约五个籽苗的生根的芽尖转移到用于通过自交生产种子的温室中。对一些获得的后代的大约35-40 个籽苗的呼吸作用和NAD (P) H含量都进行了测定。保留分别具有最低、最高的呼吸作用以及分别最高、最低的能源使用效率的品系。在一个方向上对分别具有最低、最高呼吸作用的品系的较低或较高的呼吸作用进行了下一循环的选择(
图1)。三到五个循环的选择就足以产生具有不同的呼吸作用和EUE的品系。在图9中描绘了杂交制种中对于呼吸作用和EUE 的选择。[56.]生理和生化测定。通过测定如所描述的(De Block和De Brouwer，在上)2， 3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)的减少对下胚轴外植体的细胞呼吸进行了定量。如所描述的(Nakamura等人，在上)对总NAD (P) H含量进行了定量。能量使用效率表达为标准值对 NAD (P) H含量与还原TTC量的对照的％比例。使用来自Merck (达姆施塔特，德国)的反射测量抗坏血酸测试对抗坏血酸含量进行了定量。使用来自MitoSciences (Eugene，oregon， 美国)的用于复合体I活性的MitoProfile Dipstick测定试剂盒对复合体I活性进行了定量。通过将子叶或叶块漂浮在含有3-5mg/L草丁膦的无铵盐培养基上在体外对光呼吸强度进行了测定。在连续光照条件下进行了 M小时的孵育(大约70μπιΟ1 m-2 sec-l)0如 (De Block et al. ,1995. The selection mechanism of phosphinothricin is influenced by the metabolic status of the tissue. Planta 197,619-626)所描述的对铵盐生产进行了定量。光呼吸作用被表达为产生的铵盐对于对照的百分比。田间试验。在五个具有不同土壤品质的地点进行了田间试验(从沙地的到肥沃的土壤)。每个地点含有六小块土地每品系。每小块土地是IOm2大小，对于每个地点对这些小块土地进行了不同的安排。产量表达为kg种子/块土地。统计。通过使用I^rism 5. 00版本(GraphPad软件，圣地亚哥，美国)带有Dunnett 后检验的单因子ANOVA对数据进行了统计学分析。2. H有高禾Π低的能量#用效率的诛穿他欧洲油勿的诛雇以及特+牛描沭从一个同基因的双单倍体欧洲油菜品系开始来消除由于不同遗传水平的差异引起的变化，对具有最低和最高的细胞呼吸作用的一些籽苗进行识别和保留(见“方法概述”-
图1显示了选择方案的一个示意性描述图)。总之，从来自双单倍体种群的200个籽苗开始对具有最低和最高的细胞呼吸作用的“Simon”籽苗进行了识别和保留。将分别具有最高和最低呼吸作用的五个籽苗的有根的芽尖转移到用于通过自交生产种子的温室中。对分别具有最高和最低EUE的两个种群进行了识别。这两个种群是用于对具有更高和更低的呼吸速率的品系分别地进行五个附加循环选择的起始材料。图2显示了产生的六个品系的呼吸作用具有较低呼吸作用的四个品系(LR76、破碎的LR76、LR77、LR79)以及具有较高呼吸作用的三个品系(HR80、HR82、HR83)相对于从其开始选择的对照。“破碎的LR76”品系衍生自从品系LR76开始的对于较低呼吸作用的进一步的选择。如将在下面示出的，破碎的 LR76品系的呼吸作用跌落到一个临界阈值以下，这导致了降低的活力。在个体植物水平上， 在一些高呼吸品系中存在巨大的变化(例如，平均值为125%的品系HR82相对于对照以及 74%的标准差)，然而这种变化在一些低呼吸品系中是最小限度的(例如，平均值为90%的品系LR76相对于对照以及18%的标准差)。从一个育种者的角度来看，高呼吸品系中的巨大变化表明了一种消极的行为，然而低呼吸品系中的有限的变化将会被评价为积极的。该高效率表明没有涉及到任何突变，伴随高效率产生了这些品系(每个选择循环从只有200 个籽苗开始)。扩展的AFLP-分析不能识别出在这些品系与该对照之间的差异，除了非常高的呼吸品系HR83之外，在HR83中检测到了一些染色体缺失和染色体倒位。这些植物有规则地显示了异常的发育和不育性。因此，由于它与该对照相比相似的呼吸频率，HR83没有被保留与LR79 —起用于进一步的分析。据预期高细胞呼吸作用将与高能量生产有关并且反之亦然。然而，当对反映能量含量的NAD(P)H总量进行测量时(表1 ；图3)，值的注意的是具有较高呼吸作用的一些品系具有较低的NAD(P)H水平。一些具有较低呼吸作用的品系具有较高的NAD(P)H含量，除品系“破碎的LR76”之外。当对NAD(P)H对呼吸作用的比率(能源使用效率(EUE))进行计算时，除品系“破碎的LR76”之外在呼吸作用与EUE之间发现了一种负相关性(表1-图 3)。可能地，品系破碎的LR76中的呼吸作用跌落到了一个临界阀值以下以维持足够的能量生产。在选择过程中，通过测量2，3，5_氯化三苯基四氮唑(TTC)由下胚轴外植体的减少对呼吸作用进行了定量。