专利名称：源于桉树的增加植物生物量的基因、重组表达载体和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物基因及编码蛋白与应用领域，特别是涉及源于桉树的WPGS3基因和WPGS4基因及其编码蛋白与其在提高植物生物量的应用。
背景技术：
桉树是桃金娘科(Myrtaceae)桉树属(Eucalyptus)的总称,是一种集观赏、用材、纸浆原料、药用于一体的优良树种。由于林木生长周期长，遗传杂和性高，许多性状属于多基因控制的数量性状，常规的育种手段难以满足定向培育桉树新品种的要求，因此人们将研究重点及成功希望寄托于基因工程技术来解决桉树常规育种难以解决的问题，加速优质、闻广按树新品种的选育进程。林木等木本植物基因资源丰富，但许多天然优良基因尚未被分离利用，大部分基因的功能仍处于未知的状态。因此，研究桉树中能增加生物量的基因可为进一步进行基因工程改造、获得高产量的优良树种奠定基础，具有重要意义。目前对林木基因的分离及功能鉴定主要通过与模式植物拟南芥或烟草等的同源基因进行相似性比较，建立进化树，运用反向遗传学方法，通过调控基因表达如过表达或基因沉默等技术研究基因的功能。苏晓华等(2009)从美洲黑杨中分离得到MADS-box基因PdPl,并在烟草中过表达，导致其提前开花。李海霞等(2009)将毛白杨的PtDRGOl基因导入烟草，转基因植株的烟草花叶病毒苏亮显著少于对照，表明该基因具有抗病毒功能。Sonoda等将赤桉HD-Zip class II转录因子EcHBl基因转入烟草，转基因植株纤维长度和干重增力口，叶片、根和茎的生长量均高于对照。GRF1，全称为生长调节因子1，是GRF家族中的一员。目前已经在拟南芥、大麦、小麦以及水稻等植物中鉴定分离到该基因并证实其调节植物生长的功能。水稻中的OsGRFl具有调节茎伸长的功能，而在拟南芥中过表达AtGRFl及AtGRF2会导致叶片及子叶增大。然而目前为止对林木中GRF基因的分离和鉴定还是空白。EBPl，全称为ErhB3-结合蛋白，经证明是一种和人类基因EBPl同源的植物生长调控基因。Beatrics等首次在番茄和拟南芥中发现该基因并证实该基因在器官发育早期能促进细胞增殖，改变细胞分裂的临界大小并且缩短有丝分裂的时间，在有丝分裂后期促进细胞的扩张。拟南芥EBPl的过表达会使叶片显著增大。然而对林木EBPl基因的研究和应用还有待进行。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，从桉树中克隆出两个和增加植物生物量有关的基、因WPGS3与WPGS4，并转入拟南芥验证其功能，从而为该基因进一步应用于林木的基因改造
奠定基础。本发明另一个所要解决的技术问题是，提供上述基因的重组表达载体。本发明又一个所要解决的技术问题是，提供应用上述基因的增加生物量的方法。本发明通过对桉树的RNA进行深度测序得到桉树全长cDNA文库，然后NCBIgenebank中查找到AtGRFl和AtEBPl编码蛋白的氨基酸序列，并和桉树的全长cDNA文库进行序列相似性比对(tBLASTn)，得到桉树中的GRFl和EBPl的cDNA序列(SEQ ID NO: 3, SEQID NO: 4)，并命名为 WPGS3 (WPGS 是 Ioody Plant Growth Stimulator 的首字母缩写)和WPGS4。其中WPGS3基因长度为783bp，其编码的蛋白序列为SEQ ID NO: 1，含有260个氨基酸，和AtGRFl蛋白的序列相似度达到94%，而WPGS4基因长度为987bp，编码328个氨基酸，序列为SEQ ID NO: 2，和拟南芥EBPl蛋白的序列相似度为84%。本发明提供源于桉树的增加植物生物量的基因，包括WPGS3基因与WPGS4基因，所述WPGS3基因的cDNAs是下述核苷酸序列之一
1)序列表中SEQID NO: 3的DNA序列；
