专利名称：一种松树内生细菌新洋葱伯克霍尔德菌nsm-05及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物的内生细菌，具体涉及一种松树内生细菌新洋葱伯克霍尔德菌 NSM-05及其应用。
背景技术：
松树枯梢病(Sphaeropsis sapinea)是世界范围内针叶树上最常见和分布最广的重要病害之一。在全世界该病分布的近30个国家中，受害最严重的国家有新西兰、澳大利亚、南非、荷兰、美国和中国。它的寄主范围非常广，可侵染松属(Pinus L.)、冷杉属 (Abies Mill)、落叶松属(Larix Mill)、崖柏属(Thuja L.)、雪松属(Cedrus Trew)、刺柏属(Juniperus L·)、云杉属(Picea Dietr.)和黄杉属(Pseudotsuga Carr)等 8 个属的 60 多种针叶树。松树枯梢病病原菌的寄主范围虽然广，但不同寄主的感病程度却不同，目前已知造成经济损失的仅有湿地松、火炬松、马尾松和樟子松。自1980年以来，该病已在我国中南、西南、华南、华东、西北等10多个省份的国外松林中发生，所引起的直接损失主要由于主梢枯死造成松树高生长受阻，侧梢丛生而使材积增量锐减，严重时甚至使整株松树枯死； 其间接损失主要与木材蓝变等所造成的木材降级有关，从而使木材的商品价值大为降低。植物内生细菌是指存在植物体内对植物未见危害的一类细菌，能够定殖在植物细胞间隙或细胞内，并与寄主植物建立和谐联合关系。由于内生细菌能够系统的分布于植物体内，有充足的氮源和碳源，具有良好的生存环境，克服以往从PGPR(plant growth promoting rhizobacteria，根围促生细菌)中筛选生防菌的缺点(定殖差，受环境影响大)，所以更能发挥其生防效果，具有广阔的应用前景。而目前没有发现利用松树内生细菌防治松枯梢病的相关报道。新洋葱伯克霍尔德菌目前在分类地位上隶属于洋葱伯克霍尔德氏菌。洋葱伯克氏菌(BurWiolderia c印acia，简称Be)，是一种广泛存在于土壤、水、植物表面和医院的革兰氏阴性细菌，是一组基因型不同、表型相近的复合物(Burkholderia cepacia complex，简称Bcc)，现在被国际上划分为10个基因型，合称洋葱伯克氏菌群(Bcc)。许多的研究表明 Bc的一些基因型具有多种特有的功效，它可以分解土壤中残留的农药、净化污水；它可以防治植物病害，作为生防菌，Bc被制成生物杀虫剂和生物杀菌剂，能够替代部分常用化学农药，在农业生产和环境保护方面起到非常重要的作用；它还能促进植物的生长，在农业生产中作为生长激素和复合肥料。目前已有不少国家采用Bc为原料生产生物农药，但是以Bc 防治松枯梢病还未见报道。由于微生物农药使用的增多和一些生防菌往往被忽略了其可能成为人体条件致病菌的风险而被登记使用，微生物农药的风险评估日益成为全球关注的问题。目前已有一些比较成熟的动植物模型用于生物农药菌株的安全性检测，评估这些生防菌对人畜植物环境是否存在潜在风险
发明内容
发明目的针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种松树内生细菌新洋葱伯克霍尔德菌NSM-05，以实现用其对松树枯梢病进行生物防治。本发明的另一目的是提供上述新洋葱伯克霍尔德菌NSM-05的用途。技术方案为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为一种松树内生细菌，其分类命名为洋葱伯克霍尔德菌QBurkholderia cenocepacia ) NSM-05,已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号是CCTCC NO =M 2011015，保藏日期2011年1月11日。新洋葱伯克霍尔德菌NSM-05菌株，是从健康马尾松枝条上分离筛选获得的对松枯梢病具有良好生防效果和促进生长的内生细菌，该内生细菌能在松树体内很好的定殖， 对人畜和植物安全无毒，还具有如下性质
