专利名称：两株裂解性哈维弧菌噬菌体制剂的制备及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及两株噬菌体及其应用，减少水产养殖系统及产品加工过程中细菌方法。具体而言，本发明提供用于控制刺参、刺参养殖系统(如养殖池、饲料等)及刺参食品加工中的病原菌，尤其可以显著的杀灭哈维弧菌(Vibrio harveyi)，属于生物工程领域。
背景技术：
但随着消毒剂和抗生素长期不当使用，许多弊端突显出来(1)使病原菌产生耐药性，以致抗生素作用效果下降，甚至无效；(2)造成水体严重污染，并引发水环境微生态失衡；C3)在刺参体内产生药物残留，影响产品的质量安全，并危害人体健康。由此可见，传统的抗生素药物不但疗效甚微，而且会产生药物残留，污染水体环境，并引起严重的食品安全问题。因此，积极寻求一种安全有效的新型抗菌制剂用于刺参病害防治乃当务之急。噬菌体(Bacteriophage)作为一类细菌性病毒，是能侵染且最终杀死细菌的病毒，可分为裂解性噬菌体(Lytic Bacteriophage)和溶原性噬菌体(Lysogenic Bacteriophage)。裂解性噬菌体又叫毒性噬菌体，感染细菌后可在菌体内快速增殖最终致使细菌裂解。自20世纪初噬菌体治疗就已应用于临床，治疗的疾病包括化脓性伤口感染、胃肠炎、骨髓炎、皮炎及肺炎等，能够裂解的病原菌涉及到金黄色葡萄球菌(Maphylococus aureus)、链球菌(Str 印 tococcus)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、弧菌(Vibrio)、变形杆 |if (Proteusbaci 1 Ius vulgaris) > fll^jix-^·Ifi lif (Pseudomonas aeruginosa) > fl 1 |if (Salmonella)等。噬菌体治疗的给药方式有皮下注射、口服、局部及全身用药。噬菌体抗菌技术和产品应用的巨大突破，开启了应用绿色、安全、无公害生物防治手段有效保障食品安全的先河。
发明内容
本发明针对目前人们在刺参养殖中大量使用抗生素加速耐药性菌株的产生，同时促进了耐药性菌株的进化，提供一种新的能够特异性杀灭刺参体内的主要病原菌哈维弧菌 (Vibrio harveyi)，从而起到对养殖环境及产品加工过程的保护，确保食品的安全健康。本发明的技术方案如下从废水中分离得到对哈维弧菌(Vibrio harveyi)有裂解作用的两株噬菌体vp_l 和vp-2，制剂制备方法如下(1)宿主菌的准备从刺参分离出致病性哈维弧菌。(2)水样及其处理将废水加入CaCl2、MgCl2对水样做预处理。(3)噬菌体分离将上述经过预处理的水样，用离心，收集上清；将上清过滤除去菌体、杂质等其他成分，得噬菌体原液。(4)采用双层平板法进行噬菌体的鉴定在平板上形成空斑，则说明在滤液内有针对该宿主菌有裂解性的噬菌体存在。
(5)噬菌斑的纯化当噬菌斑的形态、大小、完全一致时，即得到纯化了的噬菌体， 将该噬菌体保存，即为哈维弧菌噬菌体vp-1和vp-2。(6)噬菌体的液体增殖离心过膜获得高效价的噬菌体上清液。(7)通过聚乙二醇8000沉淀噬菌体颗粒，溶解于SM缓冲液中，即获得噬菌体vp-1 和vp-2的混合制剂。在本发明中两株哈维弧菌噬菌体vp-1和vp-2，是能特异性裂解从患病刺参体表分离得到的哈维弧菌(Vibrio harveyi), vp_l和vp_2具有呈正多面体头部结构和不可收缩的尾部，头部直径约为50nm，vp-l尾部长约150nm，vp-2尾部长约为200nm。两株噬菌体均属于长尾噬菌体。为一种用于减少动物体内、水产养殖环境中以及动物加工食品靶病原菌数量的方法。