专利名称：一种提高中国对虾免疫力的方法
技术领域：
本发明属于中国对虾养殖领域，具体的说是交替投喂添加免疫增强剂的饲料和不添加免疫增强剂的饲料，以提高中国对虾免疫力的方法。
背景技术：
中国对虾的自身抵抗力较差，并且养殖水环境较大，难以针对性的用药，因此，一旦感染病害，几乎全池覆灭。水产养殖的行业特点决定了在对待水产业病害上“重在防治”， 因此如何提高水产动物的自身的免疫力，是搞好水产养殖的关键。免疫增强剂是一类可以提高生物机体免疫能力的物质，研究发现，肽聚糖、脂多糖、葡聚糖等微生物多糖及小肽、水解蛋白、益生菌等生物活性物质均能不同程度的提高生物机体的免疫力，增强抗病力；蛋白质在酶解过程中可以产生一些具有特殊生理功能的生物活性肽。生物活性肽在水产养殖中可提高成活率、提高饲料转换率及促进对饲料中各种矿物质元素的利用率，具有抗菌、免疫、抗氧化作用以及调节肉制品风味等特性，李清等 (饲料研究，200 在“小肽对鲤鱼免疫力的影响”一文中研究表明通过在鲤鱼日粮中添加一定量的小肽，能显著增加鲤鱼血液中的免疫球蛋白和补体浓度。肽聚糖(ρ印tid0nglyCan，PGN)是细菌细胞壁的基本骨架。具有重要生理作用，如免疫调节、抵抗肿瘤、诱导睡眠等。也有研究表明，PGN对摄食也有调节作用。周进等(饲料与工业，2006)在牙鲆日粮添加一定剂量的A3-肽聚糖，结果表明牙鲆血清中总免疫球蛋白、免疫球蛋白M及白蛋白与球蛋白的比率在40d时显著提高。然而在生产实践中表明长期使用某种免疫增强剂不仅经济成本高，而且中国对虾还会对某一免疫增强剂产生免疫疲劳，从而导致免疫效果下降。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种提高中国对虾免疫力的方法，以达到最优的免疫效果，并降低长期投喂免疫增强剂的养殖成本。为了解决上述技术问题，本发明是采取以下技术方案(1)免疫增强剂的获得用酶水解鱼肉法制备水解鱼蛋白粉，制备方法已申请发明专利(申请号:20091022989. X)；(2)在中国对虾基础饲料中添加1. 4% (重量比)的水解鱼蛋白粉，用逐级扩大混合的方法与饲料原料混合，制成颗粒饲料；(3)投喂所述添加1. 4%的水解鱼蛋白粉的饲料与所述基础饲料交替投喂中国对虾。上述步骤⑵所述的基础饲料，优选成份为鱼粉40%、豆粕20%、高筋粉 23. 5%、胆碱0.5%、虾粉10%、鱼油1%、磷脂1.5%、复合维生素1%、复合矿物质1%、碳酸氢钙1.5%。上述步骤(；3)所述的交替投喂中国对虾，即投喂7天中国对虾基础饲料中添加1. 4%水解鱼蛋白粉的饲料，然后投喂7天中国对虾基础饲料，如此循环。本发明的有益效果在中国对虾基础饲料中分别添加质量比为1. 4%的水解鱼蛋白粉和0. 的肽聚糖，投喂方式为以下几种每投喂7天添加1. 4%的水解鱼蛋白粉饲料，然后投喂7天中国对虾基础饲料，如此循环；连续投喂基础饲料；连续投喂添加1. 4%水解鱼蛋白粉饲料；连续投喂添加0. 的肽聚糖饲料；投喂2天1. 4%水解鱼蛋白粉饲料然后投喂5天基础饲料和投喂7天1. 4%水解鱼蛋白粉饲料然后投喂7天基础饲料，对平均体重5. 23士0. 12g， 体长5. 2士0. 30cm的中国对虾进行饲喂实验，定期取样检测试验中国对虾的血液非特异性免疫指标，经过8周的养殖试验，结果显示每间隔7天投喂7天添加1. 4%的水解鱼蛋白粉饲料的中国对虾血清酚氧化酶活性、血清碱性磷酸酶活性、血清溶菌酶活性、血清超氧化物歧化酶活性与连续投喂水解鱼蛋白粉组、肽聚糖组差异不显著；血清过氧化物酶活性在第5周结束时显著高于连续投喂水解鱼蛋白粉组、肽聚糖组；存活率和增重率与连续投喂水解鱼蛋白粉组差异不显著；本发明在中国对虾基础饲料中添加1. 4%的水解鱼蛋白粉，添加1. 4%的水解鱼蛋白粉饲料与中国对虾基础饲料各交替投喂7天，与连续投喂添加1. 4%的水解鱼蛋白粉饲料相比，能够获得相同的免疫效果，但能节省一半的经济成本。