2)编码序列表中SEQID NO: I的氨基酸酸序列；
而所述WPGS4基因的cDNA是下述核苷酸序列之一
1)序列表中SEQID N0:4的DNA序列；
2)编码序列表中SEQID NO:2的氨基酸酸序列。 本发明还提供一种重组表达载体，用于表达WPGS3基因或WPGS4基因，该重组表达载体至少包括上述的基因。进一步地,该重组表达载体为pEUV (Eucalyptus Vector)。本发明还提供一种提高植物生物量的方法，将上述的增加植物生物量的基因导入植物组织，细胞或器官，促使植物生物量获得提高。进一步地，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。本发明的目的是提供一种提高植物生物量的方法。本发明所提供的提高植物生物量的方法，是将桉树的WPGS3基因和WPGS4基因用已知方法进行分离，修饰和设计所得。分离出来的WPGS3基因和WPGS4基因在分离后插入pEUV载体，利用二元载体，经农杆菌侵染加插于拟南芥的种子中，利用椰菜花叶病毒35S启动子，令其过量表达，从而使植物生物量增加的表现型。利用35S启动子令载体上的基因过表达，使植物的生物量比野生种的植物在相同种植环境下得到提升。详细步骤参考具体实施方式
。本发明具有如下有益效果本发明提供了一个来源于桉树的WPGS3基因及其编码蛋白。转基因实验证明，WPGS3基因的过表达株系能够增加生长因子的转录，增加叶片与子叶的大小。其母叶与子叶的大小显着高于野生型，因此在同样的生长环境及生长时间下，WPGS3基因的过表达株系能产生更高生物量，提高植物生物量产量。本发明亦提供了一个来源于桉树的WPGS4基因。其编码蛋白ErbB3_结合蛋白I、是一种植物生长调控基因，无论功能上或结构上都跟人类WPGS4同源。在器官成长的早期过程中，WPGS4能促进细胞扩增，影响细胞分裂时的细胞大小及缩短组织分化时间。转基因实验证明，WPGS4的过表达植物比其野生型植物的叶盘直径显著增加，令其在相同的生长环境及生长时间下，比野生型植物有更高的生物量产量。
图IA是pEUV-WPGS3的载体资料示意图，35S代表椰菜花叶病毒35S启动子，D35S代表出去TATA序列椰菜花叶病毒35S启动子。
图IB是pEUV-WPGS4的载体资料示意图，35S代表椰菜花叶病毒35S启动子，D35S代表出去TATA序列椰菜花叶病毒35S启动子。 图2A是WPGS3过表达突变株DNA鉴定。图2B是WPGS4过表达突变株DNA鉴定。图3A是WPGS3过表达系的T2代和野生型植株的照片，可见转基因植物的叶片明
显增大。图3B是WPGS3过表达系的T2代和野生种在播种后17天，20天，27天叶盘直径的比较曲线图，样本数量>10, t test中，P〈0. 01。图4A是WPGS3过表达系的T2代和参照Col O (Columbia O)在播种后34天的照片，可见转基因植物的高度明显高于野生型植物。图4B是WPGS3过表达系的T2代和参照Col O (Columbia O)在播种后34天的高度比较图，样本数量>10，在t test中，P值〈O. 01。图5A是在拟南芥中，WPGS4过表达系T2代和野生种在播种后41天的照片，可见转基因植物的叶片明显增大。图5B是WPGS4过表达系(左)和野生种在播种后41天的叶片直径比较图，误差线代表标准方差。在t test中，P值〈O. 01。
具体实施例方式下面通过具体实施例并参照附图对本发明进行更详细的说明。应该理解的是，以下所述的实施例仅是用于说明而不是限制本发明。一、桉树的cDNA的制备