两株噬菌体在37°C中放置20min，其活性稳定；对氯仿不敏感，在90°C以上失活， 两株噬菌体在PH 8.0左右稳定，噬菌体通常纯化后保存在含10%的二甲基亚砜的SM溶液中。上述两株噬菌体的应用，将噬菌体纯化和扩增培养后，用于抑制哈维弧菌的生长， 减少了抗药性菌株的残留，最终降解产物为细菌碎片，无任何毒副作用。烈性噬菌体净化作用的范围以及技术净化范围包括水体中病原菌灭活，水产动物表面病原菌灭活，运输车辆表面病原菌灭活，人体表面病原菌灭活，食品加工过程中病原菌灭活。用于抑制哈维弧菌是指将纯化的两株噬菌体用缓冲液稀释后制成喷洒液或淋洗液，用于对水产养殖环境或刺参加工食品的喷洒或浸泡，来防治哈维弧菌的感染。本发明与传统的抗生素相比，噬菌体治疗的突出特点是(1)专一性裂解目标病原微生物，不破坏水环境中的正常菌群。传统的抗生素治疗在杀灭致病菌的同时，也破坏了水体中正常的浮游微生物，引起微生态失衡，并导致机会性感染；(2)噬菌体是宿主依赖性的，只在细菌感染部位发生作用，随着宿主菌的清除而消亡，不会残留在动物体内；(3)噬菌体能够自我复制增殖，且其感染发生在水溶液状态中；(4)安全无毒副作用，噬菌体由蛋白质和核酸组成，降解后的终产物是氨基酸和核酸片段，对人和动物安全。
图1是纯化后噬菌斑图。图2是投射电镜观察的vp-1和vp-2噬菌体的形态结构图。图3是在平皿上形成的抑菌圈噬图。图3中为滴加10 μ 1噬菌体滤液，菌体效价为1 X 109pfu/ml。图4是两株噬菌体混合制剂vp-1和vp-2，在MOI为10时噬菌体的抑菌效果图。邏一阴性对照 —噬菌体组(Μ0Ι = 1)A—^^那霉素组.空白对照
具体实施例方式实施例1、噬菌体的分离制备(1)宿主菌的准备将上述经过鉴定并接种于2216E固体培养基中的保存于4°C冰箱中备用的哈维弧菌取出，37°C过夜培养，挑取单个菌落，接种于2216E液体培养基中，37°C振荡培养他后，用来分离噬菌体之用。(2)水样及其处理取废水50ml，对水样做预处理加入CaCl2、MgCl2,使其终浓度为lmmol/L，作用大约lOmin，目的是使噬菌体更易吸附于致病菌表面。(3)噬菌体分离将上述经过预处理的水样，用离心机离心，lOOOOrpm，离心5min，收集上清；将上清过0. 22 μ m的一次性滤膜过滤，除去菌体、杂质等其他成分，即得噬菌体原液；取IOml滤液加入处于对数生长期(接种后证左右，噬菌体终浓度达到106-107PFU/ml时即为是对数生长期)的50ml菌液中，37°C过夜培养12_18h，目的是使噬菌体数量扩增，观察现象并记录；收集菌液，lOOOOrpm,离心5min，再次收集上清，再过膜(0. 22 μ m)，即得增值后的噬菌体悬浮液。(4)噬菌体的鉴定方法采用双层平板法进行噬菌体的鉴定下层倒入含1.5%琼脂的2216E固体培养基，置于4°C备用，使用前置于37°C，约 30min ；上层培养基含琼脂0.7%，将上层培养基加热溶解，放置于50 V的水浴锅中待用，取 8支IOml离心管，分别加Iml宿主菌菌液，吸取噬菌体悬浮液进行梯度稀释至10_6将7不同浓度梯度的噬菌体稀释液分别取出10μ 1，加到IOml离心管中，设置一个对照组，仅加入 Iml宿主菌菌液和10 μ 1 2216Ε培养基，在37°C下，相互作用lOmin，加入7ml含0. 7%琼脂的2216E培养基充分混勻后，立刻加到上层，待凝固后，倒置培养24h后观察有无噬菌斑形成。如果在平板上形成空斑则说明在滤液内有针对该宿主菌有裂解性的噬菌体存在，从稀释液浓度为1 X 10_6PFU/ml的噬菌体悬液中分离出的噬菌斑中发现两种噬菌体vp-l、vp-2。 (见图1)。