1、形态特征
在牛肉膏蛋白胨培养基平板上菌落圆形、点状，淡黄色、边缘完整、表面光滑、隆起；菌体杆状、无芽孢、大小2. 8^5. 2X0. 9^2. 8 μ m、好氧、氧化酶试验阳性、革兰氏染色阴性、3% KOH试验阳性。2、16S rDNA 分析
测得16SrDNA序列1302bp，具体如SEQ ID No. 1所示。16SrDNA序列通过BLAST比对，在GenBank中找到同源性非常高的相近菌株序列。与NSM-05菌株相似性最高的是新洋葱伯克霍尔德菌(^zr姑oA/eria cenocepacia^,同源性达到99%。通过BIOLOG系统对 NSM-05进行鉴定，该菌株在鉴定板培养16 24h与新洋葱伯克霍尔德菌(^/r姑Weria cenocepacia )读数相似值(SIM值)为0. M5，大于0. 50，符合BIOLOG系统关于理想结果的要求，因此该菌株利用BIOLOG系统，准确鉴定到了种，为新洋葱伯克霍尔德菌 (Burkhο 1 deria cenocepacia )。上述松树内生细菌在松树枯梢病生物防治中的应用。新洋葱伯克霍尔德菌NSM-05 对松枯梢病菌松球壳孢菌(^^aeroAsis sapinea)具有强烈的抑菌作用。上述松树内生细菌在促进松树生长中的应用。新洋葱伯克霍尔德菌NSM-05对松树枯梢病田间生防作用效果好，同时上述新洋葱伯克霍尔德菌NSM-05对松树还具有促进生长作用。上述松树内生细菌在抑制林木病原菌中的应用，即新洋葱伯克霍尔德菌NSM-05 对6种林木病原菌银杏叶枯病链格孢菌(AltGiTmria aheraaia)、鹅掌楸黑斑病交链孢 Ulternaria sp.)、鹅掌楸黑斑病炭疽菌(CWhtoiricfe sp.)、杨树溃疡病菌拟茎点 M (PAomopsis sp.)、金黄克囊抱{Cytospora cArysc^erffla)、七叶树壳梭抱(Fusicoccum aesculi)具有抑菌作用，可应用于防治银杏叶枯病、鹅掌楸黑斑病、杨树溃疡病。上述松树内生细菌在抑制农作物病原菌中的应用，即新洋葱伯克霍尔德菌 NSM-05对7种农作物病原菌水稻纹枯病菌ijhana tephorus cucumeris)、小麦赤霉病 |if iGibberella zeae)> jtttlif {Rhizoctonia sc^sfli )、丰帛花才古妻病菌{Fusarium oxysooriutn) > ^ ^ 1 lif Φοthiorella gregaria) > ^ ^ 1 Bf tt 1 {Guignardia camelliae)、茶轮斑病菌iPestalotiopsis versicolor)具有抑菌作用，可应用于防治水稻纹枯病、小麦赤霉病、棉花立枯病、棉花枯萎病、苹果轮纹病、茶云纹叶枯病、茶轮斑病。一种松枯梢病生防菌剂，采用以下方法制备将新洋葱伯克霍尔德菌NSM-05接种于培养基，通气量1 1，温度^ 30°c，摇床转数18(T200r/min，48飞0h，得到的发酵液即为松枯梢病生防菌剂；其中，培养基的配方为每IOOOml蒸馏水中，含牛肉膏2飞g，蛋白胨 5 10g，氯化钠5g，pH5 7。该发酵液直接喷施到松树梢头和枝干上就可发挥其生物防治作用。有益效果本发明提供的一种新洋葱伯克霍尔德菌NSM-05菌株，是一种松树内生细菌，对松枯梢病菌抑菌作用强，田间生防试验效果好。对松树还具有促进生长作用。并且对多种林木和农作物病原菌具有抑菌作用，具有非常广泛的抑菌谱。培养条件简单，易于保存和生产，在松树体内定殖能力强，生长速度快，克服以往生防菌定殖差，生防效果不稳定等缺点，在植物病害生物防治中起到非常重要的作用，特别是对松枯梢病的防治具有重要的意义，是一种具有良好开发应用前景的广谱型杀菌剂。
