专利名称：一种抗烟草青枯病的枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种抗烟草青枯病的菌剂，具体地说是一种抗烟草青枯病的枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法，属于生物菌剂领域。
背景技术：
烟草青枯病是一种细菌病害，在各烟区普遍发生，常常暴发流行，造成毁灭性损失。该病病源青枯雷尔氏菌和青枯假单胞杆菌，能侵染30余科的200多种植物。对烟草、 番茄、花生及马铃薯侵害更明显。常与黑胫病等根茎病害混合发生，危害更严重。枯草芽孢杆菌(feciBm subtiHs)广泛存在于自然界中，该菌作为植物病害生物防治细菌之一，由于该菌能产生耐热的芽孢，即易于生产、菌剂的加工，又易于存活、定植和繁殖。批量生产工艺简单，成本也较低，施用方便，储存期长，而且其菌剂的稳定性与化学农药的相容性、以及与不同植物不同年份防治效果的一致性方面均优于不产生芽孢的细菌和真菌，是一种较理想的生防微生物。
发明内容
本发明的目的在于，提供了一种对烟草青枯病害具有高效、无毒、安全以及对环境无污染的微生物枯草芽孢菌剂的制备方法。在芽孢杆菌发酵后期，通过合理调节发酵生产参数的控制、添加调配功能性的有机氮源，促使芽孢杆菌在后期代谢性生长，产生碱性蛋白的代谢，再通过调整发酵工艺控制参数，促使菌体形成芽孢，当菌体芽孢形成率达到阳 65%以上时，不再做发酵液pH的调整，让其自然变化，当发酵液菌体形成芽孢率在85%以上，最终发酵液pH值自然提高至 7. 7 8.0时，发酵结束。本发明的技术方案
一种抗烟草青枯病的枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法，包括以下步骤
1、菌种活化对保藏的枯草芽孢杆菌进行活化培养至芽孢脱落；
活化所用的培养基配方为牛肉胨3g，蛋白胨5g，琼脂16g，水定容至IOOOml ；用于枯草芽孢杆菌的活化及活菌数的测定；
2、摇床扩大培养将活化后的枯草芽孢杆菌接种到液体培养基中进行摇床扩大培养。 初始PH值为7. 0 7. 2，培养温度为30°C，摇床转速为200rpm，至15 20%的芽孢脱落为止；
所用的液体培养基的配方为玉米粉6. 5g，葡萄糖2. 5g，豆饼粉10. Ig,鱼粉2. 5g， CaCO3 3. 5g, (NH4)2SO4 0. 5g, K2HPO4 0. 15g, MgSO4 · 7H20 0. lg, MnSO4 · H2O 0. lg，水定容至 500ml。3、种子罐扩大培养在无菌操作下，将摇床扩大培养得到的菌液接入到含有种子罐培养基的种子罐内，初期通风比1 0. 25，即一立方发酵液一分钟通气量为0.25立方， 后期通风比1 1 ；同时，控制发酵液的PH值为6. 9 7. 3，温度为32°C，发酵罐的搅拌转速为80 220 rpm ；至芽孢杆菌进入对数生长期的后期；
及时进行对种子发酵液的检查和对芽孢杆菌生长状况的观测；菌种接种后1 菌体生长处于指数生长中期；当芽孢杆菌进入对数生长期的后期，进行无菌转种接入发酵罐，进行发酵；
所用的种子罐培养基配方为玉米粉12. 98g，葡萄糖5g，豆饼粉20. lg，鱼粉5g，CaCO3 6. 90g, (NH4)2SO4 lg, K2HPO4 0. 3g, MgSO4 · 7H20 0. 2g, MnSO4 · H2O 0. 2g，水定容至 1000ml。4、发酵罐发酵
将培养至指数生长期后期的种子罐菌液在无菌条件下转入装有发酵罐培养基的发酵罐，罐装量为发酵罐容积的70%，进行发酵罐的前期培养和后期培养；
(1)发酵罐前期培养方法为对接入种子液的发酵罐，温度观 32°C，pH6.9 7. 3，通风量1 0. 25 1. 1，搅拌转速150 180 rpm ；保持发酵液总糖含量0. 35 0. 6%、总氮含量30 45ng/ml，培养至芽孢形成率55 65%，进入发酵后期；
