专利名称：一种利用溶解酶脂质体对管道生物膜进行控制的方法
技术领域：
本发明属于水处理领域，涉及饮用管道水生物膜控制技术，具体地说涉及一种新型溶菌酶脂质体的制备方法及该方法制得的溶菌酶脂质体在控制管道生物膜生长中的应用。
背景技术：
饮用水源中的微生物可以在营养成分相对较低的饮用水管网系统中附着生长，形成成熟生物膜。生物膜主要由多聚物、蛋白质、核糖类物质组成，它可以为生物膜紧密附着于载体表面提供“庇护所”，有效地保护了生物膜受到外界的各种伤害。饮用水管道系统中的生物膜，会造成管道的腐蚀，并产生有毒有害的微生物代谢物，产生恶臭气体，造成水质降低。所以，有效剥离生物膜对延长管道系统寿命、提高供水水质、改善热交换效率、减少堵塞方面具有重要意义。控制生物膜的方法包括源头控制、过程控制和后续控制三个方面。源头控制包括控制进水的水质、管道内部状况等方法，过程控制包括管道材质改性和生物控制材料等等。末端控制管道的生物膜控制主要有物理超声、化学氧化剂和非氧化剂灭菌、表面活性剂、生物活性酶等方法。目前，生物膜剥离剂的研究和开发远远落后于其他水处理药剂，尤其是国内很少见具有独立知识产权的新型剥离剂，多数都是引进或改进国外的技术。脂质体(liposomes)是上世纪70年代发展起来，利用脂质体的亲脂功能，运载药物穿透生物膜的胞外聚合物到达生物膜内部，有效杀灭生物膜内微生物并有效剥离生物膜。利用超声-薄层分散法、注射-电泳法、逆向蒸发法、挤压成膜法等可以制备脂质体如中国专利CN1840184研制了一种溶菌酶脂质体制备方法。由溶菌酶，磷脂和亲脂性稳定剂制备而成，通过磷脂和亲脂型稳定剂溶于有机溶剂，完全溶解后加入溶菌酶溶液，再超声分散后减压蒸干制成。该发明的溶菌酶脂质体包封率可达84%以上；形态圆整，粒径均一，杀菌效果显著。
发明内容
针对已有剥离生物膜技术的不足，本发明的目的在于提供一种利用溶解酶脂质体对管道生物膜进行控制的方法，其可为现有饮用水处理工业提供一种新的控制微生物的方法。本发明的发明目的通过如下技术方案实现。一种利用溶解酶脂质体对管道生物膜进行控制的方法，具体步骤如下(1)精密称取1-1. 4g大豆卵磷脂和0. 4-0. 8g胆固醇，溶于5_15mL氯仿和10_20mL 乙醚混合溶剂中，加入6-10mL 2g/L的溶菌酶磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH = 6. 8，过滤去除悬浮物)，上述剂量可以根据需要，进行放大或缩小，水浴超声处理0. 5-aiiin，形成稳定的W/0 型乳化液，生成稳定体系。(2)将装有乳化液的茄形瓶置于旋转蒸发仪上，减压至0. 02-0. 06MI^后，将乳液在30-45°C下蒸发8-1 去除有机溶剂，茄形瓶转速为100-165r/min。
(3)取下茄形瓶，用氮气进行吹脱，去除乳液中存在的难挥发乙醚。继续蒸发 8_16h后，瓶壁形成均勻的脂质膜，加入40-80mL，2g/L PBS(pH = 6. 8)继续旋转6 9h， 茄形瓶壁上膜清洗下来后得淡黄色(呈少许白色)的脂质体混悬液。使用经过PBS(pH = 6. 8)浸泡后的微孔滤膜(粒径为0. 8 μ m)过滤去除大颗粒杂质后置于4°C下继续保存。本发明较好的实施条件是步骤(1)的大豆卵磷脂最佳配料为1. 2g，胆固醇最优配料为0. 6g。步骤(1)的氯仿最佳体积为10mL，乙醚最佳体积为15mL。步骤(1)中加入溶菌酶磷酸盐缓冲液用量为16mg(8mL，2g/L)。步骤(1)中超声时间最佳为lmin。步骤O)中压力最佳减压至0.04MPa，蒸发温度在37.5°C，蒸发时间为12h。茄形瓶转速为135r/min。