图1酸性磷酸酶活性变化；图2碱性磷酸酶活性变化；图3溶菌酶活性变化；图4 酚氧化酶活性变化；图5过氧化物酶活性变化；图6超氧化物歧化酶活性变化。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明。1材料与方法1. 1水解鱼蛋白粉和肽聚糖的制备水解鱼蛋白粉制备同发明专利中国对虾非特异免疫增强剂寡肽的制备与应用 (申请号20091022989.X)；肽聚糖由黄海水产研究所病研室赠送。1.2实验饲料以鱼粉和豆粕为主要蛋白源，鱼油为主要脂肪源配制成基础饲料，成份为鱼粉 40%、豆粕20%、高筋粉23. 5%、胆碱0.5%、虾粉10%、鱼油1%、磷脂1.5%、复合维生素1%、复合矿物质1%、碳酸氢钙1. 5% ；其中复合维生素(mg/kg or g/kg饲料)的成分为硫胺素，25mg ；核黄素，45mg ；盐酸吡哆醇，20mg ；维生素B12,0. Img ；维生素K3, IOmg ；肌醇，800mg ；泛酸，60mg ；烟酸，200mg ；叶酸，20mg ；生物素，1. 20mg ；维生素A，32mg ；维生素D， 5mg ；维生素E，120mg ；次粉18. 67g ；复合矿物质(mg/kg or g/kg饲料)的成分为氟化钠，2mg ；碘化钾，0. 8mg ；氯化钴，50mg ；硫酸铜，IOmg ；硫酸铁，80mg ；硫酸锌，50mg ；硫酸镁， 1200mg ；磷酸二氢钙，3000mg ；氯化纳，IOOmg ；沸石粉，15. 51g。在中国对虾基础饲料中分别添加质量比为1.4%水解鱼蛋白粉和0. 的肽聚糖，用逐级扩大混合的方法与基础饲料原料混合，经螺杆挤条机制成直径为1. 5mm的实验饲料，60°C烘干后，剪切成3mm长的颗粒贮存于-20°C冰箱中待用，另制作不添加免疫增强
4剂的基础饲料作为对照组实验用料。1. 3实验中国对虾的管理中国对虾取自黄海水产研究所鳌山卫基地，挑选个体大小均勻的健康中国对虾 1500尾(体重5. 23 士0. 12g，体长5. 2 士0. 30cm)，用基础饲料饱食投喂暂养10天，随机分到 18个缸里进行饲养，每缸50尾。实验分6种投喂方法Fm(对照)连续投喂中国对虾基础饲料；Fph 连续投喂中国对虾基础饲料中添加1. 4% (重量比)水解鱼蛋白粉饲料；Fre 连续投喂中国对虾基础饲料中添加0. (重量比)肽聚糖的饲料；F2PH+5M 投喂2天中国对虾基础饲料中添加1. 4%水解鱼蛋白粉饲料，然后投喂5天中国对虾基础饲料，如此循环； F7PH+7M 投喂7天中国对虾基础饲料中添加1. 4%水解鱼蛋白粉饲料，然后投喂7天中国对虾基础饲料，如此循环；F7PH+7re 投喂7天中国对虾基础饲料中添加1. 4%水解鱼蛋白粉饲料， 然后投喂7天中国对虾基础饲料中添加0. 肽聚糖的饲料，如此循环。每种投喂方法设3个平行组，饲养期间连续充气，水温M_28°C，盐度ZAjegL—1， pH7. 8-8. 2，溶解氧不低于6. SmgL—1。每日换水1次，日换水量为1/3。每天投喂4次，投喂时间:6:00、11:00、18:00和23:00，养殖实验进行8周。1. 4中国对虾样品的采集、分析与计算在8周中国对虾养殖实验期间，每周日取实验中国对虾血液测定免疫指标，8周实验结束时称重并计算存活率、增重率。