发酵罐前期培养期间要及时检查和观测菌种生长状况，随着菌种的增长，菌体密度的增加，逐渐加大通风量，增加溶氧，提高转速，以配合菌种生长的需氧量，同时，通过与发酵罐相连的无菌补液罐来维持发酵液PH值；
(2)发酵罐后期培养方法为不再调节发酵液pH值，使用有机氮源调节发酵液的总氮含量，控制总氮含量在40ng/ml以上，培养至芽孢形成率80%以上、pH值7. 7以上，后期发酵结束；
所述的发酵罐培养基的配方为玉米粉12. 98g，葡萄糖5g，豆饼粉20. Ig,鱼粉5g， CaCO3 6. 90g, (NH4)2SO4 lg, K2HPO4 0. 3g, MgSO4 · 7H20 0. 2g, MnSO4 · H2O 0. 2g，水定容至 1000ml ；
所述的有机氮源的制备方法为将花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、酵母粉、蚕蛹粉、鱼粉按照重量比为1 :1:1:1:1: 1的比例混合，调制成重量分数为9% 16%的混合溶液，加入到反应釜内；然后在反应釜内通过流加质量分数为6 10%的盐酸控制溶液的 PH为6. 0，来进行消化水解，同时保持温度120°C、压力0. IMPa，水解25分钟，提取水解液； 向水解液中加入重量分数为15%的玉米浆和重量比为1 :1:1:1: 1的缬氨酸、L-色氨酸、色氨酸、硫氨基酸组成的混合氨基酸溶液，配成固形物含量为重量分数16% 18%的有机氮源，比例为水解液、玉米浆和混合氨基酸溶液的混合质量比为1 1 1。5、菌剂的制备
发酵结束后，降低发酵通风比至1 0.08，维持发酵罐压力0.02MPa，降低搅拌转速至 20rpm，对发酵液降温至10°C以下；
通过膜过滤浓缩处理，将发酵液体积浓缩至原来的1/5 1/8。添加浓缩液体积量的 0. 07%调配缓冲保护剂(磷酸二氢钠与磷酸氢二钠混合而成的pH8. 0的溶液)，混合均勻后， 对浓缩后的发酵液进行喷雾干燥处理，得到菌剂产品。所述的喷雾干燥方法为对干燥塔、旋风分离器进行30分钟的120°C的热风灭菌， 然后降低热风温度至80°C，依次开启引风机、鼓风机、加热器、进料泵、闭风器，调整物料流量至150 180Kg/h、通风量至5000 8000m3/h，开启隔膜泵泵入调配好的发酵液，进行产品的喷雾干燥，得到成品菌剂，菌粉质量指标为水分小于3. 5%，每克菌数大于2000亿，菌体芽孢形成率大于85% ；芽孢大量出现的时间均在发酵菌的对数生长期和以后的一段时间，在偏碱环境中有利于芽孢的形成。发酵过程分的四个生长时期一延迟期、对数生长期、发酵前期和发酵后期；延迟期约为2 3h，发酵9小时进入对数生长时期，菌体生长非常的迅速，菌体数量增长很快，发酵13小时有10%的芽孢形成。在不调节pH值得情况下，在发酵的前11个小时 PH值一直在下降，从7. 2下降至6. 0 ；发酵13小时后，菌种开始逐渐分泌碱性蛋白抗生素， PH开始逐渐上升，最终达到7. 7以上。在这过程中，通过后期补加有机氮源，使得菌体形成代谢性生长，碱性蛋白抗生素提高了 30ng/ml以上，同时利于芽孢的正常生成，最终获得一种高效抗烟草青枯病的枯草芽孢菌剂。与现有的方法相比本发明方法的优势是除了得到形成芽孢的休眠菌体，还得到提高了 30ng/ml以上的碱性蛋白抗生素，同时，提高了菌体芽孢形成率达85%以上。本发明菌剂的使用方法和使用量如下
1、制成菌体浓度约2000万个/ mL的菌液，约为一克菌粉配制成1升菌液。2、对田间发病烟草根部位、外表面均勻喷施抗菌菌液；或者烟苗移植过程中，对烟苗根部喷施，菌体浓度约2000万个/ mL,喷施量5ml/株，这样用量更少，效果更好。3、每亩烟草使用量650克左右。本发明菌剂的防病、治疗效果如下 一、防治效果
1、烟苗移种根部处理
(1)对移种烟苗根部处理，生长三周后，烟苗病发现象为0. 09%。(2)未作处理烟苗发病率7. 1%。2、移苗前，没做喷施处理，移苗后，对田间烟草喷施处理和未作喷施处理对比 (1)对田间烟草喷做施处理，烟草发病率为0.36%。(2)未作处理烟苗发病率7. 1%。从以上结果可以看出对田间烟草喷未做喷施处理的发病率是做过喷施处理的20 倍左右，该菌剂防治效果良好。二、治疗效果