步骤(3)中蒸发时间最佳为12h。旋转时间为7.证。步骤(3)加入PBS最佳量为60mL。本发明的有益效果是(1)本发明方法所制得的溶菌酶脂质体产品的粒径小，粒径分布均勻，稳定性好， 超声120s后测定超声前后^ta电位变化率小于5%，合成的脂质体具有比较好的均勻分散度。溶菌酶脂质体的平均粒径位于80 IOOnm之间，其形态为比较均勻的球形，粒径分布比较均勻，包封率达到82.6%。参见附图Ia和图Ib所示。(2)溶菌酶脂质体对微生物剥离作用稳定、持久，长时间范围内保持了酶活性。最佳剥离效率从单独使用溶菌酶62. 4%提高到使用溶菌酶脂质体的86. 5%，并通过缓释控制有效抑制微生物的“再恢复”问题。效果见附图加和图2b，脂质体包埋药物技术成为解决管道污染问题的重要途径。溶菌酶作为管道生物膜控制的绿色试剂，具有低毒、高效、广谱等特性，并可应用于饮用水系统中。如今没有利用脂质体包埋溶菌酶进行管道微生物剥离的相关专利和研究。
图Ia为本发明方法制得的溶菌酶脂质体的TEM图像；图Ib为本发明方法制得的溶菌酶脂质体的SEM图像；图加为本发明方法制得的溶菌酶脂质体未使用前的SEM图像；图加为本发明方法制得的溶菌酶脂质体处理生物膜后的SEM图像。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步详细说明，应当理解下面所举的实施例只是为了解释说明本发明，本发明的所有内容并不限于此。实施例1精密称取1. 2g大豆卵磷脂和0. 6g胆固醇，溶于IOmL氯仿和15mL乙醚混合溶剂中，加入6mL 2g/L的溶菌酶磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH = 6. 8，过滤去除悬浮物)，水浴超声处理0. 5min，形成乳化液。将乳化液注入茄形瓶，并置于旋转蒸发仪上，减压至0. 02MI^后， 将乳液在30°C下蒸发他去除有机溶剂，茄形瓶转速为lOOr/min。取下茄形瓶，用氮气进行吹脱，去除乳液中存在的难挥发乙醚。继续蒸发他后，瓶壁形成均勻的脂质膜，加入40mL， 2g/L PBS (pH = 6. 8)继续旋转6 9h，茄形瓶壁上膜清洗下来后得淡黄色(呈少许白色) 的脂质体混悬液。使用经过PBS (pH = 6. 8)浸泡后的微孔滤膜(粒径为0. 8 μ m)过滤去除大颗粒杂质，将制备好的溶菌酶脂质体对模拟管网的微生物膜进行剥离处理。经过检测，制备的溶菌酶脂质体包埋率65. 5 %，形态比较均勻，对生物膜的剥离效率为72.3%。对生物有一定的杀毒效果。实施例2称取Ig大豆卵磷脂和0. 4g胆固醇，溶于5mL氯仿和IOmL乙醚混合溶剂中，加门8mL 2g/L的溶菌酶磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH = 6. 8，过滤去除悬浮物)，水浴超声处理 lmin，形成乳化液。将乳化液注入茄形瓶，并置于旋转蒸发仪上，减压至0. (MMI5a后，将乳液在37.5°C下蒸发1 去除有机溶剂，茄形瓶转速为135r/min。取下茄形瓶，用氮气进行吹脱，去除乳液中存在的难挥发乙醚。继续蒸发1 后，瓶壁形成均勻的脂质膜，加入60mL， 2g/L PBS (pH = 6. 8)继续旋转7.证，茄形瓶壁上膜清洗下来后得淡黄色(呈少许白色)的脂质体混悬液。使用经过PBS (pH = 6. 8)浸泡后的微孔滤膜(粒径为0. 8 μ m)过滤去除大颗粒杂质，将制备好的溶菌酶脂质体对模拟管网的微生物膜进行剥离处理。经过检测，制备的溶菌酶脂质体包埋率82.6%，形态均勻一致，对生物膜的剥离效率为86.5%。