以Guo at al. 2008所采用的方法选取新鲜的桉树(Eucalyptus urophylla xgrandis cv DH32-29)叶片和花瓣，放入液氮中冰冻，然后放入_80°C冰箱中保存备用。使用十六烧基三甲基溴化胺(Cetyltrimethyl Ammonium Bromide, CTAB)法提取组织总RNA，具体实施1)65°C水浴中预热15 ml CTAB提取液；2)液氮中研磨2_3克桉树冷冻组织；3)转移样品至有CTAB提取液的离心管中，立即在室温下以10(Γ300转/分钟的转速激烈涡旋30s，然后65°C水浴4-5分钟；4)加入等体积的氯仿/异戊醇，涡旋混合，10000转/分钟常温离心15分钟；5)将上清转移至一新的离心管中，重复抽提一次；6)将上清转移至一新的离心管中，加入1/3体积的氯化锂，至终浓度为2 M，4°C沉淀过夜；7)4°C全速离心(转速为1000(Tl5000转/分钟，下同)1小时，弃上清，用500 μ I 70%乙醇洗沉淀，然后用500 μ I 100%乙醇洗沉淀；8)用500 μ I SSTE溶解沉淀，转移至I. 5 ml离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇抽提一次；9)加入2倍体积的无水乙醇，在_70°C沉淀30分钟或_20°C沉淀2小时；10) 4°C全速离心20分钟，沉淀RNA ;11)先用400 μ I 70%乙醇洗沉淀，然后用400 μ I 100%乙醇洗沉淀，吹干后用100 μ I的二乙基焦碳酸酯处理的水溶解RNA ；12)用DNA酶处理提取的RNA，_20°C保存备用。将约5 μ g桉树叶片组织的总RNA,采用Invitrogen公司的反转录试剂盒(Superscript III First Strand)合成 cDNA。二、WPGS3和WPGS4基因的克隆
将桉树(品名DH32-29) cDNA送至公司(天津生物芯片技术有限公司)进行深度测序、(deep sequencing)以获得cDNA全长序列。通过NCBI Genebank查找得到拟南芥GRFl和EBPl基因编码的蛋白氨基酸序列，与桉树全长cDNA序列进行相似性比对，得到桉树中相似性最高的全长cDNA序列并分别命名为WPGS3和WPGS4，其中WPGS3和AtGRFl完全相同的氨基酸序列占到90%，相似度为94%，而WPGS4和AtEBPl的完全相同的氨基酸序列占到全长的79%，序列相似度84%ο由此得到WPGS3 全长 cDNA 序列(SEQ ID No 3)和 WPGS4 全长 cDNA 序列(SEQ IDNo :4)，据此设计克隆桉树WPGS3和WPGS4的引物
WPGS3-F: AGAAGTAATGACGCGTGCCGCCGCCGCACCGWPGS3-R: GATGGGGCCCACGCGTGGCCTTGGCTGTTTCTTTGWPGS4-F: AGAAGTAATGACGCGTTCGGACGACGAGAGAGAGWPGS4-R: GATGGGGCCCACGCGTTCTGACCCATTTGGCATTAA
以现有的 Kary Mulis 研发的 Polymerase Chain Reaction (PCR)的方法,进行 WPGS3基因扩增，其扩增体系如下10 X pfx缓冲液5μ 1，硫酸镁(50 mM) 2μ 1，dNTPs (10 mM)
Iμ 1，引物 GRFl-F (10 μ Μ) I μ 1，引物 GRFl-R (10 μ Μ) I μ 1，桉树。0嫩模板2“ I,pfx 高保真酶O. 4 μ I (购自Takara公司)，水38 μ 1，总体积50 μ I。PCR扩增程序为先94°C预变性5分钟；然后94°C 40秒，53 0C 40秒，68°C 40秒，共40个循环，最后68°C延伸5分钟。其PCR产物参照QIAGEN公司的QIAquick胶纯情化试剂盒进行胶纯化。以现有的Polymerase Chain Reaction(PCR)的方法，进行WPGS4基因扩增，其扩增体系如下10 X Pfx 缓冲液 5 μ 1，硫酸镁(50 mM) 2 μ 1，dNTPs (10 mM)l μ 1，引物 EBP1-F(10 μ Μ) I μ 1，引物 EBPl-R (10 μ Μ) 1μ 1，桉树 cDNA 模板 2μ 1，pfx 高保真酶 0·4μ I (购自Takara公司)，水38 μ 1，总体积50 μ I。PCR扩增程序为先94°C预变性5分钟；然后94 V 40秒，53 V 40秒，68 V 40秒，共40个循环，最后68 °C延伸5分钟。其PCR产物参照QIAGEN公司的QIAquick胶纯化试剂盒进行胶纯化。三、WPGS3和WPGS4转基因拟南芥的获得及其性状的观察
