专利名称：一种百合杂种胚的离体培养方法
技术领域：
本发明涉及一种百合杂种胚的离体培养方法，特别涉及一种特定胚龄的百合杂种 胚的剥离、离体培养、增殖培养及生根培养的方法。
背景技术：
受精的杂种果实不能正常发育，而逐渐皱瘪，逐渐枯黄。原因是由于胚和胚乳不亲 和，胚乳败育而导致胚败育.必须在果实枯黄前进行离体培养，即在杂种胚乳完全败育的 情况下，通过人工配制的培养基提供杂种幼胚的营养，使之继续生长发育直至成苗。子房切 片培养、胚珠和杂交胚培养以及胚乳看护培养是目前克服受精后障碍的有效方法，其中以 胚培养应用最多。Asano 等(Asano. Y. Studies on Crosses between Distantly RelatedSpecies of Lilies New Hybrids Obtained through Embryo Culture. J. Japan Soc Rory Sci,1978, 47(3) :401-414.)从败育的胚乳中摘取0. 8 1. 9mm大小的百合种间杂种胚培养成苗，胚 龄为40 70d。黄济明等(黄济明.百合远缘杂种“麝兰”的育成[J].上海农业学报， 1985，1(1) :84-87.)在麝香百合X兰州百合的杂交试验中，第^d胚败育，果枯黄，从中剥 出0.2 0.4mm长的幼胚离体培养成功，而在王百合X大卫百合的杂交中(黄济明.王百 合和大卫百合种间远缘杂种的育成[J].园艺学报，1982，9[8]51-55)，果实在授粉后60 80d枯黄，从中剥出的杂种胚长0. 6mm经过培养多数胚虽死亡，但通过小鳞茎状突起和松散 的愈伤组织的形成，可进一步促使其分化成苗。Asano (Asano Y. Studies on the Crosses between distantly relatedspecies of lilies \ The Culture of Immature Hybrid Embryos 013-114mmlong. J. Japan Soc Hort Sci, 1980,49(3) :11-18.)得出结论，含蔗糖2% 4%的培养基适合培养百合的不成 熟幼胚。Okazaki认为培养基中生长素和细胞分裂素应合理配合使用，高浓度的生长素、细 胞分裂素会导致畸形胚(Okazaki K, Asano Y, OosawaK. Interspecific hybrids between Lilium 'Oriental' hybrid and L. Asiatichybrid produced by embryo culture with revised media. BreedSci，1994，44 (1) :59-64)。浅野认为在 MS 培养基中加入 l(T4-l(T2mg/ LNAA对不成熟胚直接发芽有效，加入6-BA在某种程度上诱导产生愈伤组织。郭方其等(郭 方其，孙崇波，郁永明，向林，黎侠，丁晓瑜.影响百合试管鳞茎内膨大和生长的因素.中国 球根花卉年会交流论文集.2009 :41-46)认为在培养基上添加多效唑(PP333)对鳞茎的膨大 有明显的促进作用。高浓度的NAA促进根的生长而抑制正常的茎生长。最适合的pH值为 5.8。孙晓梅等(孙晓梅，崔文山，王亚斌，年玉欣，罗凤霞.百合杂交种培育研究.辽宁林 业科技.2005 (5) :16-17)认为在高无机盐浓度并附加高浓度6-BA和低浓度NAA的MS培养 基上适合百合杂交苗的继代培养。在百合杂种胚的离体培养中，胚的适时剥离能有效地提高杂种胚的萌发率，促进 杂种胚的提早萌发。但到目前为止，对百合最佳的取胚时间还没有研究的非常明确。因此适宜胚龄的选择是杂种胚离体培养成功的第一步。很多时候幼胚的成活率低是因为剥胚时 破坏了胚的结构，使幼胚的完整性遭到破坏，因此剥胚技术是提高幼胚成活率的关键。