对生物有很强的缓释杀毒效果。实施例3称取1. 4g大豆卵磷脂和0. 8g胆固醇，溶于15mL氯仿和20mL乙醚混合溶剂中，加入IOmL 2g/L的溶菌酶磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH = 6. 8，过滤去除悬浮物)，水浴超声处理 2min，形成稳乳化液。将乳化液装入茄形瓶，并置于旋转蒸发仪上，减压至0. 06MI^后，将乳液在45°C下蒸发1 去除有机溶剂，茄形瓶转速为165r/min。取下茄形瓶，用氮气进行吹脱，去除乳液中存在的难挥发乙醚。继续蒸发1 后，瓶壁形成均勻的脂质膜，加入80mL， 2g/L PBS (pH = 6. 8)继续旋转9h，茄形瓶壁上膜清洗下来后得淡黄色(呈少许白色)的脂质体混悬液。使用经过PBS (pH = 6. 8)浸泡后的微孔滤膜(粒径为0. 8 μ m)过滤去除大颗粒杂质，将制备好的溶菌酶脂质体对模拟管网的微生物膜进行剥离处理。经过检测，制备的溶菌酶脂质体包埋率78. 1%，形态均勻，对生物膜的剥离效率为 76.3%。对生物有一定的缓释杀毒效果。
权利要求
1.一种利用溶解酶脂质体对管道生物膜进行控制的方法，步骤如下(1)将大豆卵磷脂和胆固醇溶于氯仿和乙醚混合溶剂中，加入溶菌酶磷酸盐缓冲溶液， 过滤去除悬浮物，水浴超声处理，形成稳定的W/0型乳化液，生成稳定体系；(2)将装有乳化液的茄形瓶置于旋转蒸发仪上，减压后将乳液蒸发，去除有机溶剂；(3)取下茄形瓶，用氮气进行吹脱，去除乳液中的乙醚，继续蒸发8-1 后，瓶壁形成均勻的脂质膜，加入溶菌酶磷酸盐缓冲溶液，继续旋转，茄形瓶壁上膜清洗下来后得淡黄色或呈少许白色的脂质体混悬液；(4)使用经过溶菌酶磷酸盐缓冲溶液浸泡后的微孔滤膜过滤去除大颗粒杂质，并置于 4°C下保存，将制备好的溶菌酶脂质体对模拟管网的微生物膜进行剥离处理。
2.根据权利要求1所述的一种利用溶解酶脂质体对管道生物膜进行控制的方法，其特征在于所述大豆卵磷脂为1-1. 4g，胆固醇为0. 4-0. 8g，氯仿为5-15mL，乙醚为10_20mL，加入的溶菌酶磷酸盐缓冲溶液为6-10mL，浓度为2g/L，pH = 6. 8，上述剂量根据需要按倍数放大或缩小。
3.根据权利要求1所述的一种利用溶解酶脂质体对管道生物膜进行控制的方法，其特征在于所述步骤(1)中水浴超声处理的时间为0. 5-aiiin。
4.根据权利要求1所述的一种利用溶解酶脂质体对管道生物膜进行控制的方法，其特征在于所述步骤O)中减压至0. 02-0. 06MPa，蒸发温度为30_45°C，蒸发时间为8_16h，茄形瓶转速为100-165r/min。
5.根据权利要求1所述的一种利用溶解酶脂质体对管道生物膜进行控制的方法，其特征在于所述⑶步骤中加入的溶菌酶磷酸盐缓冲溶液为40-80mL、浓度为2g/L、pH = 6. 8， 旋转时间为6 9h。
6.根据权利要求1所述的一种利用溶解酶脂质体对管道生物膜进行控制的方法，其特征在于所述步骤中的微孔滤膜粒径为0. 8 μ m。
全文摘要
本发明涉及一种新型利用溶菌酶脂质体对饮用水管道生物膜控制方法，就是通过逆向旋转蒸发法制备溶菌酶脂质体，用这种新型的溶菌酶脂质体剥离管道生物膜，该方法具有高包埋率和生物剥离效率，并有缓释杀毒作用。为管道生物膜控制提供了应用前景。
文档编号A01N61/00GK102363534SQ20111016629
公开日2012年2月29日 申请日期2011年6月20日 优先权日2011年6月20日
发明者于永胜, 俞冲, 王海峰, 郁建华 申请人:上海明诺环境科技有限公司