发病烟草菌剂喷施处理对出现的发病病株，进行菌体浓度约3000万个/ mL的菌液对发病菌株的根部、病株表面喷施，喷施量每株50ml左右；空白对照对发病菌株仅仅喷施水。结果对于喷施水的烟叶，3天后，枯萎率达49%，6天后94%枯萎。经菌液处理的病株，在3天后，91 %的病株发病状况得到初步控制，6天后87%发病株得到好转，随后继续生长，表现出了较好的治疗效果。说明经过本发明的菌液处理后，能有较好治疗效果，减少烟农的损失。本发明的优点在于在菌体发酵的这过程中，通过后期补加有机氮源，使得菌体形成代谢性生长，提高碱性蛋白抗生素的产生，同时利于芽孢的正常生成，最终获得一种高效抗烟草青枯病的枯草芽孢菌剂。
具体实施例方式以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为重量百分数。实施例1
一种抗烟草青枯病的枯草芽孢杆菌菌剂，其制备方法包括以下步骤
1、菌种活化对从市场上购买的斜面保藏的枯草芽孢杆菌B908活化培养至芽孢脱落；
活化培养基(NA)配方为牛肉胨3g，蛋白胨5g，琼脂16g，水定容至IOOOml ；
2、摇床扩大培养将活化后的枯草芽孢杆菌接种到液体培养基中进行摇床扩大培养， 初始PH值为7. 0，培养温度为30°C，摇床转速为200rpm，至15%的芽孢脱落为止；
所用的液体培养基的配方为玉米粉6. 5g，葡萄糖2. 5g，豆饼粉10. Ig,鱼粉2. 5g， CaCO3 3. 5g, (NH4)2SO4 0. 5g, K2HPO4 0. 15g, MgSO4 · 7H20 0. lg, MnSO4 · H2O 0. lg，水定容至 500ml ；
3、种子罐扩大培养在无菌操作下，将摇床扩大培养后得到的菌液接入到含有种子罐培养基的种子罐内，初期通风比量1 0. 25，后期通风比1 1 ；同时，控制发酵液的pH值为6. 9，温度为32°C，发酵罐的搅拌转速为SOrpm ；至芽孢杆菌进入对数生长期的后期；
所用的种子罐培养基配方为玉米粉12. 98g，葡萄糖5g，豆饼粉20. lg，鱼粉5g，CaCO3 6. 90g, (NH4)2SO4 lg, K2HPO4 0. 3g, MgSO4 · 7H20 0. 2g, MnSO4 · H2O 0. 2g，水定容至 1000ml ；
4、发酵罐发酵
将培养至指数生长期后期的种子罐菌液在无菌条件下转入装有发酵罐培养基的发酵罐，罐装量为发酵罐容积的70%，进行发酵罐的前期培养和后期培养；
(1)发酵罐前期培养对接入种子液的发酵罐，温度^°C，pH6.9，通风量1 0. 25，搅拌转速150rpm ；保持发酵液总糖含量0. 35%、总氮含量30ng/ml，培养至芽孢形成率55%，进入发酵后期；
(2)发酵后期培养不再调节发酵液pH值，使用有机氮源补充发酵液的总氮含量，控制总氮含量在40ng/ml以上，培养至综合芽孢形成率80%以上，pH值7. 7以上，发酵结束；
所述的发酵罐培养基的配方为玉米粉12. 98g，葡萄糖5g，豆饼粉20. Ig,鱼粉5g， CaCO3 6. 90g, (NH4)2SO4 lg, K2HPO4 0. 3g, MgSO4 · 7H20 0. 2g, MnSO4 · H2O 0. 2g，水定容至 1000ml ；
所述的有机氮源的制备方法为将等质量的花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、酵母粉、蚕蛹粉、鱼粉混合，调制成重量分数为9% 16%的混合溶液，加入到反应釜内；然后在反应釜内通过流加质量分数为6 10%的盐酸控制溶液的pH为6. 0，来进行消化水解，同时保持温度120°C、压力0. IMPa，水解25分钟，提取水解液；向水解液中加入重量分数为15%的玉米浆和等质量的缬氨酸、L-色氨酸、色氨酸、硫氨基酸组成的混合氨基酸溶液，配成固形物含量为重量分数16% 18%的有机氮源，比例为水解液、玉米浆和混合氨基酸溶液的混合质量比为1 1 1 ；