很多 报道中虽然有幼胚成活的实例，但是往往鳞茎较小且膨大缓慢，根系容易呈现灰色或褐化 腐烂，将幼苗移栽之后成活率很低，因此增加杂交苗的生根数目，使根系更粗壮，鳞茎更健 壮是幼苗移栽成功的前提。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种百合杂种胚离体培养方法。本发明提供的百合杂种胚离体培养方法，其步骤包括从受精膨大的子房中剥取杂 种胚进行离体萌发，将萌发的杂种苗进行小鳞茎的增殖。根据本发明，百合杂种胚离体培养方法还可包括诱导增殖后的百合小鳞茎膨大。根据本发明，百合杂种胚离体培养方法还可包括将膨大的百合小鳞茎诱导生根。其中，所述的杂种胚的胚龄为授粉后60 70d。其中，所述的用于杂种胚离体萌发的培养基为MS+NAA0. 01 0. lmg/L+蔗糖3% + 琼脂 0. 6%，pH 5. 8，优选为 MS+NAAO. 01mg/L+蔗糖 3% + 琼脂 0. 6%，pH 5.8。其中，所述的用于杂种苗小鳞茎增殖的培养基为MS+NAA0. 05 0. 5mg/ L+6-BA2. Omg/L+蔗糖 3% + 琼脂 0. 6%,pH 5. 8，优选为 MS+NAAO. lmg/L+6_BA2. Omg/L，蔗糖 3%，琼脂0.6%，pH 5.8。其中，所述的用于诱导小鳞茎膨大的培养基为MS+PP3334 6mg/ L+ 活性炭 0. 3g/L+ 蔗糖 9% + 琼脂 0.6%, pH 5. 8，优选为 MS+PP3335mg/L+ 活性炭 0. 3g/L+ 蔗糖 9% + 琼脂 0. 6%，pH = 5.8。其中，所述的用于诱导膨大后的小鳞茎生根的培养基为MS+NAA0. 5 1. 5mg/L+ 活性炭1.(^/1+蔗糖3(%+琼脂0.6(%，？!1 5.8，优选为1^+織41.011^/1+活性炭1.0g/L+蔗 糖 3% + 琼脂 0. 6%，pH 5.8。根据本发明，所述的从未成熟的子房中剥取杂种胚的步骤为1)将子房用流水冲洗30min以上，然后在无菌的条件下用75%酒精浸泡20 30s，无菌水冲洗3 5次，再用0. 1 %的升汞溶液浸泡10 20min，无菌水冲洗3 5次；2)无菌条件下在铺有滤纸的盘子上用手术刀将子房沿着心皮线切开，选取其中 有胚的种子；用手术刀将种皮轻轻划开一个小口，然后用解剖针挑出种胚，并保持胚的完整 性。本发明的有益效果(1)本发明所述杂种胚最佳培养时间胚龄为60 70d，此时胚已接近成熟，胚乳呈 淀粉糊状，不仅萌发率高，也易剥离，一个星期左右就可以萌发。(2)本发明采用的剥胚及杂种胚离体培养的方法，可促成幼胚直接成苗，能够保证 幼胚的污染率为0，成活率达到100%。(3)本发明所采用的最适的小鳞茎增殖培养基，即MS+NAAO. lmg/L+6_BA2. Omg/L, 蔗糖3%，琼脂0.6%，pH= 5. 8，可使幼苗增殖的鳞茎数目较多，能在短时间内获得大量杂 种苗，大大节约成本。(4)本发明所采用最适的小鳞茎膨大培养基，即培养基的配方为MS+PP3335mg/L+ 活性炭0. 3g/L+蔗糖9% +琼脂0. 6%，pH 5. 8，有利于百合鳞茎的膨大，可使鳞茎在短暂的
4六个月培养时间内达到质量2. Og/粒，从而增加了移栽后成活率。(5)本发明采用的最适的生根培养基，即培养基的配方为MS+NAA1. Omg/L+活性炭 1.0g/L+蔗糖3%+琼脂0.6%，pH 5. 8，有利于幼苗生根且生根数目多，根多呈现白色，平 均生根数目在5条以上，从而增加了杂种百合鳞茎的成活率。