TTC减少发生在复合体IV的线粒体呼吸链的末端 (Rich, P. R. , Mischis, L. A. , Purton, S. &ffiskich, J. Τ. The sites of interaction of triphenyltetrazolium chloride with mitochondrial respiratory chains. FEMS Microbiol. Lett. 202，181-187 (2001))。因此，TTC减少反映了流过该线粒体呼吸链的总电子流，包含可替代的氧化呼吸途径。通过复合体I、复合体II以及内部的和外部的替代的 NAD (P)H脱氢酶这些电子进入线粒体电子运输链。在对照和选择的品系的第三个叶片中对复合体I (作为主要的脱氢酶)的活性进行了测定(表1)。在呼吸作用与复合体I活性之间发现了一种负相关性。最近，据发现L-半乳糖酸-1，4-内酯脱氢酶(植物抗坏血酸盐生物合成途径的最后的酶)与复合体I的一个800-kDa的亚复合体是有关联的并且在复合体I的积累过程中具有重要的功能，由于用于L-半乳糖酸-1，4-内酯脱氢酶的拟南芥属
會巨禾只累本 I (Pineauet al. L-galactono-1,4-lactone dehydrogenase is required for the accumulation of plant respiratory complex I. J. Biol. Chem. 283, 32500-32505(2008) ；Millar et al. Control of ascorbate synthesis by respiration and its implications for stress responses. Plant Physiol· 133，443—447 (2003))。这种在抗坏血酸盐生物合成与复合体I积累之间明显的相互关系促使我们对这些不同品系叶片中的抗坏血酸盐含量进行测定(表1-图6)。具有最高呼吸作用和最低复合体I活性的这些品系具有最低的抗坏血酸盐含量。反之也是正确的，具有低呼吸作用和高复合体I活性的这些品系具有高抗坏血酸盐含量。总之，这些结果表明分别具有高的、低的呼吸频率的品系分别具有降低的、增加的复合体I含量。这些高呼吸作用品系与缺乏复合体 I的NAD7亚基的美花烟草(Nicotiana sylvestris)的细胞质雄性不育II (CMSII)突变体相似(Guitierres et al. . Lack of mitochondrial and nuclear-encoded subunits of complex I and alteration of the respiratory chain in Nicotiana sylvestris mitochondrial deletion mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94,3436-3441 (1997)； Sabar et al. Complex I impairment, respiratory compensations, and photosynthetic decrease in nuclear and mitochondrial male sterile mutants of Nicotiana sylvestris. Plant Physiol. 124,1239-1249 (2000)) 50 CSMII 突变体不具有复合体 I 活性但是由于复合体IV(细胞色素氧化酶)的补充增强的活性仍然具有高呼吸作用。高呼吸作用很可能是由于可替代的NAD(P)H脱氢酶的增强的活性满足了细胞的ATP需要。一些具有高复合体I含量的品系在产生ATP方面是更加有效的导致更低呼吸频率。在烟草以及黄瓜中，据发现减小的复合体I能力导致了光呼吸的增加(Juczczuk et al. Effect of mitochondrial genome rearrangement on respiratory activity, photosynthesis, photorespiration and energy status of MSC 16 cucumber(Cucumis sativus)mutant. Physiol.Plant. 131，527-541 (2007) ；Priault et al.The lack of mitochondrial complex I in a CMSII mutant of Nicotiana sylvestris increases photorespiration through an increased internal resistance to CO diffusion. J. Exp. Bot. 57,3195-3207(2006)).类似地，我们还发现这些高呼吸作用芸薹属品系具有显著增加的光呼吸，然而这些低呼吸作用品系具有大大减少的光呼吸(表1-图7)。这意味着低呼吸作用(当并不是如在破碎的LR76品系中的一个太低的呼吸作用)与一种良好的生理状态相关联，而高呼吸作用与一种较低的适合性相关联。