专利名称：红叶石楠离体叶片体细胞胚诱导快繁培养基的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种红叶石楠离体叶片体细胞胚诱导快繁培养基，属于植物学领域。
背景技术：
红叶石楠iPhotinia χ frasery)是光叶石楠(P. glabra)和石楠(P. serrulata) 的杂交种，属于蔷薇科石楠属常绿阔叶小乔木或多枝丛生灌木，其广泛分布于日本、美国 及欧洲等地，因其新梢和嫩叶鲜艳如火，亮丽持久，修剪后萌芽力强，株形紧凑，在园林景 观中常用做高档色带；或培育成独干、球形树冠，在绿地中孤植；或作行道树；或盆栽后布 置于门廊或室内，效果均佳，其为一种观赏价值极高的园林植物。自上世纪九十年代红叶石楠被引入我国以来，其就被列为具有较高开发价值的彩 叶树种，但红叶石楠与我国许多原产树种相比，在我国种源稀少，至今未见有结实的报道， 而从国外引入的优良品种也因长期扦插繁殖，易感染叶斑病等真菌性病害，春夏季其又易 受蚜虫危害，其病毒严重，叶片花斑易脱落，观赏性下降，良种化程度降低；而劣质种苗的使 用又导致红叶石楠固有的优良特性日益丧失，这在一定程度上约束了该树种的发展和推广 应用，因此，选择、繁育优良红叶石楠品系成为一个十分突出的生产问题，组培快繁是红 叶石楠良种产业化的一种有效途径，相关方面的报道也较多，但有关红叶石楠叶片直接诱 导体细胞胚及再生快繁系统的技术研究未见有成功的报道。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种取材方便但种子繁殖困难 的优良红叶石楠株系叶片直接诱导体胚的形成并获得再生植株的红叶石楠离体叶片体细 胞胚诱导快繁培养基，以及利用胚状体再生植株叶片诱导体胚和不定芽的形成或直接诱导 不定芽的形成获得高频再生植株，以解决优良种苗种质退化的问题，为生产上提供量大质 优、提纯复壮的脱毒红叶石楠苗木；
为了实现上述发明目的，本发明是通过以下技术方案来实现的 一种红叶石楠离体叶片体细胞胚诱导快繁培养基，其特征在于，包括芽启动培养基、试 管苗增殖培养基、第一诱导体胚和/或不定芽形成培养基、第二诱导体胚和/或不定芽形成 培养基、第三诱导体胚和/或不定芽形成培养基、第一体胚和/或不定芽生长与分化培养 基、第二体胚和/或不定芽生长与分化培养基和壮苗生根培养基，其中
芽启动培养基为改良MS + 0. 5 1. 0 Higr1BA + 0. 5 1. Omgr1KT + 0. 1 0. 2mgL"1NAA + 6. 0 7. OgL"1 琼脂 + 3(^171 蔗糖，且 pH 值为 5. 8 6. 0 ；
试管苗增殖培养基为改良MS + 1. 0 2. OmgL^1BA + 1. 0 2. Omgr1KT + 0. 1
0.SmgL-1NAA + 6. 0 7. OgL"1 琼脂 + 3(^171 蔗糖，且 pH 值为 5. 8 6. 0 ；
第一诱导体胚和/或不定芽形成培养基为改良MS + 0. SmgL-^, 4-D + 0. 5
1.OmgL-1BA + 0. 5 2. OmgL-1NAA + 3. 0 3. 5gL、hytagel + 20gL_1 蔗糖，且 pH 值为 5. 8 6. 0 ；第二诱导体胚和/或不定芽形成培养基为改良MS + 0. ImgLU-D + 0. SmgL^BA + 10 30 Higr1NAA + 3. 0 3. SgI^phytagel + 20gL_1 蔗糖，且 pH 值为 5. 8 6. 0 ；
第三诱导体胚和/或不定芽形成培养基为改良MS + 2.0-4.011^171 NAA + 0. 2 0. 5mgL_12, 4-D + 0. 5 2. OmgL-1BA+ 0. 5 2. 0 mgL_1KT+ 6. 0 7. OgL-1 琼月旨 + 30gL_1 蔗 糖，且PH值为5. 8 6.0 ；
第一体胚和/或不定芽生长与分化培养基为改良MS + 2. 0 4. Omg L^1BA + 3. 0 3. SgL-1Phytagel + 2(^171 蔗糖，且 pH 值为 5. 8 6. 0 ；