5、菌剂的制备
发酵结束后，降低发酵通风比至1 0.08，维持发酵罐正压0.02MPa，降低搅拌转速至 20rpm，对发酵液降温至至10°C以下；
通过膜过滤浓缩处理，将发酵液体积浓缩至原来的1/5。添加浓缩液体积量的0. 07%调配缓冲保护剂(即磷酸二氢钠与磷酸氢二钠配成的PH8. 0的混合溶液)混合均勻后，对浓缩后的发行喷雾干燥处理；所述的喷雾干燥方法为对干燥塔、旋风分离器进行30分钟的120°C的热风灭菌，然后降低热风温度至80°C，依次开启引风机、鼓风机、加热器、进料泵、闭风器，调整物料流量 150Kg/小时、通风量5000m3/小时，开启隔膜泵泵入调配好的发酵液，进行产品的喷雾干燥， 得到成品菌剂。
实施例2
一种抗烟草青枯病的枯草芽孢杆菌菌剂，其制备方法包括以下步骤
1、菌种活化对从市场上购买的斜面保藏的枯草芽孢杆菌B908活化培养至芽孢脱落；
活化培养基(NA)配方为牛肉胨3g，蛋白胨5g，琼脂16g，水定容至IOOOml ；
2、摇床扩大培养将活化后的枯草芽孢杆菌接种到液体培养基中进行摇床扩大培养， 初始PH值为7. 1，培养温度为30°C，摇床转速为200rpm，至18%的芽孢脱落为止；
所用的液体培养基的配方为玉米粉6. 5g，葡萄糖2. 5g，豆饼粉10. Ig,鱼粉2. 5g， CaCO3 3. 5g, (NH4)2SO4 0. 5g, K2HPO4 0. 15g, MgSO4 · 7H20 0. lg, MnSO4 · H2O 0. lg，水定容至 500ml ；
3、种子罐扩大培养在无菌操作下，将摇床扩大培养后的菌液接入到含有种子罐培养基的种子罐内，初期通风比量1 0. 25，后期通风比1 1 ；同时，控制发酵液的pH值为 7. 1，温度为32°C，发酵罐的搅拌转速为150 rpm ；至芽孢杆菌进入对数生长期的后期；
所用的种子罐培养基配方为玉米粉12. 98g，葡萄糖5g，豆饼粉20. lg，鱼粉5g，CaCO3 6. 90g, (NH4)2SO4 lg, K2HPO4 0. 3g, MgSO4 · 7H20 0. 2g, MnSO4 · H2O 0. 2g，水定容至 1000ml ；
4、发酵罐发酵
将培养至指数生长期后期的种子罐菌液在无菌条件下转入装有发酵罐培养基的发酵罐，罐装量为发酵罐容积的70%，进行发酵罐的前期培养和后期培养；
(1)发酵罐前期培养对接入种子液的发酵罐，温度30°C，pH7.1，通风量1 0.7，搅拌转速165 rpm ；保持发酵液总糖含量0. 5%、总氮含量38ng/ml，培养至芽孢形成率60%，进入发酵后期；
(2)发酵后期培养不再调节发酵液pH值，使用有机氮源补充发酵液的总氮含量，控制总氮含量在40ng/ml以上，培养至综合芽孢形成率80%以上，pH值7. 7以上，发酵结束；
所述的发酵罐培养基的配方为玉米粉12. 98g，葡萄糖5g，豆饼粉20. Ig,鱼粉5g， CaCO3 6. 90g, (NH4)2SO4 lg, K2HPO4 0. 3g, MgSO4 · 7H20 0. 2g, MnSO4 · H2O 0. 2g，水定容至 1000ml ；
所述的有机氮源的制备方法为将等质量的花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、酵母粉、蚕蛹粉、鱼粉混合，调制成重量分数为13%的混合溶液，加入到反应釜内；然后在反应釜内通过流加质量分数为8%的盐酸控制溶液的pH为6. 0，来进行消化水解，同时保持温度120°C、 压力0. IMPa，水解25分钟，提取水解液；向水解液中加入重量分数为15%的玉米浆和由等质量的缬氨酸、L-色氨酸、色氨酸、硫氨基酸组成的混合氨基酸溶液，配成固形物含量为重量分数17%的有机氮源，比例为水解液、玉米浆和混合氨基酸溶液的混合质量比为1 1 1 ；