1. 4. 1抗凝血的制备用Iml的无菌注射器从心脏部位进行取血，血淋巴与抗凝剂(抗凝剂柠檬酸 0. 48g、柠檬酸钠1. 32g、葡萄糖1. 47g，加水至100ml，灭菌后备用)按照1 1的比例混合， 离心(3000Xg，4°C )，取上清液测测溶菌酶、过氧化物酶、酚氧化酶、超氧化物歧化酶、一氧化氮合酶、酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性，并进行血细胞记数。1.4. 2免疫指标测定酚氧化酶活性测定以L-多巴为底物，采用改进的Ashida方法在96孔酶标板中进行。在酶标仪O00m，Tecan)中振荡4次，每隔^iin读取490nm处的吸光值。在实验条件下，每分钟每毫克血清蛋白OD4i32增加0.001为一个酶活力单位(U min-1 mg pr_l)。酚氧化酶活力=103 (A终-A初)/C，其中A吸光度值，C为血清蛋白浓度。过氧化物酶活性测定、超氧化物歧化酶活性测定、酸性磷酸酶，碱性磷酸酶和溶菌酶活性测定均用南京建成试剂盒测定。1.4.3统计方法及计算各处理的数据进行单因素方差分析。当差异显著(P < 0. 05)时，用Duncan’ s检验法进行均值间多重比较。统计分析所用的软件为SPSS 11.5 for Windows。存活率(％) = NtX 100/N0 ；Nt为实验结束时虾体数；Ntl为实验开始时虾体数；增重率(%) = [ (Wt-W0) /W0] X 100 ；W0和Wt分别为初始体重和终末体重，t为实验天数。2 结果2. 1不同投喂方法对中国对虾血清非特异性免疫指标的影响2. 1. 1不同投喂方法对中国对虾血清酸性磷酸酶活性的影响
血清酸性磷酸酶活性变化如图1。Fph、Fre、F7PH+7M、F7PH+7PG组酸性磷酸酶活性在第一到第三周缓慢上升，第四、五周快速上升，第五周结束时血清酸性磷酸酶活力达到最高值，F7PH+7M 组显著高于 Fpg、Fph、F7PH+7PG 组(P < 0. 05)，Fpg、Fph、F7PH+7PG 组间无显著性差异(P > 0. 05)，第六到八周酸性磷酸酶活性基本呈下降趋势；F2PH+5M组酸性磷酸酶活性在第四周结束达到最高值，对照组Fm组八周实验期间酸性磷酸酶活性均显著低于其他实验组(P
<0. 05)，并且高低变化不大。2. 1. 2不同投喂方法对中国对虾血清碱性磷酸酶活性的影响血清碱性磷酸酶活性变化如图2。Fph、Fre、F7PH+7M、F7PH+7PG组对虾血清碱性磷酸酶活性从第一周到第五周基本呈升高趋势，在实验第五周结束时碱性磷酸酶活力值最高，并且显著高于 Fm、F2hmm 两组(P < 0. 05)，Fph、Fpg、F7PH+7M、F7PH+7PG 组间无显著性差异(P > 0. 05)， 第六周开始下降，Fm、F2PH+5M组变化波动不大。2. 1. 3不同投喂方法对中国对虾血清溶菌酶活性的影响血清溶菌酶变化如图3。FPH、Fre、F7PH+7M、F7PH+7re组血清溶菌酶活性以第五周结束时为分界点呈现先升高后降低的趋势，在第五周结束时组血清溶菌酶活性达到最高，且著高于 Fm、F2PH+5M 组(P < 0. 05)，F7PH+7M 组显著高于 Fra、Fre、F7PH+7re 组(P < 0. 05)，Fph 组显著高于 Fpg 组(P < 0. 05)。2. 1. 4不同投喂方法对中国对虾血清酚氧化酶活性的影响血清酚氧化酶活性变化如图4。实验第一周结束各组血清酚氧化酶活性无显著性差异(P > 0. 05)，FPH、Fre、F7PH+7M、F7PH+7re组血清酚氧化酶活性从第二周开始上升，第三、四周加速上升，在第五周结束时血清酚氧化酶活性达到最高，并且显著高于Fm组和F2PH+5M组(P
