专利名称：一种新型灌注保存液的制作方法
技术领域：
本发明为一种新型的灌注保存液，用于灌注并保存人体或动物的器官、组织或细胞。本发明可用于人体或动物移植手术中移植物的灌注和保存，也可用于相关的医学研究和实验室研究。
背景技术：
大量研究表明，钠氢通道(Na+ATexchangers，NHEs)广泛存在于心肌、肺、脑、肾、肝脏、胰腺等器官中。哺乳动物NHE有9种亚型，分别称之为NHEl 9。(参见MasereelB，Pochet L，Laeckmann D. An overview of inhibitors ofNa./H+exchanger· Eur J MedChem. 2003 ；38(6) :547-554)。在正常情况下，NHEl对调节细胞内pH梯度和细胞内Na+浓度具有十分重要的作用，从而维持细胞的各种生理功能和化学感受器的调节。有大量研究显示，低氧可增加肺血管内皮细胞内[H+]，通过激活NHEl而引起内皮细胞损伤。(参见Cutaia M，Tollefson K，Kroczynski J，et al. Role of the Na/H antiport in pH dependentcell death in pulmonary artery endothelial cells. Am J Physiol Lung Cell MolPhysiol. 2000 ；278 :536-544 ；和 Rios EJ, Fallon M，Wang J，et al. Chronic hypoxiaelevates intracellular pH and activates Na./H+exchange in pulmonary arterialsmooth muscle cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2005 ；289 (5) L867-L 874 ；和 Shimoda LA，Fallon M，Pisarcik S，et al. HIF-I regulates hypoxic induction ofNHEl expression and alkalinization of intracellular pH in pulmonary arterialmyocytes. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2006 ；291 :L941_L949) 研究证实，钠氢通道(Na+/H+exchangers，NHEs)抑制剂能够减轻心肌、脑、肾、肝、胰腺等器官的缺血再灌注损伤。(参见Bobulescu IA, Di Sole F, Moe, 0. Na+/H+exchangers !physiology and I ink to hypertension and organ ischemia. Curropin Nephrol Hypertens. 2005 ；14 :485-494 ；和 Wang D，Dou K，Song Z，et al. TheNa./H+exchange inhibitor a new therapeutic approach for hepatic ischemiainjury in rats.Transplant Proc. 2003 ；35 :3134-3135 ；和 Masuoka H，Fujimori K，Sekiquchi S，et al. Beneficial effect of FR 183998，a Na./H+exchanger inhibitor，on porcine pancreas allotransplantation retrieved from non-heart-beatingdonors. Transplant Proc. 2005 ；37 :223-225)。非选择性納氢^通道(Na+/H+exchangers，NHEs)抑制剂Amiloride能防治肺动脉高压，能显著降低缺血后急性肺损伤，降低肺毛细血管通透系数的增加。(参见 Khoury J，Langleben D. Heparin-like molecules inhibitpulmonary vascular pericyte proliferation in vitro. Am J Physiol Lung Cell MolPhysiol. 2000 ；279(2) :L252_61 ；和 Moore TM，Khimenko PL, Taylor AE. Restorationof normal pH triggers ischemia-reperfusion injury in lung by Na./H+exchangeactivation. Am J Physiol. 1995 ；269(4Pt 2) :H1501_505)。含非选择性钠氢通道(Na+/H+exchangers，NHEs)抑制剂Amiloride及其混合物的灌注保存液已成功用于心脏的灌注和保存，且具有较好的心肌保护作用。(参见Raymond ；Richard M. Organ transplantsolutions and method for transplanting an organ[P]. US563,462. 1997-12-2)。因此，如能进一步减轻移植物缺血再灌注损伤，将能更好的保存移植物的生理结构和功能