第二体胚和/或不定芽生长与分化培养基为改良MS + 2. OmgL—1 BA + 1.0 mgL—1 IBA + 2.0 mgL-1 KT + 6. 0 7. OgL"1 琼脂 + 3(^171 蔗糖，且 pH 值为 5. 8 6. 0 ；
壮苗生根培养基为1/2改良MS + 0. 2 0. 5mgL_1 IBA + 0 0. 05mgL_1NAA + 6. 0 7. OgL"1琼脂+ 20§υ'蔗糖，且pH值为5. 8 6. 0。上述的改良MS包括常量营养元素、微量营养元素和有机试剂。其中，常量营养元素的组分和其对应的浓度如下
硝酸钾 硫酸铵 七水硫酸镁 二水氯化钙 无水磷酸二氢钾 乙二胺四乙酸二钠 七水硫酸亚铁
1900 mg/L ； 1650 mg/L ； 370mg/L ； 440 mg/L ； 170 mg/L ； 37. 3 mg/L ； 27. 8 mg/L。微量营养元素的组分和其对应的浓度如下 四水硫酸锰22. 3 mg/L ；
硫酸锌8. 6 mg/L ；
硼酸6. 2 mg/L ；
碘化钾0. 83 mg/L ；
钼酸钠0. 25 mg/L ；
硫酸铜0. 025 mg/L ；
氯化钴0. 025 mg/L。有机试剂的组分和其对应的浓度如下 盐酸硫胺素 10. 0 mg/L ；
烟酸1. 0 mg/L ；
盐酸吡哆醇 1. Omg/L ； 肌醇100. 0 mg/L。本发明的有益效果是本发明所述的红叶石楠离体叶片体细胞胚诱导快繁培养基 通过改良基本培养基及成分、调整培养条件等配套措施，使得植株移栽成活率可达到95% 以上，种苗生长健壮，可有效解决优良种苗种质退化问题，也可为生产上提供大量优质提纯 复壮的脱毒红叶石楠苗木，此外，还可为红叶石楠遗传转化或诱变育种选育新品种提供一 个理想的受体体系。
图1为本发明所述的增值培养的试管苗；
图2为本发明所述的红叶石楠的叶片在不同时期的体细胞胚； 图3为本发明所述的红叶石楠的叶片体胚形成的不定芽； 图4为本发明所述的红叶石楠的叶片直接形成的不定牙； 图5为本发明所述的增殖快繁形成的丛生芽； 图6为本发明所述的经过生根培养及炼苗后的试管苗； 图7为本发明所述的经过移栽长成的植株。
具体实施例方式下面将结合附图和具体实施例，详细说明本发明的
具体实施例方式
图1为本发明所述的增值培养的试管苗；图2为本发明所述的红叶石楠的叶片在不同 时期的体细胞胚；图3为本发明所述的红叶石楠的叶片体胚形成的不定芽；图4为本发明 所述的红叶石楠的叶片直接形成的不定牙；图5为本发明所述的增殖快繁形成的丛生芽； 图6为本发明所述的经过生根培养及炼苗后的试管苗；图7为本发明所述的经过移栽长成 的植株。如图1-图7所示
红叶石楠离体叶片体细胞胚诱导快繁培养基，包括芽启动培养基、试管苗增殖培养基、 第一诱导体胚和/或不定芽形成培养基、第二诱导体胚和/或不定芽形成培养基、第三诱导 体胚和/或不定芽形成培养基、第一体胚和/或不定芽生长与分化培养基、第二体胚和/或 不定芽生长与分化培养基和壮苗生根培养基，其中
芽启动培养基为改良MS + 0. 5 1. 0 Higr1BA + 0. 5 1. Omgr1KT + 0. 1 0. 2mgL"1NAA + 6. 0 7. OgL"1 琼脂 + 3(^171 蔗糖，且 pH 值为 5. 8 6. 0 ；
试管苗增殖培养基为改良MS + 1. 0 2. OmgL^1BA + 1. 0 2. Omgr1KT + 0. 1
0.SmgL-1NAA + 6. 0 7. OgL"1 琼脂 + 3(^171 蔗糖，且 pH 值为 5. 8 6. 0 ；
第一诱导体胚和/或不定芽形成培养基为改良MS + 0. SmgL-^, 4-D + 0. 5
1.OmgL-1BA + 0. 5 2. OmgL-1NAA + 3. 0 3. 5gL、hytagel + 20gL_1 蔗糖，且 pH 值为 5. 8 6. 0 ；
第二诱导体胚和/或不定芽形成培养基为改良MS + 0. ImgLU-D + 0. SmgL^BA + 10 30 Higr1NAA + 3. 0 3. SgI^phytagel + 20gL_1 蔗糖，且 pH 值为 5. 8 6. 0 ；