根据New England Biolab的说明书将pEUV载体用MluI限制性内切酶在37°C酶切4小时使其变成线性，将胶纯化后的目的基因PCR产物与线性的pEUV载体混合后利用Invitrogen公司的In-fusion试剂盒,将目的基因链接到pEUV表达载体转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株GV3101用扩增基因的引物进行菌落PCR鉴定,对阳性克隆进行大量培养，通过蘸花浸染法转化拟南芥，当代收获为TO代转基因种子。将TO代转基因种子在含有50mg/L潮霉素(hygromycin)的MS培养基上进行筛选,得到转基因阳性植株Tl代。Tl代植株成熟后得到T2代种子。最后将T2代种子播种在含有25mg/L潮霉素的MS培养基上进行筛选，只有转入pEUV载体的种子才能在含有25mg/L潮霉素的MS培养基上发芽，发芽6天后转入泥土定植，定期对成活植株的生长状况进行各项生长指标的测量(株高，叶盘直径，叶盘叶片数等)，并与在相同条件下生长的野生型拟南芥的生长指标(株高，叶盘直径，叶盘叶片数等)进行比较。比较试验结果可见图3至图5。如图3A及图3B所示，WPGS3过表达植株的叶盘直径于播种27天后比野生型高出20%。如图4A及图4B所示，WPGS3过表达植株的植株高度在播种后34天比野生型高出20%。如图5A及图5B所示，WPGS 4过表达植株的叶盘直径于播种41天后比野生型高出40%。权利要求
1.源于桉树的增加植物生物量的基因，其特征在于，包括WPGS3基因与WPGS4基因，所述WPGS3基因的cDNAs是下述核苷酸序列之一 1)序列表中SEQID NO: 3的DNA序列； 2)编码序列表中SEQID NO: I的氨基酸酸序列； 而所述WPGS4基因的cDNAs是下述核苷酸序列之一 3)序列表中SEQID N0:4的DNA序列； 4)编码序列表中SEQID NO:2的氨基酸酸序列。
2.—种重组表达载体，用于表达WPGS3基因或WPGS4基因，其特征在于，该重组表达载体至少包括权利要求I所述的基因。
3.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，该重组表达载体为pEUV。
4.一种提高植物生物量的方法，其特征在于，将权利要求I所述的增加植物生物量的基因导入植物组织，细胞或器官，促使植物生物量获得提高。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
全文摘要
本发明涉及两个和增加植物生物量有关的桉树基因WPGS3和WPGS4的序列与功能，属于生物技术领域。首先提取桉树中RNA，将其反转录成cDNA，再进行深度测序得到桉树全长cDNA序列文库。将桉树cDNA文库的序列与NCBI公布的拟南芥AtGRF1和AtEBP1蛋白的氨基酸序列进行相似性比较，得到桉树中WPGS3和WPGS4全长cDNA序列。再将它们导入拟南芥中使其过表达。结果转基因植株显著地提高了生物量，此结果首次通过植物分子生物的方法确定了这两个木本植物基因在双子叶植物生长中的功能。
文档编号A01H5/00GK102676537SQ201110063720
公开日2012年9月19日 申请日期2011年3月16日 优先权日2011年3月16日
发明者张俊, 潘昇 申请人:嘉汉林业(广州)有限公司