专利名称：一种羽衣甘蓝小孢子再生植株的培养方法
技术领域：
本发明涉及植物组织培养技术领域，尤其涉及一种羽衣甘蓝小孢子再生植株的培养方法。
背景技术：
羽衣甘蓝(Brassica oleracea L. var. acephala)又名叶牡丹，是十字花科芸薹属甘蓝种的一个变种，为2年生草本植物，其叶片形态美观、色彩多变，整个植株形如牡丹花， 观赏价值极高。近几年，我国多从美国、日本、荷兰等地引进羽衣甘蓝，因羽衣甘蓝含有大量的维生素A、C、&及多种矿物质，特别是钙、铁、钾含量很高，其营养价值远高于普通甘蓝，多作特菜栽培。由于有些羽衣甘蓝品种叶色鲜艳美丽，红、黄、绿相间，皱缩特殊，形态各异，可用来装饰宴会的餐桌，布置城市公园和大型花坛，美化中心广场和商业街面，因此，又被广泛用于观叶栽培。羽衣甘蓝原产地中海和小亚西亚一带，英国、荷兰、德国和美国种植较多。我国近几年也开始引种栽培和开发研究，目前种子基本依靠进口，价格昂贵，成本高，究其原因是因为我们自己的羽衣甘蓝育种资源少，育不出好的品种。传统的育种方法是通过引进国外优良品种进行自交分离，周期长，需要耗费大量的人力物力，但还不一定能选育到好的品种。因此迫切需要创新育种手段，把市场上应用的品种快速纯合，获得育种资源。小孢子培养方法可以在1 2年内快速获得双单倍体纯系，比传统的方法缩短了 3 4年的时间，从而大大缩短了育种进程，提高了育种的效率。中国专利ZL2006101U997. 5中公开了一种获得羽衣甘蓝小孢子再生植株的方法及其专用培养基。该培养方法包括以下步骤1)将小孢子接种于胚状体诱导培养基中，至终浓度为5 X IO4 5 X IO5个/ML，接着在30 35°C、黑暗条件下高温胁迫处理M 72小时后，再转入M 26°C、黑暗条件下诱导胚状体；幻待鱼雷期至子叶期胚状体形成后，将胚状体先在24 ^°C、1500 2500LUX、14 18小时光照/天条件下继续培养5 10天， 再将胚状体接种于分化培养基中，在相同条件下培养；幻长出茎、叶后，将植株转接入生根培养基中，在24 ^°C、1500 2500LUX、14 18小时光照/天条件下进行生根培养，得到羽衣甘蓝再生植株。自1982年Lichter首次报道油菜游离小孢子培养获得再生植株以来，芸薹属作物在出胚率、出胚量、胚培养及再生植株方面都获得了很大的成功。羽衣甘蓝游离小孢子培养的报道首见于1989年(Lichter和Takahata)，随后Duijs等人(1992)、汤清林等(2000)、 姜凤英和冯辉O005)等人也做了不少研究，但羽衣甘蓝出胚率不高的问题依然没有解决。 有关芸薹属游离小孢子培养的大量研究表明，供体植株的基因型对小孢子胚胎发生的影响极为重要，它不仅影响产胚率，而且也影响胚的质量(Chuong et al.，1988)，抑制了小孢子培养育种技术的应用。因此，寻找一种提高羽衣甘蓝出胚率的方法具有重要的意义
发明内容
本发明提供了一种羽衣甘蓝小孢子再生植株的培养方法，采用高出胚率的油菜品种和难出胚的羽衣甘蓝品种混合培养，得到难出胚的羽衣甘蓝小孢子苗，提高羽衣甘蓝小孢子培养出胚率。一种羽衣甘蓝小孢子再生植株的培养方法，包括以下步骤1)取羽衣甘蓝的花序和油菜的花序作为小孢子培养的供体植株；直接或将花序诱导后取花蕾，得到油菜和羽衣甘蓝混合花蕾；2)将灭菌后的油菜和羽衣甘蓝混合花蕾中加入NLN-13诱导培养基，研磨成悬浮液，过滤所得滤液经离心、弃上清液得到沉淀，依次加入NLN-13诱导培养基和活性炭混合液，得到小孢子混合悬浮液；3)将小孢子悬浮液在黑暗条件下于32°C 33°C恒温热激处理1天 3天，后取出在黑暗条件下于25士2°C培养20天 30天，得到子叶期胚状体；4)将子叶期胚状体接种至胚状体分化培养基中培养至形成胚状体；将胚状体接种到胚状体分化培养基中继续培养，直至分化，再生成芽；5)切取再生芽接种至生根培养基上培养，将根生长健壮的苗经炼苗和移栽，得到再生植株，鉴定。