(5)噬菌斑的纯化噬菌体的纯化因为初次分离噬菌斑的大小、形状不一致，所以应该对分离的噬菌体进行进一步的纯化，以使噬菌体在平板上形成大小及形状一致的噬菌斑。用灭过菌的20 μ 1枪头挑取形态大小有明显差异的噬菌斑各一个，将其分别加入到Iml无菌PBS的离心管中，涡旋震荡lmin，放于4°C，4h，使噬菌体充分释放入PBS (磷酸缓冲溶液)中；之后lOOOOrpm，离心5min，收集上清，过膜(0. 22 μ m)，将过膜后的噬菌体液进行浓度梯度稀释(方法同上)，双层培养，重复3次上述操作，直至出现的噬菌斑形态、大小、完全一致为止，即得到纯化了的噬菌体(见图2)。(6)噬菌体的液体增殖纯化后的噬菌体的效价一般都不高，需要进行进一步的增殖，采用液体增殖法进行增殖。具体的方法如下将噬菌体液按一定比例加入到培养1 的宿主菌液中，再于37°C摇床中培养12h，将混合液IOOOOrpm离心5min，去处细菌碎片，上清液用0. 22 μ m的滤器过滤，即可获得效价较高的噬菌体液。(7)增殖后效价的测定将上述双层培养得到的噬菌斑计数，从而计算噬菌体效价。噬菌体效价(PFU/ml)=噬菌斑X稀释倍数X取样量折算数(8)氯仿敏感性测试为了检验纯化得到的噬菌体是否对氯仿敏感(即检测噬菌体衣壳是否含有脂类的一种方法)，取备用的噬菌体悬浮液Iml (约1 X 108PFU/ml)与100 μ 1氯仿溶液混合后，剧烈摇晃lmin，然后与4°C下静置约30min;直至出现分层，其中上层为水相，下层为氯仿相， 取出100 μ 1上层水相部分(即噬菌体悬浮液)，梯度稀释后取20 μ 1滴定于长有宿主细胞细菌的平板上，翌日进行观察，看是否有噬菌斑出现，如果有噬菌斑出现，说明该噬菌体的活性并不受氯仿影响，即说明该噬菌体的衣壳内不含脂类物质。同时计算氯仿处理前后的噬菌体效价，看效价有无减少。结果测定结果显示处理前后噬菌体效价不发生任何变化，表明噬菌体对氯仿不敏感，噬菌体的衣壳不含脂类物质。实施例2、PEG 8000沉淀噬菌体颗粒(1)取过夜培养的宿主菌液20mL，接到IL液体2216E中，37°C振荡培养至对数生长初期，约为12h;(2)加入噬菌体液，使感染复数(感染噬菌体的数量与宿主菌数量的比值)约为 0. 01，37°C继续振荡培养Mh，转数为150rpm ；(3)将上述混合液于4°C IOOOOrpm离心lOmin，以除去细菌碎片，然后量取上清液， 在其中加入DNase I和RNaseA至终浓度为1 μ g/mL,室温温育30min ；(4)按500ml培养物加入29. 2g固体NaCl，搅拌使其溶解，然后将培养物冰浴lh， 加NaCl后可促使细菌碎片和杂蛋白沉降，也是噬菌体颗粒有效沉淀所必需的；(5) 4°C，IOOOOrpm离心IOmin以去除细胞碎片，收集上清；(6)测定所收集上清液的总体积，然后按照500mL上清加50g的比例加入固体 PEG8000，于室温用玻璃棒慢慢搅拌溶解，然后冰浴12hoUrs以使噬菌体颗粒发生沉淀；(7) 40C，IOOOOrpm离心IOmin回收沉淀的噬菌体颗粒，弃上清，将离心管倒置5分钟，使残余液体流干，用移液器除去残余液体；(8)用2mL的SM保存液重悬噬菌体沉淀，亲和层析法去除内毒素，放于4°C保存。(9)纯化后的噬菌体颗粒溶解在添加10%二甲基亚砜的SM缓冲液中结果除去培养基成分和细菌碎片，最终收集噬菌体颗粒沉淀，对噬菌体的进一步的纯化应用做准备。实施例3、体外抑菌实验实验设置为4个组，取4个50ml离心管，分别标记为A、B、C、D ；其中A为阴性对照组，B为抗生素组，C为噬菌体组。A中加入40ml 2216E液体培养基、Iml菌液(浓度为 108PFU/ml)、Iml PBS ；B 中加入 40ml 2216E 液体培养基、Iml 菌液(浓度为 108PFU/ml)、Iml 硫酸卡那霉素(浓度为％ig/ml) ；C中同样加入40ml 2216E液体培养基、Iml菌液、Iml噬菌体悬液，分别是500 μ 1 νρ-l和500 μ 1 νρ-2,效价为1 X 108pfu/ml ；D为空白对照，只加入