5、菌剂的制备
发酵结束后，降低发酵通风比至1 0. 08，维持发酵罐正压0. 02MPa,降低搅拌转速至 20rpm，对发酵液降温至至10°C以下；通过膜过滤浓缩处理，将发酵液体积浓缩至原来的1/6。添加浓缩液体积量的0. 07%调配缓冲保护剂(即磷酸二氢钠与磷酸氢二钠配成的PH8. 0的混合溶液)混合均勻后，对浓缩后的发行喷雾干燥处理；
所述的喷雾干燥方法为对干燥塔、旋风分离器进行30分钟的120°C的热风灭菌，然后降低热风温度至80°C，依次开启引风机、鼓风机、加热器、进料泵、闭风器，调整物料流量 16^(g/小时、通风量6500m3/小时，开启隔膜泵泵入调配好的发酵液，进行产品的喷雾干燥， 得到成品菌剂。
实施例3
一种抗烟草青枯病的枯草芽孢杆菌菌剂，其制备方法包括以下步骤
1、菌种活化对从市场上购买的斜面保藏的枯草芽孢杆菌B908活化培养至芽孢脱落；
活化培养基(NA)配方为牛肉胨3g，蛋白胨5g，琼脂16g，水定容至IOOOml ；
2、摇床扩大培养将活化后的枯草芽孢杆菌接种到液体培养基中进行摇床扩大培养， 初始PH值为7. 2，培养温度为30°C，摇床转速为200rpm，至20%的芽孢脱落为止；
所用的液体培养基的配方为玉米粉6. 5g，葡萄糖2. 5g，豆饼粉10. Ig,鱼粉2. 5g， CaCO3 3. 5g, (NH4)2SO4 0. 5g, K2HPO4 0. 15g, MgSO4 · 7H20 0. lg, MnSO4 · H2O 0. lg，水定容至 500ml ；
3、种子罐扩大培养在无菌操作下，将摇床扩大培养后的菌液接入到含有种子罐培养基的种子罐内，初期通风比量1 0. 25，后期通风比1 1 ；同时，控制发酵液的pH值为 7. 3，温度为32°C，发酵罐的搅拌转速为220 rpm ；至芽孢杆菌进入对数生长期的后期；
所用的种子罐培养基配方为玉米粉12. 98g，葡萄糖5g，豆饼粉20. lg，鱼粉5g，CaCO3 6. 90g, (NH4)2SO4 lg, K2HPO4 0. 3g, MgSO4 · 7H20 0. 2g, MnSO4 · H2O 0. 2g，水定容至 1000ml ；
4、发酵罐发酵
将培养至指数生长期后期的种子罐菌液在无菌条件下转入装有发酵罐培养基的发酵罐，罐装量为发酵罐容积的70%，进行发酵罐的前期培养和后期培养；
(1)发酵罐前期培养对接入种子液的发酵罐，温度32°C，pH7.3，通风量1 1.1，搅拌转速180 rpm ；保持发酵液总糖含量0. 6%、总氮含量45ng/ml，培养至芽孢形成率65%，进入发酵后期；
(2)发酵后期培养不再调节发酵液pH值，使用有机氮源补充发酵液的总氮含量，控制总氮含量在40ng/ml以上，培养至综合芽孢形成率80%以上，pH值7. 7以上，发酵结束；
所述的发酵罐培养基的配方为玉米粉12. 98g，葡萄糖5g，豆饼粉20. Ig,鱼粉5g， CaCO3 6. 90g, (NH4)2SO4 lg, K2HPO4 0. 3g, MgSO4 · 7H20 0. 2g, MnSO4 · H2O 0. 2g，水定容至 1000ml ；
所述的有机氮源的制备方法为将等质量的花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、酵母粉、蚕蛹粉、鱼粉混合，调制成重量分数为16%的混合溶液，加入到反应釜内；然后在反应釜内通过流加质量分数为6 10%的盐酸控制溶液的pH为6. 0，来进行消化水解，同时保持温度 120°C、压力0. IMPa，水解25分钟，提取水解液；向水解液中加入重量分数为15%的玉米浆和由等质量的缬氨酸、L-色氨酸、色氨酸、硫氨基酸组成的混合氨基酸溶液，配成固形物含量为重量分数18%的有机氮源，比例为水解液、玉米浆和混合氨基酸溶液的混合质量比为 1:1:1;5、菌剂的制备