为了达到更好的效果，优选步骤1)中，所述的花蕾选用花序上花瓣和花药长度比为0.6 1. 1、单核晚期至双核早期的花蕾，更利于小孢子的培养。诱导后的花蕾也更利于小孢子的培养，所述的诱导的条件为在；TC 5°C诱导 0. 1小时 48小时。所述的油菜和羽衣甘蓝混合花蕾中油菜花蕾与羽衣甘蓝花蕾的用量一般不做特别的限定，为了达到更好的效果，进一步优选油菜花蕾的数量略大于羽衣甘蓝花蕾的数量。步骤2、中，所述的灭菌采用本领域常规的灭菌方法，可采用灭菌液将油菜和羽衣甘蓝混合花蕾灭菌15 20分钟，清洗干净后得到灭菌后的油菜和羽衣甘蓝混合花蕾。一般用于外植体灭菌的灭菌液有升汞溶液、次氯酸钠溶液等，由于升汞溶液有很大的毒性，且污染环境，对人体有害；而次氯酸钠灭菌的效果较好，没有毒害，所述的灭菌液优选次氯酸钠溶液。以IL次氯酸钠溶液计，组成为质量百分浓度为5. 6%的次氯酸钠水溶液56ml、无水乙醇100ml、洗洁精8滴 10滴和余量的无菌水。所述的NLN-13诱导培养基为由NLN液体培养基IL和蔗糖130g组成，pH 6. 0 6. 2 ；高温高湿灭菌，备用。所述的活性炭混合液的组成为NLN液体培养基1L、琼脂糖2g 5g和Ig活性炭； 高温灭菌，备用。所述的NLN 液体培养基，以 IL 计，组成为=KNO3 125mg，Ca(NO3)2 · 4H20 500mg, MgSO4 · 7H20 125mg, KH2PO4 125mg, H3BO3 6. 2mg, MnSO4 · H2O 18. 95mg, ZnSO4 · 7H20 8. 6mg, Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg, CuSO4 · 5H20 0. 025mg, CoCl2 · 6H20 0. 025mg，维生素 Bl (VB1) 0. 5mg, 维生素 B6 (VB6) 0. 5mg,生物素 0. 05mg,叶酸 0. 5mg, Na2EDTA 37. 3mg, FeSO4 · 7H20 27. 8mg,肌醇lOOmg，甘氨酸ang，烟酸5mg，L-谷氨酰胺800mg，谷胱甘肽30mg，维生素B55mg，丝氨酸 IOOmg和余量的无菌水。所述的沉淀可以重复以下操作1 2次在沉淀中加入NLN-13诱导培养基，研磨成悬浮液，过滤所得滤液经离心、弃上清液。重复操作后所得的沉淀中依次加入NLN-13诱导培养基和活性炭混合液，得到小孢子混合悬浮液。所述的小孢子混合悬浮液中小孢子的浓度为0. 8X IO5个/mL 1. 2X IO5个/mL。所述的过滤可采用45 μ m无菌滤网。所述的离心的条件一般为600rpm/min 900rpm/min离心3min 5min。步骤3)中，在黑暗条件下于25士2°C培养20天 30天的具体步骤为在黑暗条件下于25士2°C培养至肉眼可见胚状体时，再在黑暗条件下于25士2°C条件下摇动培养；摇动培养相对于不摇动培养的小孢子胚生长的较健壮。步骤4)中，所述的培养条件为每天12小时 18小时光照和20°C 下培养；进一步优选为每天16小时光照和25°C下培养。一般培养时间为2周 3周。所述的胚状体较大时可切成多块后接种。所述的胚状体分化培养基为由MS培养基1L、蔗糖20g和琼脂IOg 12g组成， pH5. 8 6. 1 ；高温高湿灭菌。步骤5)中，所述的生根培养基为由MS培养基1L、糖20g 30g和琼脂6g 7g 组成，pH5. 