这些生理状态的这些特定的特性表明这些品系分别具有较高的、较低的胁迫耐性(图4)以及田间性能(表1-图5)。在三年中对这些选择的品系以及该对照品系进行了田间试验(每个品系五个地点其中10平方米的三个到六个重复)中的种子产量测试(表1-图5)。具有高EUE的一些低呼吸品系相对该对照具有平均8%更高的种子产量，而具有低EUE的一些高呼吸品系具有平均10% 的种子产量减少。在中等干旱胁迫的田地中，最好的高EUE品系相对该对照具有20%更高的产量，然而该高呼吸和低EUE品系的种子产量跌落20%。在EUE与种子产量之间存在一种很强的正相关性(Pearson相关性=0. 96)。基于我们的AFLP结果，从一个同基因的品系产生的这些高和低的呼吸品系的高效率、以及这些选择的品系相互之间是无差别的事实，表明这些品系的不同生理特性具有一个表观遗传学的基础。从温室中大约八代种子放大规模以及三年精心进行的田间试验，显而易见的是这些品系的表观遗传学状态通过自交被稳定地遗传。如在以前对于拟南芥属中表观遗传学重组成分所描^！白勺(Molinier et al. Transgeneration memory of stress in plants. Nature 442，1046-1049 Q006))，低芥酸菜籽的表观遗传学呼吸作用成分可以在与一种无选择的对照品系的相互回交中被遗传。例如，在高呼吸品系HR82中，自交和用HR82作为雄性和雌性对最初的Simon品系的回交导致了相对该对照分别地具有127%、1M%以及 1 %的呼吸作用的一些后代。同样对于低呼吸品系LR77也是正确的，其中自交和用LR77作为雄性和雌性对Simon的回交导致了相对该对照分别地具有89%、91 %以及92%的一些后代(图8)。 我们的结果表明仅仅基于指导表观遗传学成分来选择一种复杂的性状是可行的。 与经典的育种方案中的选择的主要差异是选择可能不仅仅在种群上进行但主要在植物水平并且这以一种循环的方式。通过将这些相同的选择方案应用于低芥酸菜籽的原种亲本品系(图9)，我们生产了在通过杂种优势的产量增加上具有5%的更高附加产量的杂交体 (
图10-11以及表2)。这表明低芥酸菜籽的选择方法的普遍实用性并且证实了该表观遗传学呼吸作用成分的跨代稳定性。实验进一步表明在其他植物物种中(例如水稻以及番茄) 这种类型的选择也是可行的。
权利要求
1.一种选择具有高能量使用效率的植物或种子的种群的方法，该方法包括以下步骤a.提供了由多株遗传上一致的个体植物组成的一个种群；b.从所述种群的个体植物中分离出一个组织样本或外植体，其方式为允许所述取样的个体植物的进一步的培养；c.可任选地，在激活所述植物中新陈代谢的条件下对所述组织样本或外植体进行培养；d.通过分析所述植物的所述样本确定所述个体植物的细胞呼吸速率；e.选择多株植物，其中所述样本与来自所述种群的这些样本的平均细胞呼吸作用相比展示了较低的细胞呼气作用、优选地是显著地更低；f.生长所选择的这些植物并且从每个所选择的植物中繁殖出一个克隆的子代植物品系；g.对克隆的子代植物的每个品系确定能量使用效率；h.选择一个克隆植物的品系，其中所述能量使用效率是高于克隆的子代植物的所有品系的能量使用效率的平均值，优选地选择具有最高能量使用效率的克隆子代植物的品系；i.从所述选择的克隆子代植物的品系生长个体植物的一个种群；并且 j.在所述随后的种群上将步骤b到步骤i重复至少一次。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述个体植物在遗传上是一致的。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述个体植物是双单倍体植物。
4.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述个体植物通过营养繁殖进行生产。
5.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述植物是近交植物。
6.根据权利要求1至5中任何一项所述的方法，其中所述步骤j被重复至少两次。
7.根据权利要求1至5中任何一项所述的方法，其中所述步骤j被重复至少五次。
8.根据权利要求1至7中任何一项所述的方法，其中所述从每个选择的植物中繁殖克隆的子代植物的一个品系是通过所述植物的自花传粉并且收获种子而实现。
9.根据权利要求1至7中任何一项所述的方法，其中所述从每个选择的植物中繁殖克隆的子代植物的一个品系是通过营养繁殖而实现。
10.根据权利要求1至9中任何一项所述的方法，其中所述能量使用效率是通过以下来确定的a在所述样本中确定细胞呼吸作用b在所述样本中确定NAD(P)H的含量；并且c让NAD(P)H的含量除以呼吸作用以确定该能量使用效率。
11.根据权利要求1至9中任何一项所述的方法，其中所述能量使用效率通过测量所述样本中的抗坏血酸盐含量来进行确定。
12.根据权利要求1至9中任何一项所述的方法，其中所述能量使用效率通过测量所述样本中的线粒体呼吸链的复合体I的活性来进行确定。