发酵结束后，降低发酵通风比至1 0. 08，维持发酵罐正压0. 02MPa,降低搅拌转速至 20rpm，对发酵液降温至至10°C以下；
通过膜过滤浓缩处理，将发酵液体积浓缩至原来的1/8。添加浓缩液体积量的0. 07%调配缓冲保护剂(即磷酸二氢钠与磷酸氢二钠配成的PH8. 0的混合溶液)混合均勻后，对浓缩后的发行喷雾干燥处理；
所述的喷雾干燥方法为对干燥塔、旋风分离器进行30分钟的120°C的热风灭菌，然后降低热风温度至80°C，依次开启引风机、鼓风机、加热器、进料泵、闭风器，调整物料流量 ISOKg/小时、通风量8000m3/小时，开启隔膜泵泵入调配好的发酵液，进行产品的喷雾干燥， 得到成品菌剂。 最后应说明的是以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明， 尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。 凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种抗烟草青枯病的枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法，其特征在于由以下方法制备而成(1)菌种活化对保藏的枯草芽孢杆菌进行活化培养至芽孢脱落；(2)摇床扩大培养将活化后的枯草芽孢杆菌接种到液体培养基中进行摇床扩大培养， 初始PH值为7. 0 7. 2，培养温度为30°C，摇床转速为200rpm，至15 20%的芽孢脱落为止；(3)种子罐扩大培养在无菌操作下，将摇床扩大培养得到的菌液接入到含有种子罐培养基的种子罐内，初期通风比1 0.25，后期通风比1 1 ；同时，控制发酵液的pH值为 6. 9 7. 3，温度为32°C，发酵罐的搅拌转速为80 220 rpm ；至芽孢杆菌进入对数生长期的后期；(4)发酵罐发酵将培养至指数生长期后期的种子罐菌液在无菌条件下转入装有发酵罐培养基的发酵罐，罐装量为发酵罐容积的70%，进行发酵罐的前期培养和后期培养；(5)菌剂的制备发酵罐发酵结束后，降低发酵通风比至1 0.08，维持发酵罐压力 0. 02MPa,降低搅拌转速至20rpm，对发酵液降温至10°C以下；然后通过膜过滤浓缩处理，将发酵液体积浓缩至原来的1/5 1/8 ；再添加调配缓冲保护剂，混合均勻后，对浓缩后的发酵液进行喷雾干燥处理，得到菌剂产品。
2.根据权利要求1所述的一种抗烟草青枯病的枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法，其特征在于所述的步骤(1)活化所用的培养基配方为牛肉胨3g，蛋白胨5g，琼脂16g，水定容至 1000ml。
3.根据权利要求1所述的一种抗烟草青枯病的枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法，其特征在于所述的步骤(2)的液体培养基的配方为玉米粉6.5g，葡萄糖2. 5g，豆饼粉10. lg，鱼粉 2. 5g, CaCO3 3. 5g, (NH4)2SO4 0. 5g, K2HPO4 0. 15g, MgSO4 · 7H20 0. lg, MnSO4 · H2O 0. lg，水定容至500ml。
4.根据权利要求1所述的一种抗烟草青枯病的枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法，其特征在于所述的步骤(3)的种子罐培养基配方为玉米粉12. 98g，葡萄糖5g，豆饼粉20. lg，鱼粉 5g, CaCO3 6. 90g, (NH4)2SO4 lg, K2HPO4 0. 3g, MgSO4 · 7H20 0. 2g, MnSO4 · H2O 0. 2g，水定容至 IOOOml0