图1所示为子房灭菌后沿心皮切开的子房和杂种胚。图2所示为胚龄为60d的杂种胚接种7天后的萌发情况。图3所示为杂种胚在MS+0. Olmg/LNAA培养基上的离体培养情况。图4所示为继代培养中杂种幼苗的鳞茎增殖情况。图5所示为小鳞茎经诱导后鳞茎膨大情况。图6所示为膨大后的鳞茎的生根情况。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例11)摘取授粉60d后膨大的‘西伯利亚’ X ‘生日快乐’的杂交得到子房，用流水冲 洗40min左右，然后在无菌的条件下用75 %酒精浸泡30s，无菌水冲洗3次，再用0. 1 %的升 汞溶液浸泡15min，无菌水冲洗3次，每次5min ； (2)无菌条件下在铺有滤纸的盘子上用手 术刀将子房沿着心皮线切开(图1)，选取其中有胚的种子；(3)用手术刀将种皮轻轻划开一 个小口，然后用解剖针挑出种胚，注意保持胚的完整性。2)将剥离的杂种胚接种到最适离体萌发培养基上，其具体步骤为(1)配制培养 基。离体萌发培养基的配方为MS+NAA 0. 01mg/L+蔗糖3% +琼脂0. 6%，pH= 5. 8，用150ml 锥形瓶盛装，每个锥形瓶中培养基的体积大约为30ml ;(幻在无菌条件下用镊子将剥离的 杂种胚水平接种到培养基上，每个锥形瓶中接种3 4个杂种胚，置于22°C，光照条件下培 养，光照强度1500Lx，光照时间12h ^cT1tj培养期间每隔2个月更换一次培养基。7天后， 杂种胚开始萌发(图2)。1个月后，杂种幼苗长至2. Ocm左右(图3)。结果表明，‘西伯利亚，X ‘生日快乐，的幼胚污染率为0，成活率达到100%。实施例21)摘取授粉70d后膨大的‘柏尼尼’ X ‘莱奥多’和‘莱奥多’ X ‘西伯利亚’的 杂交得到的子房，用流水冲洗50min左右，然后在无菌的条件下用75%酒精浸泡20s，无菌 水冲洗5次，再用0. 1 %的升汞溶液浸泡lOmin，无菌水冲洗5次，每次5min ； (2)无菌条件 下在铺有滤纸的盘子上用手术刀将子房沿着心皮线切开，选取其中有胚的种子；(3)用手 术刀将种皮轻轻划开一个小口，然后用解剖针挑出种胚，注意保持胚的完整性。2)将剥离的杂种胚接种到最适离体萌发培养基上，其具体步骤为(1)配制培养 基。离体萌发培养基的配方为MS+NAA 0. lmg/L+蔗糖3% +琼脂0.6%，pH 5.8，用150ml 锥形瓶盛装，每个锥形瓶中培养基的体积大约为30ml ;(幻在无菌条件下用镊子将剥离的 杂种胚水平接种到培养基上，每个锥形瓶中接种3 4个杂种胚，置于22°C，光照条件下培 养，光照强度1500Lx，光照时间12h · cT1。培养期间每隔2个月更换一次培养基。
结果表明，‘柏尼尼’ X ‘莱奥多’和‘莱奥多’ X ‘西伯利亚’的幼胚污染率均为 0%，成活率均达到100%。实施例3将实施例2和实施例3离体培养4个月后获得杂种幼苗转接到增殖培养基上，其 具体步骤为(1)配制培养基。增殖培养基的配方为MS+NAAO. lmg/L+6-BA2. Omg/L,蔗糖 3%，琼脂0. 6%, pH 5. 8。用250ml兰花瓶盛装，每个兰花瓶中培养基的体积大约为60ml ； (2)在无菌条件下，将幼苗剪掉叶片后接种到增殖培养基上，每个兰花瓶中接种4 5个小 鳞茎，置于22°C，光照条件下培养，光照强度1500Lx，光照时间1 ΜΛ培养期间每隔3个 月更换一次培养基。结果表明，‘柏尼尼，X ‘莱奥多’、‘莱奥多，X ‘西伯利亚’和‘西伯利亚，X ‘生 日快乐’杂种幼苗的增殖率均在5倍以上(图4)。实施例4按照实施例3增殖培养6个月得到的百合小鳞茎转接到最适鳞茎膨大培养基上， 其具体步骤为(1)配制培养基。最适鳞茎膨大培养基配方为MS+PP3335mg/L+活性炭0. 3g/ L+蔗糖9% +琼脂0. 6%,pH = 5. 8,250ml兰花瓶盛装，每个兰花瓶中培养基的体积大约为 60ml ； (2)在无菌条件下，将杂种幼苗剪掉叶片及根系后接种到鳞茎膨大培养基上，每个兰 花瓶中接种4个小鳞茎，置于22°C，黑暗条件下培养。培养期间每隔3个月更换一次培养 基。结果表明，‘柏尼尼，X ‘莱奥多’、‘莱奥多，X ‘西伯利亚’和‘西伯利亚，X ‘生 日快乐’杂种幼苗的小鳞茎周径增大3 4倍，质量增加5 6倍(图5)。