第三诱导体胚和/或不定芽形成培养基为改良MS + 2.0-4.011^171 NAA + 0. 2 0. 5mgL_12, 4-D + 0· 5 2. OmgL-1BA+ 0· 5 2· 0 mgL_1KT+ 6· 0 7. OgL-1 琼月旨 + 30gL_1 蔗 糖，且pH值为5. 8 6.0 ；
第一体胚和/或不定芽生长与分化培养基为改良MS + 2. 0 4. Omg L^1BA + 3. 0 3. SgL-1Phytagel + 2(^171 蔗糖，且 pH 值为 5. 8 6. 0 ；
第二体胚和/或不定芽生长与分化培养基为改良MS + 2. OmgL—1 BA + 1.0 mgL—1 IBA + 2.0 mgL-1 KT + 6. 0 7. OgL"1 琼脂 + 3(^171 蔗糖，且 pH 值为 5. 8 6. 0 ；
壮苗生根培养基为1/2改良MS + 0. 2 0. 5mgL_1 IBA + 0 0. 05mgL_1NAA + 6. 0 7. OgL"1琼脂+ 20§υ'蔗糖，且pH值为5. 8 6. 0。
实施例1
试管苗增殖培养基为改良MS + 1. OmgL^1BA + 1. Omgr1KT + 0. 1 mgL^NAA + 6. OgL"1 琼脂+ SOgr1蔗糖，且pH值为5.8 ；第一诱导体胚和/或不定芽形成培养基为改良MS + 0. 5mgL_12, 4-D + 0. 5mgL_1BA + 0. 5mgL_1NAA + 3. OgI^phytagel + 20gL-1 蔗糖，且 pH 值 为5. 8 ；第二诱导体胚和/或不定芽形成培养基为改良MS + 0. lmgL、，4-D + 0. 5mgI^BA + IOmgL-1NAA + 3. OgL^phytagel + 2(^171蔗糖，且pH值为5. 8 ；第三诱导体胚和/或不 定芽形成培养基为改良MS + 2. OmgL^1 NAA + 0. 2mgL_12, 4-D + 0. 5mgL_1BA+ 0.5 mgl^KT+ 6. OgL-1琼脂+ SOgL-1蔗糖，且pH值为5. 8 ；第一体胚和/或不定芽生长与分化培养基为 改良 MS + 2. Omg L4BA + 3. OgL^phytagel + 20gU'蔗糖，且 pH 值为 5. 8 ；第二体胚和 / 或不定芽生长与分化培养基为改良MS + 2. OmgL-1 BA + 1.0 mgL"1 IBA + 2.0 mgL"1 KT + 6. OgL-1琼脂+ SOgL-1蔗糖，且pH值为5. 8 ；壮苗生根培养基为:1/2改良MS + 0. 2mgr1 IBA + 0. OlmgL-1NAA + 6. OgL"1 琼脂 + 20gU'蔗糖，且 pH 值为 5. 8。 实施例2
试管苗增殖培养基为改良 MS + 1. 5mgL_1BA + 1. 5mgL_1KT + 0. 3mgL_1NAA + 6. 5gL_1 琼脂+ SOgr1蔗糖，且pH值为5.9 ；第一诱导体胚和/或不定芽形成培养基为改良MS + 0. 5mgL_12, 4-D + 0. 7mgL_1BA + 1. 2mgL_1NAA + 3. 2gL、hytagel + 20gL-1 蔗糖，且 pH 值 为5. 9 ；第二诱导体胚和/或不定芽形成培养基为改良MS + 0. lmgL、，4-D + 0. 5mgI^BA + 20mgr1NAA + 3. 2gr1phytagel + 2(^171蔗糖，且pH值为5. 9 ；第三诱导体胚和/或不 定芽形成培养基为改良 MS + 3. OmgL^1 NAA + 0. 4mgL_12, 4-D + 1. OmgL-1BA+ 1. 2mgL_1KT+ 6. 7gL_i琼脂+ SOgL-1蔗糖，且pH值为5. 9 ；第一体胚和/或不定芽生长与分化培养基为 改良 MS + 3. Omg L4BA + 3. SgL^phytagel + 2(^171 蔗糖，且 pH 值为 5. 9 ；第二体胚和 / 或不定芽生长与分化培养基为改良MS + 2. OmgL-1 BA + 1.0 mgL"1 IBA + 2.0 mgL"1 KT +
