专利名称：一种软枣猕猴桃的工厂化育苗方法
技术领域：
本发明属于植物组织培养技术领域，特别是涉及一种软枣猕猴桃的工厂化育苗方法。
背景技术：
软枣猕猴桃具有水果Vc之王的美称，果实含可溶性固形物15%左右，总糖8. 8%, 有机酸1.5%，Vc 430mg/100g是苹果的100倍，氨基酸933. 9mg/100g，软枣猕猴桃汁具有阻断致癌性亚硝基化合物合成的作用，还含有硫醇蛋白酶的水解酶和超氧化物歧化酶 (S0D)，具有养颜、提高免疫功能、抗癌、抗衰老、软化血管、抗肿消炎的功能，营养与保健价值极高。近年来，软枣猕猴桃受到广大研究者和生产者的极大关注，但由于软枣猕猴桃多数处于野生状态，在一些山区、野生资源保护区生长，人们常年砍伐式采摘，造成软枣猕猴桃资源破坏严重，生态环境也受到严重影响。另外，常规繁殖方法出苗慢，苗木成活率低，而且扦插、嫁接繁殖需要消耗大量的猕猴桃枝条，苗木带菌率高，播种繁殖育出的苗木性状不稳定，分离严重，使得市场上软枣猕猴桃苗木供应量不足，严重限制了其当前的发展。软枣猕猴桃的离体繁殖技术方面的研究历史不长，自1997年朱道圩报道“软枣猕猴桃叶片愈伤组织分化再生植株”开始，对于软枣猕猴桃的工厂化育苗技术也逐渐展开了研究，但是目前市场对于软枣猕猴桃苗木的需求量很大，只有通过组织培养快速繁殖技术才能满足市场苗木稀缺的难题，而且通过离体快速繁殖技术也能将大量的野生软枣猕猴桃资源进行保存和利用。2009年11月11日公告的CN101574056中国发明专利公开了一种软枣猕猴桃组织培养方法，该方法分为外植体灭菌、接种、继代增殖、生根四个阶段。但由于其采用了玉米素作为生长调节剂，价格昂贵且难于采购(市场价1900元/g)，给生产造成了很大的不便的同时还大大增加了成本。
发明内容
本发明主要针对软枣猕猴桃在东北地区均处于野生状态，通过传统的繁殖方式包括播种繁殖、扦插繁殖、嫁接繁殖，会出现资源破坏严重，繁苗速度慢、母株性状难以保持、 植株易带菌及苗木成活率低的问题，提出一种软枣猕猴桃的工厂化育苗方法，其目的在于可以缩短繁苗周期，降低育苗成本，提高苗木成活率，减少植株带菌，保持母株优良性状，解决品种退化的问题。为实现上述发明目的，本发明的技术方案是这样实现的，包括以下几个步骤 (一)培养基的配制
1)基本培养基采用常规MS培养基配方配制，用普通自来水替代配方中的蒸馏水，其中琼脂浓度为6. 0-8. Og/L，用白糖取代蔗糖，浓度为25-30 g/L，调整基本培养基的pH值为 5. 5-6. 0 ；
2)诱导培养基向基本培养基中加入6-BA(6-苄氨基嘌呤)使之浓度为0. 5-1. 5mg/L；
3)继代培养基向基本培养基中加入6-BA (6-苄氨基嘌呤)使之浓度为1. 5-3. 2mg/L 及IBA (吲哚丁酸)使之浓度为1. 0-1. 5mg/L ；
(二)培养条件培养室内温度控制在24-26°C，光照周期12小时/d，光照强度20001UX， 每周用紫外线进行室内消毒一次；
(三)外植体的选取与消毒
1)外植体的选取选取软枣猕猴桃的休眠枝条，经水培后长出7-lOcm的嫩芽作为外植
体；
2)外植体的消毒将长出的嫩芽用清水冲洗1-2小时，将嫩芽上的叶片去掉，在超净工作台上用70%酒精消毒30s，然后用无菌水冲洗3遍，用0. 1%升汞水溶液消毒2次，每次4 分钟，然后用无菌水冲洗3-5遍，取出用无菌滤纸吸干水分，备用；
(四)接种将消毒好的嫩芽切成含芽切段横放在基本培养基中，培养25-30天左右，诱导萌发出幼芽或丛芽；