<0. 05)，FPH、Fre、F7PH+7M组间无显著性差异(P > 0. 05)，从第六周到第八周血清酚氧化酶活性逐渐下降，在第八周结束时除F2PH+5M组外其他各组血清酚氧化酶活性均显著高于Fm组对照组(P < 0. 05)。2. 1. 5不同投喂方法对中国对虾血清过氧化物酶活性的影响 血清过氧化物酶活性变化如图5。FPH、Fre、F2PH+5M、F7PH+7M、F7PH+7re组过氧化物酶活性呈现先升高后降低的趋势，在第五周结束时各组过氧化物酶活性达到最高值，F7PH+7PG组F7PH+7M 组、Fre组、Fph组过氧化物酶活性显著高于F2PH+5M组和Fm组，F7PH+7re组、F7PH+7M组、Fre组、Fph组间无显著性差异(P < 0. 05)。2. 1. 6不同投喂方法对中国对虾血清超氧化物歧化酶活性的影响血清超氧化物歧化酶活性变化如图6。F7PH+7M组对虾血清超氧化物歧化酶活性呈现高低交替变化的规律，其他各实验组血清超氧化物歧化酶活性变化不大，各个时间段都维持在同一水平。2. 2不同投喂方法对中国对虾生长性能的影响在中国对虾基础饲料中分别添加1. 4%的水解鱼蛋白粉和0. 1 %肽聚糖通过不同的投喂方式饲喂中国对虾，经过8周的养殖实验，统计各实验组的存活率和增重率，结果如表1。由表1可见，在实验结束时F7PH+7M组与F7PH+7re组、Fph组、Fre组对虾存活率无显著性差异(P > 0. 05)，，Fm、F2PH+5M组存活率最低显著低于其他组(P < 0. 05)。各实验组中国对虾增重率如表1。由表1可见，Fph、F7PH+7M、F7PH+7PG增重率显著高于 Fm、F2PH+5M 组(P < 0. 05)，且 Fph、F7PH+7M、F7PH+7PG 组间无显著性差异(P > 0. 05)，对照组 Fm 组对虾增重率最低。表1.不同投喂方法对对虾活率、增重率的影响(％ )
权利要求
1.一种提高中国对虾免疫力的方法，其特征在于交替投喂中国对虾基础饲料和在中国对虾基础饲料中添加1. 4% (重量比)水解鱼蛋白粉的饲料。
2.根据权利要求1所述的提高中国对虾免疫力的方法，其特征在于交替投喂周期为7 天，即投喂7天中国对虾基础饲料中添加1. 4%水解鱼蛋白粉的饲料，然后投喂7天中国对虾基础饲料，如此循环。
全文摘要
一种提高中国对虾免疫力的方法，其特征在于交替投喂中国对虾基础饲料和在中国对虾基础饲料中添加1.4％(重量比)水解鱼蛋白粉的饲料，即投喂7天中国对虾基础饲料中添加1.4％水解鱼蛋白粉的饲料，然后投喂7天中国对虾基础饲料，如此循环。用本发明方法投喂中国对虾，测定中国对虾的血清酸性磷酸酶活性、血清酚氧化酶活性、血清溶菌酶活性、过氧化物酶活性变化、血清超氧化物歧化酶活性，与连续投喂水解鱼蛋白粉组、肽聚糖组差异不显著；存活率和增重率与连续投喂水解鱼蛋白粉组差异不显著；因此，使用本发明方法饲喂中国对虾，与连续投喂基础饲料中添加1.4％的水解鱼蛋白粉饲料相比，能够获得相同的免疫效果，但能节省了一半的经济成本。
文档编号A23K1/18GK102224886SQ20111014388
公开日2011年10月26日 申请日期2011年5月31日 优先权日2011年5月31日
发明者李素红, 梁萌青, 滕玉清, 郑珂珂 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所