8 6. 0 ；所述的糖为蔗糖或白糖；高温高湿灭菌。所述的MS 培养基，以 IL 计，组成为=NH4HO3 1650mg, KNO3 1900mg, CaCl2 · 2H20 440mg, KH2PO4 170mg，MgSO4 ·7Η20 370mg, FeSO4 ·7Η2027. 8mg, Na2EDTA 37. 3mg, H3BO3 6. 2mg, MnSO4 · H2O 16. 9mg, ZnSO4 · 7H20 8. 6mg, Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg, CuSO4 · 5H20 0. 025mg, CoCl2 · 6H20 0. 025mg, KI 0. 83mg,肌醇 IOOmg,甘氨酸 2mg,烟酸 0. 5mg,维生素 BIO. lmg,维生素B60. 5mg和余量的无菌水。移栽时用清水洗净组培苗根部培养基，用质量百分浓度为75% 80%的百菌清 (如市售的百菌清可湿性粉剂)800 1000倍(稀释的倍数)液浸泡组培苗根部1 2分钟后植于羽衣甘蓝育苗专用基质穴盘，塑料膜罩住保湿，在温室中培养15 20天后移栽。 通过百菌清来杀菌，并给予一定的缓冲环境，以更好的使在生长环境较好的实验室里生长的组培苗适应较严酷的自然环境。
所述的鉴定可采用本领域常用的倍性鉴定方法，如取再生植株的嫩叶检测各再生植株倍性，并从再生植株群体中鉴定出油菜再生苗和羽衣甘蓝再生苗。可用美国BD公司的 BD FACSCalibur流式细胞仪进行倍性分析和再生植株种类的鉴定。本发明的有益效果为1、本发明针对现有羽衣甘蓝小孢子培养出胚率低，尤其是非常难以出胚的品种， 提供了一种提高出胚率的方法，采用易出胚的油菜品种和难出胚的羽衣甘蓝花蕾混合培养的方法，以易出胚的材料带动难出胚的材料出胚，提高羽衣甘蓝的出胚率。本发明方法混合培养羽衣甘蓝出胚率最高达104个/蕾，而对照羽衣甘蓝出胚率最高仅为0. 7个/蕾，解决了羽衣甘蓝小孢子培养胚胎发生频率较低的问题，提高了小孢子培养技术的利用效率。2、经肉眼观察及流式细胞仪检测发现，在相同的条件下混合培养最后能得到13 株羽衣甘蓝小孢子苗，而羽衣甘蓝花蕾单独培养的对照株数为0个。
具体实施例方式实施例1
培养方法按如下步骤进行。(1)培养基配制包括小孢子不同培养阶段的培养基，其组分与各组分在每升培养基中所含的重量为表INLN和MS培养基成分表
权利要求
1.一种羽衣甘蓝小孢子再生植株的培养方法，包括以下步骤1)取羽衣甘蓝的花序和油菜的花序作为小孢子培养的供体植株；直接或将花序诱导后取花蕾，得到油菜和羽衣甘蓝混合花蕾；2)将灭菌后的油菜和羽衣甘蓝混合花蕾中加入NLN-13诱导培养基，研磨成悬浮液，过滤所得滤液经离心、弃上清液得到沉淀，依次加入NLN-13诱导培养基和活性炭混合液，得到小孢子混合悬浮液；3)将小孢子悬浮液在黑暗条件下于32°C 33°C恒温热激处理1天 3天，后取出在黑暗条件下于25士2°C培养20天 30天，得到子叶期胚状体；4)将子叶期胚状体接种至胚状体分化培养基中培养至形成胚状体；将胚状体接种到胚状体分化培养基中继续培养，直至分化，再生成芽；5)切取再生芽接种至生根培养基上培养，将根生长健壮的苗经炼苗和移栽，得到再生植株，鉴定。
2.根据权利要求1所述的羽衣甘蓝小孢子再生植株的培养方法，其特征在于，步骤1) 中，所述的花蕾为花序上花瓣和花药长度比为0. 6 1. 1、单核晚期至双核早期的花蕾。
3.根据权利要求1所述的羽衣甘蓝小孢子再生植株的培养方法，其特征在于，步骤1) 中，所述的诱导的条件为在3°C 5°C诱导0. 1小时 48小时。