(五)继代培养将诱导出的幼芽或丛芽移至继代培养基中，培养25-30天后，每个幼芽或丛芽分化出6-8个(增殖倍数6-8)长至4-6cm、已生根的丛生幼芽；
(六)沙床移栽将已生根的组培苗，在温室内开瓶炼苗2-3天，将基部的继代培养基去掉，移栽至沙床上，浇水，温室内保持50-90%的湿度至组培苗成苗，待40-50天后，组培苗已经长出很多的毛细根系，长7-lOcm左右，转移至营养钵中继续生长，等待出圃。本发明的有益效果是
1)本发明与CN101574056号专利方法相比，已将软枣猕猴桃组培技术完全用于了生产，实现了软枣猕猴桃的工厂化育苗，从接种至组培苗驯化移栽已取得圆满成功，而且缩短了生产周期，省去了生根培养的步骤，大大节省了生产成本，从外植体接种至生根只需 50-60天即可移栽至温室，外植体诱导率达95%以上，继代增殖倍数较CN101574056号专利方法可增加1. 5倍以上，生根率可达100%，较CN101574056号专利方法高13个百分点，移栽成活率95%以上。2)本发明所利用的外植体既可以是休眠枝条水培后的嫩芽，也可以选取软枣猕猴桃成熟枝梢作为外植体，取材方便，全年可以生产。3)本发明操作技术容易掌握，程序简单，培养基配制材料成本低廉，大大降低生产成本，本发明中培养基制作使用的均为价格低廉、取材方便的材料。如用白糖代替培养基中的蔗糖，自来水代替蒸馏水，生长调节剂用6-苄氨基嘌呤(6-BA)代替玉米素(ZT)，可以极大降低生产成本，玉米素作为生长调节剂，价格昂贵且难于采购(市场价1900元/g)，6-苄氨基嘌呤(6-BA)不仅价格低廉(6元/g)，采购容易，而且由于其也属于细胞分裂素类物质， 不仅促进植物细胞分裂，还能促进植株生长，同时添加吲哚丁酸(IBA)可以促进植株生根， 减少诱导生根的过程，这样不仅缩短了育苗时间20-30天，也在一定程度上降低了生产成本。在继代培养基中使用6-苄氨基嘌呤(6-BA)代替玉米素(ZT)，大大提高了本发明的实用价值和生产价值，生产成本较CN101574056号专利方法可降低12. 68%左右。4 )移栽基质仅用河沙即可，也降低了基质的成本。5)本发明可以避免软枣猕猴桃野生资源被破坏，实现资源的保存和利用。
具体实施例方式通过以下实施例对本发明做进一步的详细说明。对比例
根据公告号为CN101574056的发明专利公开的方法进行组织培养，该方法分为四个步骤分别为外植体灭菌、接种、继代增殖和生根，其中接种天数为20天，继代增殖为 25-30天，增殖倍数为4倍，生根天数为30天，最终瓶内生根率可以达到87%，总培养天数为 75-80天。而且由于在继代增殖阶段采用了玉米素，浓度为lmg/L，使得培养成本大大增加。实施例1
(一)培养基的配制
1)基本培养基采用常规MS培养基配方配制，用普通自来水替代配方中的蒸馏水，其中琼脂浓度为7. Og/L，用白糖取代蔗糖，浓度为^g/L，调整基本培养基的pH值为5. 8 ；
2)诱导培养基向基本培养基中加入6-BA(6-苄氨基嘌呤)使之浓度为1. Omg/ L ；
3)继代培养基向基本培养基中加入6-BA(6-苄氨基嘌呤)使之浓度为2. 5mg/L及 IBA (吲哚丁酸)使之浓度为1. 25mg/L ；
(二)培养条件培养室内温度控制在25°C，光照周期12小时/d，光照强度20001UX，每周用紫外线进行室内消毒一次；
(三)外植体的选取与消毒
1)外植体的选取选取软枣猕猴桃的休眠枝条，经水培后长出7-lOcm的嫩芽作为外植
体；
2)外植体的消毒将长出的嫩芽用清水冲洗1.5小时，在超净工作台上用70%酒精消毒30s，然后用无菌水冲洗3遍，用0. 1%升汞水溶液消毒2次，每次4分钟，然后用无菌水冲洗4遍，取出用无菌滤纸吸干水分，备用；