实施例5将实施例4膨大培养6个月左右得到的幼苗转接到最适生根培养基上，其具体步 骤为⑴配制培养基。生根培养基的配方为MS+NAA1. Omg/L+活性炭1. Og/L+蔗糖3% + 琼脂0. 6%，pH = 5. 8,250ml兰花瓶盛装，每个兰花瓶中培养基的体积大约为60ml ； (2)在 无菌条件下，将幼苗剪掉叶片后接种到生根培养基上，每个兰花瓶中接种3 4个鳞茎，置 于22°C，光照条件下培养，光照强度1500Lx，光照时间12h · d—1。培养期间每隔3个月更换 一次培养基。结果表明，‘柏尼尼，X ‘莱奥多’、‘莱奥多，X ‘西伯利亚’和‘西伯利亚，X ‘生 日快乐’杂种幼苗的小鳞茎生根率为100%，平均生根条数为5. 2条(图6)。注实施例中‘西伯利亚’、‘莱奥多’、‘柏尼尼’和‘生日快乐’四个品种均购自北
京润博球根花卉有限公司。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
1.一种百合杂种胚离体培养方法，其特征在于，其步骤包括从受精膨大的子房中剥取 杂种胚进行离体萌发，将萌发的杂种苗进行小鳞茎的增殖。
2.根据权利要求1所述的离体培养方法，其特征在于，还包括诱导增殖后的百合小鳞 茎膨大。
3.根据权利要求2所述的离体培养方法，其特征在于，还包括将膨大的百合小鳞茎诱 导生根。
4.根据权利要求1 3任一项所述的离体培养方法，其特征在于，所述的杂种胚的胚龄 为授粉后60 70d。
5.根据权利要求1 3任一项所述的离体培养方法，其特征在于，所述的用于杂种胚离 体萌发的培养基为MS+NAA 0. 05 0. 5mg/L+蔗糖3% +琼脂0. 6%，pH 5. 8。
6.根据权利要求1 3任一项所述的离体培养方法，其特征在于，所述的用于杂种苗小 鳞茎增殖的培养基为 MS+NAA0. 5 1. 5mg/L+6-BA2. Omg/L+ 蔗糖 3% + 琼脂 0.6%,pH 5. 8。
7.根据权利要求2或3所述的离体培养方法，其特征在于，所述的用于诱导小鳞茎膨大 的培养基为:MS+PP3334 6mg/L+活性炭0. 3g/L+蔗糖9% +琼脂0. 6%，pH 5. 8。
8.根据权利要求3所述的离体培养方法，其特征在于，所述的用于诱导膨大后的小鳞 茎生根的培养基为MS+NAA0. 5 1. Omg/L+活性炭1. Og/L+蔗糖3% +琼脂0. 6%，pH 5. 8。
9.根据权利要求1 3任一项所述的离体培养方法，其特征在于，所述的从未成熟的子 房中剥取杂种胚的步骤为1)将子房用流水冲洗30min以上，然后在无菌的条件下用75%酒精浸泡20 30s，无 菌水冲洗3 5次，再用0. 1 %的升汞溶液浸泡10 20min，无菌水冲洗3 5次；2)无菌条件下在铺有滤纸的盘子上用手术刀将子房沿着心皮线切开，选取其中有胚的 种子；用手术刀将种皮轻轻划开一个小口，然后用解剖针挑出种胚，并保持胚的完整性。
10.根据权利要求3所述的离体培养方法，其特征在于，所述的杂种胚的离体培养、小 鳞茎的增殖培养和膨大后的小鳞茎的生根培养为光照培养；所述的小鳞茎的膨大培养为黑 暗培养。
全文摘要
本发明提供了一种百合杂种胚的离体培养方法，其步骤包括从受精膨大的子房中剥取杂种胚进行离体萌发，将萌发的杂种苗进行小鳞茎的增殖，还可包括诱导增殖后的百合小鳞茎膨大并诱导生根。其中，所述的杂种胚的胚龄为授粉后60～70d。本发明提供的百合杂种胚的离体培养方法兼具幼胚污染率低、成活率高，幼苗增殖鳞茎数目多，鳞茎膨大速度快和幼苗生根数目多的特征，可用于百合杂种胚的高效离体培养。
文档编号A01H4/00GK102124956SQ20111003865
公开日2011年7月20日 申请日期2011年2月15日 优先权日2011年2月15日
发明者刘文娟, 吕英民, 吴沙沙, 吴锦娣, 张启翔, 焦雪辉, 程堂仁 申请人:北京林业大学