图1是新洋葱伯克霍尔德菌NSM-05菌株对松枯梢病菌的拮抗作用结果图。其中， A图是新洋葱伯克霍尔德菌NSM-05菌株，B图是对照(CK)；
图2是新洋葱伯克霍尔德菌NSM-05代谢产物对松枯梢病菌2d的拮抗作用结果图。其中，A图是新洋葱伯克霍尔德菌NSM-05代谢产物，B图是CK ；
图3是新洋葱伯克霍尔德菌NSM-05代谢产物对松枯梢病菌5d的拮抗作用结果图。其中，A图是新洋葱伯克霍尔德菌NSM-05代谢产物，B图是CK ；
图4是新洋葱伯克霍尔德菌NSM-05对松枯梢病田间防治结果图。其中，左图为未生物防治，右图为采用新洋葱伯克霍尔德菌NSM-05对松枯梢病进行生物防治；
图5是新洋葱伯克霍尔德菌NSM-05对湿地松的促生长作用结果图。其中，左图为未处理，右图为采用新洋葱伯克霍尔德菌NSM-05处理；
图6是新洋葱伯克霍尔德菌NSM-05对洋葱的致病性测定结果图。图中，A是接种无菌水的洋葱，B是接种洋葱伯克霍尔德菌LMG1222的洋葱。C是接种新洋葱伯克霍尔德菌 NSM-05的洋葱；
图7是新洋葱伯克霍尔德菌NSM-05对洋葱的致病性测定结果切开图。其中，A图是接种无菌水的洋葱，B图是接种洋葱伯克霍尔德菌LMG1222的洋葱。C图是接种新洋葱伯克霍尔德菌NSM-05的洋葱；
图8是新洋葱伯克霍尔德菌NSM-05对苜蓿的致病性测定结果图。图中，A是接种无菌水的苜蓿，B是接种洋葱伯克霍尔德菌LMG1222的苜蓿，C是接种新洋葱伯克霍尔德菌NSM-05 的苜蓿；
图9是新洋葱伯克霍尔德菌NSM-05代谢产物对松枯梢病菌的抑菌活性表。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进一步的解释。以下实施例所使用的培养基配方为
PDA平板培养基配方马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂20g，蒸馏水IL ； NA培养基配方牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂20g，pH 7. 3，蒸馏水IL ； NB培养基配方牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂20g, pH 7. 3，蒸馏水IL0
实施例1新洋葱伯克霍尔德菌NSM-05对松枯梢病菌QSphaeropsis sapinea )抑菌作用。采用PDA平板培养基，250C，恒温培养松枯梢病菌3、天，用直径5mm的打孔器打取同质同量的菌块，接种于PDA平板的中央，再用NA培养基斜面活化好的新洋葱伯克霍尔德菌NSM-05划线接种于距松枯梢病菌菌块3. 5cm的两侧，以只接种松枯梢病菌的PDA平板作为对照，每个处理3个重复，28°C恒温培养3飞天，待对照长满整个平板时观察结果。试验结果如图1所示，新洋葱伯克霍尔德菌NSM-05对松枯梢病菌具有强烈的抑菌作用，抑菌圈(病原菌与NSM-05菌株的距离)直径平均值为11. 15mm。实施例2新洋葱伯克霍尔德菌NSM-05代谢产物对松枯梢病菌的抑菌作用。在NB培养液中接种新洋葱伯克霍尔德菌NSM-05，30°C，200r/min摇培48h，制得发酵液。然后将发酵液在4°C，10000r/min，离心20分钟。取上清，经过0. 22 μ m微孔的细菌过滤器过滤除菌，得到无菌发酵液即为NSM-05菌株的代谢产物。将制备好的PDA培养基灭菌冷却至50°C左右，每IOml的培养基加入Iml无菌发酵液混勻倒平板，制成带毒平板。 2天后接种松枯梢病菌，并以没有加入无菌发酵液的PDA培养基接种松枯梢病菌作为对照。 