13.根据权利要求1至9中任何一项所述的方法，其中具有高能量使用效率的所述植物是通过以下来鉴定的a.确定所述样本中的细胞呼吸作用以及至少一个以下参数i.所述样本中的抗坏血酸盐含量； .所述样本中的NAD (P) H含量；iii.所述样本中的线粒体呼吸链的复合体I的活性；或iv.所述样本中的光呼吸作用；b.鉴定在所述样本中具有低细胞呼吸作用以及高抗坏血酸盐含量、或高呼吸链复合体 I活性或低光呼吸作用的植物。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述细胞呼吸速率是在对照植物的细胞呼吸速率的85%与95%之间。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述NAD(P) H含量是在对照植物的NAD (P) H含量的95%与105%之间。
16.根据权利要求13所述的方法，其中线粒体呼吸链活性的所述复合体I的活性是在对照植物的活性的120%与140%之间。
17.根据权利要求13所述的方法，其中所述抗坏血酸盐含量是在对照植物的抗坏血酸盐含量的150%与220%之间。
18.根据权利要求13所述的方法，其中所述光呼吸作用是在对照植物的光呼吸作用的 80%与92%之间。
19.根据权利要求1至18中任何一项所述的方法，其中通过将下胚轴从上胚轴切断对所述组织样本进行分离，从而该下胚轴组成了所述样本并且该上胚轴进一步生长成一个植物。
20.根据权利要求1至19中任何一项所述的方法，其中所述植物是一种芸薹属油菜籽油菜，一种番茄植物或水稻植物。
21.根据权利要求1至20中任何一项所述的方法，其中在模仿干旱条件的条件下进行在激活所述植物中的新陈代谢条件下的所述组织样本或外植体的所述培养。
22.根据权利要求1至20中任何一项所述的方法，其中在含有聚乙二醇的一些培养基上进行在激活所述植物中的新陈代谢条件下的所述组织样本或外植体的所述培养。
23.—种生产具有增加的产量潜能的植物或种子的种群的方法，该方法包括根据权利要求1至22中任何一项选择具有高能量使用效率的植物或种子的一个种群。
24.根据权利要求23所述的方法，其中将所述植物与另一种植物进行进一步杂交。
25.—种生产具有增加的活力和/或对不利的非生物条件增加的耐受性的植物或种子的种群的方法，该方法包括根据权利要求1至22中任何一项选择具有高能量使用效率的植物或种子的一个种群。
26.一种用于增加收获产量的方法，该方法包括a.根据权利要求25生产植物或种子的一个种群；b.在一块田地中生长所述植物或种子；c.从所述植物或种子中产生收获。
27.用于生产具有高产量或对不利的非生物条件的耐受性的一种杂交植物或杂种种子的方法，该方法包括a.根据权利要求1至22中任何一项选择具有高能量使用效率的植物的一个种群用于至少一个亲本近交植物；b.将所述种群的植物与另一种近交植物进行杂交；c.对所述杂交的杂种种子进行分离；并且d.可任选地，从所述种子生长杂交植物。
28.根据权利要求27所述的方法，其中根据权利要求1至22中任何一项的具有高能量使用效率的植物的一个种群被选择用于两个亲本近交植物。
29.根据权利要求27或权利要求观所述的方法，其中所述一个亲本植物是一种雄性不育的植物并且维系所述雄性不育植物需要使用一种保持系，其特征进一步在于根据权利要求1至20中任何一项的具有高能量使用效率的植物的一个种群也被选择用于该保持系。
30.一种植物、种子或植物的种群，通过权利要求1至四所述方法的任何一项而获得。
31.一种具有高能量使用效率的植物，其特征在于所述植物具有低细胞呼吸作用以及至少一项以下特征i.高抗坏血酸盐含量；ii.高NAD (P)H 含量;iii.高呼吸链复合体I活性；或iv.低光呼吸作用。
32.根据权利要求31所述的植物，其中所述细胞呼吸速率是在对照植物的细胞呼吸速率的85%与95%之间。
33.根据权利要求31或32所述的植物，其中所述NAD(P)H含量是在对照植物的NAD(P) H含量的95%与105%之间。
34.根据权利要求31至33中任何一项所述的植物，其中所述呼吸链复合体I活性是在对照植物的呼吸链复合体I活性的120%与140%之间。
35.根据权利要求31至33中任何一项所述的植物，其中所述抗坏血酸盐含量是在对照植物的抗坏血酸盐含量的150%与220%之间。
36.根据权利要求31至33中任何一项所述的植物，其中所述光呼吸作用是在对照植物的光呼吸作用的80%与92%之间。
37.根据权利要求31至36中任何一项所述的植物，其中所述植物是一种杂交植物。
38.根据权利要求31至37中任何一项所述的植物，该植物是在受限制的水条件下比同基因的对照植物具有更高的生长、产量或生物质生产的一种植物。
全文摘要
在此提供了用于选择具有改进的产量的表观遗传学上固定的作物的植物和种群的方法。
文档编号A01H3/00GK102469770SQ201080029108
公开日2012年5月23日 申请日期2010年6月11日 优先权日2009年6月29日
发明者布洛克 M·德 申请人:拜尔生物科学公司