640ml 2216E培养基。振荡IOmin后，放入酶标仪中测OD6tltl的值，记录；放入37°C摇床中培养，每半小时拿出来测一次OD6tltl的值，并做好记录。以OD6tltl的值为纵坐标，时间为横坐标做曲线(见图4)。实施例4、毒力实验6周龄雌性BALB/c小鼠，27g左右，共30只，购自大连医科大学实验动物中心。随机分为两组，各15只，每只每天口服vp-1和vp-2混合噬菌体制剂0. lml(效价为109pfu/ ml)，对照组口服等量的SM缓冲液，连续口服14d，脱颈致死，观察内脏，消化道及粘膜变化情况。结果显示，此剂量的噬菌体混合制剂对小鼠的日常行为没有影响，解剖无任何异
堂
巾ο实施例5、刺参体内保护实验实验设4组，每组设3个平行。每组10头养殖仿刺参。分别标记为1、2、3、4、5。 试验组采用浸浴法攻毒，向编号不同的盆中分别注入不同体积的菌悬液，使其终浓度分别 (1组、2组、3组和5组分别加入菌液，是最终浓度为107CFU/mL，4组为对照组，对照组中加入与等体积过滤灭菌海水)，攻读池后，1组加入两株混合噬菌体vp-1和vp-2是最终MOI =0. 1，2组加入vp-1和vp-2的混合噬菌体是最终感染复数MOI = 1，3组加入混合vp-1 和vp-2使最终MOI = 10，每天观察各盆中仿刺参的发病及死亡状况。结果见表1，随着噬菌体的浓度增加，保护率逐渐增加。表1噬菌体vp-1和vp-2治疗的实验结果
权利要求
1.两株裂解性哈维弧菌噬菌体制剂的制备，从废水中分离得到对哈维弧菌有裂解作用的两株噬菌体VP-I和vp-2，其特征在于如下步骤(1)宿主菌的准备从刺参分离出致病性哈维弧菌；(2)水样及其处理将废水加入CaCl2、MgCl2对水样做预处理；(3)噬菌体分离将上述经过预处理的水样，离心，收集上清；将上清过滤除去菌体和杂质，得噬菌体原液；(4)采用双层平板法进行噬菌体的鉴定在平板上形成空斑，则说明在滤液内有针对该宿主菌有裂解性的噬菌体存在；(5)噬菌斑的纯化当噬菌斑的形态、大小、完全一致时，即得到纯化了的噬菌体，将该噬菌体保存，即为哈维弧菌噬菌体vp-1和vp-2 ；(6)噬菌体的液体增殖离心过膜，获得高效价的噬菌体上清液；(7)通过聚乙二醇8000沉淀噬菌体颗粒，溶解于SM缓冲液中，亲和层析柱去除残留的内毒素，即获得噬菌体vp-1和vp-2的混合制剂。
2.权利要求1所述噬菌体菌株的应用，其特征在于将哈维弧菌噬菌体纯化和扩增后， 用于抑制哈维弧菌的生长。
全文摘要
本发明涉及制备两株裂解性噬菌体制剂及其应用，用于减少刺参体内、刺参养殖环境以及刺参加工品中靶病原菌数量，噬菌体的宿主菌为哈维弧菌，分离得到的两株噬菌体vp-1和vp-2对哈维弧菌有较强的裂解性，对刺参及产品起到保护作用，一种新型绿色生物消毒制剂。将噬菌体纯化，扩增培养以及进一步大规模富集。由于采用裂解性噬菌体特异性的杀灭具有抗药性的哈维弧菌，防治由于抗生素滥用而导致的抗药性以及抗生素在动物体内残留等问题。本发明可以配置成喷洒液或者淋洗液对患病刺参、养殖水体环境起到净化和保护作用，本发明没有任何毒副作用，减少食源性污染，为食品安全起到保障作用。
文档编号A01K61/00GK102356817SQ201110193109
公开日2012年2月22日 申请日期2011年7月11日 优先权日2011年7月11日
发明者孙涛, 徐永平, 李晓宇, 杨冉升, 谭德猛, 赵鹏飞, 郭嘉楠, 金礼吉 申请人:大连理工大学