(四)接种将消毒好的嫩芽切成含芽切段横放在基本培养基中，培养25天左右，诱导萌发出幼芽或丛芽；
(五)继代培养将诱导出的幼芽移至继代培养基中，培养25天后，每个幼芽分化出8个 (增殖倍数为8)长至4-6cm、已生根的丛生幼芽；
(六)沙床移栽将已生根的组培苗，在温室内开瓶炼苗2天，将基部的继代培养基去掉， 移栽至沙床上，浇水，温室内保持50-90%的湿度至组培苗成苗，待45天后，组培苗已经长出很多的毛细根系，长7-lOcm左右，转移至营养钵中继续生长，等待出圃。实施例2
(一)培养基的配制
1)基本培养基采用常规MS培养基配方配制，用普通自来水替代配方中的蒸馏水，其中琼脂浓度为6. Og/L，用白糖取代蔗糖，浓度为30g/L，调整基本培养基的pH值为5. 5 ；
2)诱导培养基向基本培养基中加入6-BA(6-苄氨基嘌呤)使之浓度为0. 5mg/ L ；
3)继代培养基向基本培养基中加入6-BA(6-苄氨基嘌呤)使之浓度为1. 5mg/L及 IBA (吲哚丁酸)使之浓度为1. 5mg/L ；
(二)培养条件培养室内温度控制在M°C，光照周期12小时/d，光照强度20001UX，每周用紫外线进行室内消毒一次；
(三)外植体的选取与消毒1)外植体的选取选取软枣猕猴桃的休眠枝条，经水培后长出7-lOcm的嫩芽作为外植
体；
2)外植体的消毒将长出的嫩芽用清水冲洗2小时，将嫩芽上的叶片去掉，在超净工作台上用70%酒精消毒30s，然后用无菌水冲洗3遍，用0. 1%升汞水溶液消毒2次，每次4分钟，然后用无菌水冲洗3遍，取出用无菌滤纸吸干水分，备用；
(四)接种将消毒好的嫩芽切成含芽切段横放在基本培养基中，培养28天左右，诱导萌发出幼芽或丛芽；
(五)继代培养将诱导出的幼芽移至继代培养基中，培养27天后，每个幼芽分化出6个 (增殖倍数为6)长至4-6cm、已生根的丛生幼芽；
(六)沙床移栽将已生根的组培苗，在温室内开瓶炼苗3天，将基部的培养基去掉，移栽至沙床上，浇水，保持适当的湿度至组培苗成苗，待45天后，组培苗已经长出很多的毛细根系，长7-lOcm左右，转移至营养钵中继续生长，等待出圃。实施例3
(一)培养基的配制
1)基本培养基采用常规MS培养基配方配制，用普通自来水替代配方中的蒸馏水，其中琼脂浓度为8. Og/L，用白糖取代蔗糖，浓度为25g/L，调整基本培养基的pH值为6. 0 ；
2)诱导培养基向基本培养基中加入6-BA(6-苄氨基嘌呤)使之浓度为1. 5mg/ L ；
3)继代培养基向基本培养基中加入6-BA(6-苄氨基嘌呤)使之浓度为3. 2mg/L及 IBA (吲哚丁酸)使之浓度为1. Omg/L ；
(二)培养条件培养室内温度控制在26°C，光照周期12小时/d，光照强度20001UX，每周用紫外线进行室内消毒一次；
(三)外植体的选取与消毒
1)外植体的选取选取软枣猕猴桃的休眠枝条，经水培后长出7-lOcm的嫩芽作为外植
体；
2)外植体的消毒将长出的嫩芽用清水冲洗2小时，在超净工作台上用70%酒精消毒 30s，然后用无菌水冲洗3遍，用0. 1%升汞水溶液消毒2次，每次4分钟，然后用无菌水冲洗 5遍，取出用无菌滤纸吸干水分，备用；
(四)接种将消毒好的嫩芽切成含芽切段横放在基本培养基中培养30天左右，诱导萌发出丛芽；
(五)继代培养将诱导出的丛芽移至继代培养基中，培养30天后，每个幼芽或丛芽分化出7个(增殖倍数7)长至4-6cm、已生根的丛生幼芽；