4.根据权利要求1所述的羽衣甘蓝小孢子再生植株的培养方法，其特征在于，步骤2) 中，所述的NLN-13诱导培养基为由NLN液体培养基IL和蔗糖130g组成，pH 6. 0 6. 2 ；所述的活性炭混合液的组成为NLN液体培养基1L、琼脂糖2g-5g和Ig活性炭；所述的NLN液体培养基，以IL计，组成为KN03125mg，Ca(NO3)2 · 4H20 500mg, MgSO4 · 7H20 125mg, KH2PO4125mg, H3B036. 2mg, MnSO4 · H2O 18. 95mg, ZnSO4 · 7H20 8. 6mg, Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg, CuSO4 · 5H20 0. 025mg, CoCl2 · 6H20 0. 025mg，维生素 BIO. 5mg，维生素 B60. 5mg,生物素 0. 05mg,叶酸 0. 5mg, Na2EDTA 37. 3mg, FeSO4 · 7H2027. 8mg，肌醇 lOOmg， 甘氨酸ang，烟酸5mg，L-谷氨酰胺800mg，谷胱甘肽30mg，维生素B55mg，丝氨酸IOOmg和余量的无菌水。
5.根据权利要求1所述的羽衣甘蓝小孢子再生植株的培养方法，其特征在于，步骤2) 中，所述的沉淀重复以下操作1 2次在沉淀中加入NLN-13诱导培养基，研磨成悬浮液， 过滤所得滤液经离心、弃上清液。
6.根据权利要求1所述的羽衣甘蓝小孢子再生植株的培养方法，其特征在于，步骤2) 中，所述的小孢子混合悬浮液中小孢子的浓度为0. 8X IO5个/mL 1. 2X IO5个/mL。
7.根据权利要求1所述的羽衣甘蓝小孢子再生植株的培养方法，其特征在于，步骤3) 中，在黑暗条件下于25士2°C培养20天 30天的具体步骤为在黑暗条件下于25士2°C培养至肉眼可见胚状体时，再在黑暗条件下于25士2°C条件下摇动培养。
8.根据权利要求1所述的羽衣甘蓝小孢子再生植株的培养方法，其特征在于，步骤4) 中，所述的培养条件为每天12小时 18小时光照和20°C 下培养。
9.根据权利要求1所述的羽衣甘蓝小孢子再生植株的培养方法，其特征在于，步骤4) 中，所述的胚状体分化培养基为由MS培养基1L、蔗糖20g和琼脂IOg 12g组成，pH5. 8 6. 1。
10.根据权利要求1所述的羽衣甘蓝小孢子再生植株的培养方法，其特征在于，步骤5)中，所述的生根培养基为由MS培养基1L、糖20g 30g和琼脂6g 7g组成，pH5. 8 6.0;所述的糖为蔗糖或白糖。
全文摘要
本发明公开了一种羽衣甘蓝小孢子再生植株的培养方法，包括取羽衣甘蓝和油菜的花序，直接或诱导后取花序上的花蕾，灭菌后加入NLN-13诱导培养基，制成悬浮液，过滤所得滤液经离心得到沉淀；依次加入NLN-13诱导培养基和活性炭混合液，得到小孢子悬浮液；经热激处理后培养，得到子叶期胚状体；接种至胚状体分化培养基中直至分化，再生成芽；切取再生芽接种至生根培养基上生根培养，经炼苗和移栽，得到再生植株；取再生植株的嫩叶检测各再生植株倍性，并从再生植株群体中鉴定出油菜再生苗和羽衣甘蓝再生苗。该方法将易出胚的油菜与难出胚的羽衣甘蓝品种混合培养，以易出胚的材料带动难出胚的材料出胚，提高羽衣甘蓝的出胚率。
文档编号A01H4/00GK102228003SQ20111011269
公开日2011年11月2日 申请日期2011年5月3日 优先权日2011年5月3日
发明者刘旦, 周伟军, 张振超, 戴忠良, 潘跃平 申请人:江苏丘陵地区镇江农业科学研究所, 浙江大学