6.SgL-1琼脂+ SOgL-1蔗糖，且pH值为5. 9 ；壮苗生根培养基为:1/2改良MS + 0. —gL-1 IBA + 0. OSmgr1NAA + 6. SgL"1 琼脂 + 20gU'蔗糖，且 pH 值为 5. 9。实施例3
试管苗增殖培养基为改良 MS + 2. OmgL^1BA + 2. OmgL^1KT + 0. 5mgL_1NAA + 7. OgL—1 琼脂+ SOgr1蔗糖，且pH值为6.0 ；第一诱导体胚和/或不定芽形成培养基为改良MS + 0. 5mgL_12, 4-D + LOmgL-1BA + 2. OmgL-1NAA + 3. 5gL、hytagel + 20gL-1 蔗糖，且 pH 值 为6. 0 ；第二诱导体胚和/或不定芽形成培养基为改良MS + 0. lmgL、，4-D + 0. 5mgI^BA + 30 HigL-1NAA + 3. ^L4Phytagel + 2(^171蔗糖，且pH值为6. 0 ；第三诱导体胚和/或不 定芽形成培养基为改良MS + 4. OmgL^1 NAA + 0. 5mgL_12, 4-D + 2. OmgL^1BA+ 2.0 mgl^KT+
7.OgL"1琼脂+ SOgL-1蔗糖，且pH值为6. 0 ；第一体胚和/或不定芽生长与分化培养基为 改良 MS + 4. Omg L4BA + 3. SgL^phytagel + 20gU'蔗糖，且 pH 值为 6. 0 ；第二体胚和 / 或不定芽生长与分化培养基为改良MS + 2. OmgL-1 BA + 1.0 mgL"1 IBA + 2.0 mgL"1 KT + 7. OgL-1琼脂+ SOgL-1蔗糖，且pH值为6. 0 ；壮苗生根培养基为:1/2改良MS + 0. SmgL—1 IBA + 0. OSmgL-1NAA + 7. OgL"1 琼脂 + 20gU'蔗糖，且 pH 值为 6. 0。其中上述的3个实施例中，改良MS包括常量营养元素、微量营养元素和有机试剂， 其中，常量营养元素的组分和其对应的浓度如下硝酸钾 硫酸铵 七水硫酸镁 二水氯化钙 无水磷酸二氢钾 乙二胺四乙酸二钠 七水硫酸亚铁
1900 mg/L ； 1650 mg/L ； 370mg/L ； 440 mg/L ； 170 mg/L ； 37. 3 mg/L ； 27. 8 mg/L。微量营养元素的组分和其对应的浓度如下 四水硫酸锰22. 3 mg/L ；
硫酸锌8. 6 mg/L ；
硼酸6. 2 mg/L ；
碘化钾0. 83 mg/L ；
钼酸钠0. 25 mg/L ；
硫酸铜0. 025 mg/L ；
氯化钴0. 025 mg/L。有机试剂的组分和其对应的浓度如下 盐酸硫胺素 10. 0 mg/L ；
烟酸1. 0 mg/L ；
盐酸吡哆醇 1. Omg/L ； 肌醇100. O mg/L。本发明利用近几年植物细胞和组织培养中的热点研究植物体细胞胚胎发生技术 快繁种子繁殖困难的红叶石楠才是解决上述问题的根本途径，它不但能解决红叶石楠种 质退化的问题，达到优良种苗脱毒、提纯复壮及快速繁殖的目的，而且也是高效再生种子来 源的重要途径，还是进行遗传转化或诱变育种选育新品种的理想受体材料。以上已以较佳实施例公开了本发明，然其并非用以限制本发明，凡采用等同替换 或者等效变换方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种红叶石楠离体叶片体细胞胚诱导快繁培养基，其特征在于，包括芽启动培养基、 试管苗增殖培养基、第一诱导体胚和/或不定芽形成培养基、第二诱导体胚和/或不定芽形 成培养基、第三诱导体胚和/或不定芽形成培养基、第一体胚和/或不定芽生长与分化培养 基、第二体胚和/或不定芽生长与分化培养基和壮苗生根培养基，其中所述的芽启动培养基为改良MS + 0. 5 1. 0 Higr1BA + 0. 5 1. OmgL^1KT + 0. 1 0. 2mgL"1NAA + 6. 0 7. OgL"1 琼脂 + 3(^171 蔗糖，且 pH 值为 5. 8 6. 0 ；所述的试管苗增殖培养基为改良MS + 1. 0 2. OmgL-1BA + 1. 0 2. OmgL^KT +0.1 0. 