(六)沙床移栽将已生根的组培苗，在温室内开瓶炼苗2-3天，将基部的继代培养基去掉，移栽至沙床上，浇水，温室内保持50-90%的湿度至组培苗成苗，待40-50天后，组培苗已经长出很多的毛细根系，长7-lOcm左右，转移至营养钵中继续生长，等待出圃。与对比例相比，配制的继代培养基中由于用6-BA (6-苄氨基嘌呤)替代了 ZT (玉米素)，使得每株组培苗的生产成本降低了 0. 395元。从接种成活至继代生根需60天，比对比例缩短了 15-20天，诱导成活率94%以上，增殖倍数为7倍，瓶内生根率96%，沙床移栽生根率92%以上，明显高于对比例。应用本专利技术与对比例技术生产组培苗成本比较见表1。
表1应用本专利技术与对比例技术生产组培苗成本比较 (按年产100万株组培苗的生产规模估算)
权利要求
1. 一种软枣猕猴桃的工厂化育苗方法，其特征为 包括以下几个步骤(一)培养基的配制1)基本培养基采用常规MS培养基配方配制，用普通自来水替代配方中的蒸馏水，其中琼脂浓度为6. 0-8. Og/L，用白糖取代蔗糖，浓度为25-30 g/L，调整基本培养基的pH值为 5. 5-6. 0 ；2)诱导培养基向基本培养基中加入6-BA即6-苄氨基嘌呤，使之浓度为0.5-1. 5mg/L；3)继代培养基向基本培养基中加入6-BA即6-苄氨基嘌呤，使之浓度为1.5-3. 2mg/ L及IBA即吲哚丁酸，使之浓度为1. 0-1. 5mg/L ；(二)培养条件培养室内温度控制在24-26°C，光照周期12小时/d，光照强度20001UX， 每周用紫外线进行室内消毒一次；(三)外植体的选取与消毒1)外植体的选取选取软枣猕猴桃的休眠枝条，经水培后长出7-lOcm的嫩芽作为外植体；2)外植体的消毒将长出的嫩芽用清水冲洗1-2小时，将嫩芽上的叶片去掉，在超净工作台上用70%酒精消毒30s，然后用无菌水冲洗3遍，用0. 1%升汞水溶液消毒2次，每次4 分钟，然后用无菌水冲洗3-5遍，取出用无菌滤纸吸干水分，备用；(四)接种将消毒好的嫩芽切成含芽切段横放在基本培养基中，培养25-30天左右，诱导萌发出幼芽或丛芽；(五)继代培养将诱导出的幼芽或丛芽移至继代培养基中，培养25-30天后，每个幼芽或丛芽分化出6-8个即增殖倍数为6-8，长至4-6cm、已生根的丛生幼芽；(六)沙床移栽将已生根的组培苗，在温室内开瓶炼苗2-3天，将基部的继代培养基去掉，移栽至沙床上，浇水，温室内保持50-90%的湿度至组培苗成苗，待40-50天后，组培苗已经长出很多的毛细根系，长7-lOcm左右，转移至营养钵中继续生长，等待出圃。
全文摘要
本发明属于植物组织培养技术领域，特别是涉及一种软枣猕猴桃的工厂化育苗方法。其主要技术特征为包括培养基的配制、外植体的选取与消毒、接种、继代培养、沙床移栽五个步骤。主要针对软枣猕猴桃在东北地区均处于野生状态，通过传统的繁殖方式包括播种繁殖、扦插繁殖、嫁接繁殖，会出现后代性状分离严重、雌雄株难以区分，资源破坏严重，繁苗速度慢、母株性状难以保持、植株易带菌及苗木成活率低等问题，提出一种软枣猕猴桃的工厂化育苗技术，将诱导出的幼芽经继代培养后直接进行沙床移栽，省略了生根培养过程，可以缩短繁苗周期至50-60天，使育苗成本大大降低，苗木成活率明显提高，减少植株带菌，保持母株优良性状，解决品种退化的问题。
文档编号A01H4/00GK102177847SQ201110053609
公开日2011年9月14日 申请日期2011年3月7日 优先权日2011年3月7日
发明者刘长江, 孙晓荣, 梁爽, 谭昌华 申请人:沈阳农业大学