25°C培养5d，观察其生长情况，计算抑菌率。试验结果如图9、图2和图3所示，无菌发酵液对松枯梢病菌具有明显的拮抗作用，2d的抑菌率为80. 18%，5d的抑菌率57%，说明新洋葱伯克霍尔德菌NSM-05代谢产物具有抑菌物质。抑菌率的计算公式为生长抑菌率(％)= (对照平板菌落直径-带毒平板菌落直径)+ (对照平板菌落直径-菌块直径)X 100%。实施例3新洋葱伯克霍尔德菌NSM-05对松枯梢病田间防治。2010年5飞月，在南京林业大学南大山森林病理研究所松林地进行新洋葱伯克霍尔德菌NSM-05对松枯梢病田间防治。松枯梢病菌的接种方法先用无菌接种刀轻轻将湿地松梢头枝干划破Icm左右长度的表皮，再将松枯梢病菌破碎液喷雾接种于湿地松梢头。处理1 接种松枯梢病菌前3d灌根接种新洋葱伯克霍尔德菌NSM-05菌株发酵液(实施例2制备)100ml/株。处理2 接种松枯梢病菌前3d喷雾接种新洋葱伯克霍尔德菌NSM-05菌株发酵液直至松树湿透为止。处理3:直接接种松枯梢病菌。每个处理20株，3个重复。每天观察发病情况。接种IOd后调查发病情况。统计发病指数及防病效果。发病分级标准如表2 所示，试验结果如如表3和图4所示，新洋葱伯克霍尔德菌NSM-05对松枯梢病具有良好的生防作用。表2松枯梢病接种发病分级标准
权利要求
1.一种松树内生细菌，其分类命名为新洋葱伯克霍尔m、KBurkholderia cenocepacia) mM-05,已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号是CCTCC NO =M 2011015，保藏日期2011年1月11日。
2.权利要求1所述的松树内生细菌在松树枯梢病生物防治中的应用。
3.权利要求1所述的松树内生细菌在促进松树生长中的应用。
4.一种松枯梢病生防菌剂，其特征在于，该生防菌剂采用以下方法制备将新洋葱伯克霍尔德菌NSM-05接种于培养基，通气量1 :1，温度观 301，摇床转数18(T200r/min， 48飞0h，得到的发酵液即为松枯梢病生防菌剂；其中，培养基的配方为每IOOOml蒸馏水中，含牛肉膏2 5g，蛋白胨5 10g，氯化钠5g，pH5 7。
5.权利要求4所述的松枯梢病生防菌剂在松树枯梢病生物防治和促进松树生长中的应用。
6.权利要求1所述的松树内生细菌在抑制林木病原菌中的应用，其中，林木病原菌包括银杏叶枯病链格孢菌、鹅掌楸黑斑病交链孢、鹅掌楸黑斑病炭疽菌、杨树溃疡病菌的拟茎点霉和金黄克囊孢和七叶树壳梭孢。
7.权利要求1所述的松树内生细菌在抑制农作物病原菌中的应用，其中，农作物病原菌包括水稻纹枯病菌、小麦赤霉病菌、棉花立枯病菌、棉花枯萎病菌、苹果轮纹病菌、茶云纹叶枯病菌和茶轮斑病菌。
全文摘要
本发明公开了一种松树内生细菌，其分类命名为新洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cenocepacia)NSM-05，已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号是CCTCC NOM2011015，保藏日期2011年1月11日。本发明还公开了上述新洋葱伯克霍尔德菌NSM-05在防治松枯梢病中的应用和在促进松树生长中的应用。本发明还提供了一种防治松枯梢病的生防菌剂，即将NSM-05菌株接种于培养基中发酵培养所得。本发明的NSM-05菌株为松树内生细菌，对松枯梢病菌抑菌作用强，对多种林木和农作物病原菌具有拮抗作用，抑菌谱广，对人畜和植物安全无毒，具有良好的开发应用前景。
文档编号A01N63/02GK102191201SQ20111008209
公开日2011年9月21日 申请日期2011年4月1日 优先权日2011年4月1日
发明者叶建仁, 吴小芹, 袁文婷, 黄洁芳 申请人:南京林业大学