5mgL,AA + 6. 0 7. OgL"1 琼脂 + 30gL_1 蔗糖，且 pH 值为 5. 8 6. 0 ；所述的第一诱导体胚和/或不定芽形成培养基为改良MS + 0. SmgL-^, 4-D + 0. 5 1.OmgL-1BA + 0. 5 2. OmgL-1NAA + 3. 0 3. 5gL、hytagel + 20gL_1 蔗糖，且 pH 值为5.8 6. 0 ；所述的第二诱导体胚和/或不定芽形成培养基为改良MS + 0. ImgL-^, 4-D + 0. 5mgL_1BA + 10 30 mgl^NM + 3. 0 3. SgI^phytagel + 2(^171 蔗糖，且pH值为 5. 8 6.0 ；所述的第三诱导体胚和/或不定芽形成培养基为改良MS + 2.0 4. OmgI/1 NAA + 0. 2 0. 5mgL_12, 4-D + 0· 5 2. OmgL-1BA+ 0· 5 2· 0 mgl^KT+ 6· 0 7. OgL-1 琼月旨 + SOgL-1蔗糖，且pH值为5. 8 6. 0 ；所述的第一体胚和/或不定芽生长与分化培养基为改良MS + 2.0 4. Omg L^1BA + 3. 0 3. SgL-1Phytagel + 20gL_1 蔗糖，且 pH 值为 5. 8 6. 0 ；所述的第二体胚和/或不定芽生长与分化培养基改良MS + 2. OmgL-1 BA + 1.0 mgL—1 IBA + 2. 0 mgr1 KT + 6. 0 7. OgL"1 琼脂 + 30gL_1 蔗糖，且 pH 值为 5. 8 6. 0 ；所述的壮苗生根培养基1/2改良MS + 0.2 0. Smgr1 IBA + 0 0. OSmgr1NAA + 6. 0 7. OgL"1琼脂+ 20§υ'蔗糖，且pH值为5. 8 6. 0。
2.根据权利要求1所述的红叶石楠离体叶片体细胞胚诱导快繁培养基，其特征在于所 述的改良MS包括常量营养元素、微量营养元素和有机试剂。
3.根据权利要求2所述的红叶石楠离体叶片体细胞胚诱导快繁培养基，其特征在于所 述的常量营养元素的组分和其对应的浓度如下硝酸钾1900 mg/L ；硫酸铵1650 mg/L ；七水硫酸镁370mg/L ；二水氯化钙440 mg/L ；无水磷酸二氢钾170 mg/L ；乙二胺四乙酸二钠37. 3 mg/L;七水硫酸亚铁27. 8 mg/L。
4.根据权利要求2所述的红叶石楠离体叶片体细胞胚诱导快繁培养基，其特征在于所 述的微量营养元素的组分和其对应的浓度如下四水硫酸锰22. 3 mg/L ；硫酸锌8. 6 mg/L ；硼酸6. 2 mg/L ；碘化钾0. 83 mg/L ；钼酸钠0. 25 mg/L ；硫酸铜0. 025 mg/L ；氯化钴0. 025 mg/L。
5.根据权利要求2所述的红叶石楠离体叶片体细胞胚诱导快繁培养方法，其特征在于 所述的有机试剂的组分和其对应的浓度如下 盐酸硫胺素 10. O mg/L ； 烟酸1. 0 mg/L ；盐酸吡哆醇 1. Omg/L ； 肌醇100. O mg/L。
全文摘要
一种红叶石楠离体叶片体细胞胚诱导快繁培养基包括芽启动培养基、试管苗增殖培养基、第一诱导体胚和/或不定芽形成培养基、第二诱导体胚和/或不定芽形成培养基、第三诱导体胚和/或不定芽形成培养基、第一体胚和/或不定芽生长与分化培养基、第二体胚和/或不定芽生长与分化培养基和壮苗生根培养基。本发明所述的红叶石楠离体叶片体细胞胚诱导快繁培养基通过改良基本培养基及成分、调整培养条件，使繁殖困难的红叶石楠通过体细胞胚发生途径快繁，植株移栽成活率达到95%以上，种苗生长健壮，可有效解决优良种苗种质退化问题，也可为生产上提供大量优质提纯复壮的脱毒苗木，还可为红叶石楠遗传转化或诱变育种选育新品种提供一个理想的受体体系。
文档编号A01H4/00GK102124954SQ201110033598
公开日2011年7月20日 申请日期2011年1月31日 优先权日2011年1月31日
发明者刘翠兰, 夏阳, 方敏彦, 朱晓花, 梁慧敏, 燕丽萍, 董慧, 颜志明 申请人:山东省林业科学研究院, 江苏农林职业技术学院