5.根据权利要求1所述的一种抗烟草青枯病的枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法，其特征在于所述的步骤(4)的发酵罐培养基的配方为玉米粉12. 98g，葡萄糖5g，豆饼粉20. Ig, 鱼粉 5g, CaCO3 6. 90g, (NH4)2SO4 lg, K2HPO4 0. 3g, MgSO4 · 7H20 0. 2g, MnSO4 · H2O 0. 2g，水定容至1000ml。
6.根据权利要求1所述的一种抗烟草青枯病的枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法，其特征在于所述的步骤(4)的发酵罐前期培养方法为对接入种子液的发酵罐，温度观 32°C， !16.9 7.3，通风量1 0. 25 1. 1，搅拌转速150 180 rpm ；保持发酵液总糖含量 0. 35 0. 6%、总氮含量30 45ng/ml，培养至芽孢形成率55 65%，进入发酵后期。
7.根据权利要求1所述的一种抗烟草青枯病的枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法，其特征在于所述的步骤(4)的发酵罐后期培养方法为使用有机氮源调节发酵液的总氮含量，控制总氮含量在40ng/ml以上，培养至芽孢形成率80%以上、pH值7. 7以上，后期发酵结束。
8.根据权利要求7所述的一种抗烟草青枯病的枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法，其特征在于所述的步骤(4)的有机氮源的制备方法为将花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、酵母粉、蚕蛹粉、鱼粉按照重量比为1 :1:1:1:1: 1的比例混合，调制成重量分数为 9% 16%的混合溶液，加入到反应釜内；然后在反应釜内通过流加质量分数为6 10%的盐酸控制溶液的PH为6. 0，来进行消化水解，同时保持温度120°C、压力0. IMPa,水解25分钟， 提取水解液；向水解液中加入重量分数为15%的玉米浆和重量比为1 1 1 1 1的缬氨酸、L-色氨酸、色氨酸、硫氨基酸组成的混合氨基酸溶液，配成固形物含量为重量分数 16% 18%的有机氮源，比例为水解液、玉米浆和混合氨基酸溶液的混合质量比为1 1 1。
9.根据权利要求1所述的一种抗烟草青枯病的枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法，其特征在于所述的步骤(5)的喷雾干燥方法为对干燥塔、旋风分离器进行30分钟的120°C的热风灭菌，然后降低热风温度至80°C，依次开启引风机、鼓风机、加热器、进料泵、闭风器，调整物料流量至150 180Kg/h、通风量至5000 8000m3/h，开启隔膜泵泵入调配好的发酵液， 进行产品的喷雾干燥，得到成品菌剂，菌粉质量指标为水分小于3. 5%，每克菌数大于2000 亿个，菌体芽孢形成率大于85%。
10.根据权利要求1所述的一种抗烟草青枯病的枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法，其特征在于所述的调配缓冲保护剂为由磷酸二氢钠与磷酸氢二钠混合而成的PH8. 0的溶液， 添加量为浓缩液体积量的0. 07%。
全文摘要
本发明公开了一种抗烟草青枯病的枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法，包括菌种活化、摇床扩大培养、种子罐扩大培养、发酵罐发酵和菌剂的制备等步骤制备而成；本发明的优点在于在菌体发酵的这过程中，通过后期补加有机氮源，使得菌体形成代谢性生长，提高碱性蛋白抗生素的产生，同时利于芽孢的正常生成，最终获得一种高效抗烟草青枯病的枯草芽孢菌剂。
文档编号A01P1/00GK102258059SQ201110195718
公开日2011年11月30日 申请日期2011年7月13日 优先权日2011年7月13日
发明者史兰东, 吕玉成, 薛明政 申请人:山东玉成生化农药有限公司