发明内容
为了提高现有灌注保存液的保护性能，进一步减轻移植物在缺血保存期和再灌注移植期的损伤，有效地保存移植物的生理结构和功能，同时基于目前的科研结果和本小组的前期研究，本研究小组发明一种可用于灌注并保存人和动物器官、组织或细胞的含特异性钠氢通道I型(Na7H+eXChanger 1，NHEI)抑制剂的新型灌注保存液。为进一步减轻移植物在缺血期和再灌注移植期的损伤，本发明小组将特异性钠氢通道I型(Na+/H+exchanger Ι,ΝΗΕΙ)抑制剂Η0Ε642加入到移植物灌注保存液中，并将其浓度控制在lOumol/L lOOumol/L范围内。本发明的溶液可用作灌注溶液或保存溶液。作为灌注溶液，将其泵入到器官、组织的循环系统以保护器官组织和细胞。作为保存溶液，其用作浸没器官、组织或细胞的浴液。优选的，将移植物用本发明的溶液灌注并且浸没在本发明的溶液中。本发明的新型灌注保存液能够有效的减轻移植物在缺血保存期和再灌注移植期的损伤，有效地保存移植物的生理结构和功能，而且本发明的有益效果已在本小组的前期研究中已得到证实。本小组在用含有10umol/L特异性钠氢通道I型(Na+/H+exchanger I,NHEI)抑制剂H0E642的改良KHHB灌注液灌注离体大鼠肺脏发现，H0E642能明显减轻离体大鼠肺缺血灌注损伤过程中PAP、MDA、W/D的升高和肺泡II型上皮细胞内钙超载，提高SOD活性。同时能减轻肺缺血再灌注损伤，减轻肺血管内皮及肺泡上皮细胞的病理改变。H0E642在预处理和缺血过程中给予有明显的保护效果。
图I为电镜下三组肺泡II型上皮细胞超微结构(X8000)。其中a :对照组，b :缺血再灌注组，c :卡立泊来德组。图2为光镜下三组肺组织形态学的改变。a :对照组(X 100)，b :缺血再灌注组(X100)，C :卡立泊来德组(X 100)，d :对照组(X200)，e :缺血再灌注组(X200)，f :卡立泊来德组(X 200) ο
具体实施例方式该灌注保存液成分如下1)细胞外液电解质成分Na+，K+，Mg2+，CF, S042_ ；2)有效缓冲系统HP042_，H2PO4-, HC03_ ;3)胶体活性物质右旋糖酐40或白蛋白或羟乙基淀粉HES(130/0.4) ；4)细胞新陈代谢所需的底物葡萄糖；5)特异性钠氢通道I型(Na+/H+exchanger 1，NHE1)抑制剂 H0E642。本发明的溶液可以如下制备将固体钠氢通道I型(Na+/H+exchanger Ι,ΝΗΕΙ)抑制剂Η0Ε642、右旋糖酐40或白蛋白或羟乙基淀粉(HES130/0. 4)、氯化钠、氯化钾、硫酸镁、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、葡萄糖、三羟甲基氨基甲烷分别溶于含有无菌蒸馏水的容量瓶中，进行充分搅拌大约30分钟。用NaOH将pH值调整到7. O 7. 6，并用50um微孔过滤器进行过滤，除去不溶残渣后便得到无菌的新型灌注保存液。钠氢通道I型(Na+/H+eXChangerΙ,ΝΗΕΙ)抑制剂Η0Ε642还可以溶解于已知的保存液中，例如Krebs-Henseleit溶液、UW液、St. Thomas II溶液、Collins溶液、Stanford溶液等中，且上述溶液中H0E642的优选浓度范围与本发明灌注保存液中的优选浓度相同。该灌注保存液成分优选浓度范围如下NaCl :85. Ommol/L 145mmol/L ;KC1 3. Ommol/L 30mmol/L ；Na2HP04 :0. 7mmol/L I. 3mmol/L ；NaH2PO4 :0. 7mmol/L I. 3mmol/L ；NaHCO3 15. Ommol/L 35. Ommol/L ;葡萄糖1. Ommol/L 50mmoI /T, ;MgS04 :0. QmmoI /L 4. 8mmol/L ；HES (130/0. 4) 30g/L lOOg/L 或右旋糖酐 40 2g/L 20g/L 或白蛋白50g/L lOOg/L ;渗透压280m0sm/L 320m0sm/L ;pH维持在7· 4 7· 6，更优选为约7. 2
7.4的生理学pH。当该灌注保存液用于心脏灌注时，K+浓度范围为16mmol/L 30mmol/L, 20mmol/L 26mmol/L 为宜，最佳 23mmol/L,Mg2+增加到 I. 2mmol/L I. Bmmol /I,,最佳 I. Smmol /I, I. 6mmol/L, H0E642优选浓度为20 μ mol/L。当该灌注保存液用于心脏保存时，K+浓度范围 为 3. O mmol /I, 8. Ommol/L, 4. Ommol/L 6. Ommol/L 为宜，H0E642 优选浓度为 20 μ mol/L。当该灌注保存液用于肺、肝脏、肾脏、胰腺、小肠及其他移植物灌注保存时，K+浓度范围为 3. Ommol/L 6. Ommol/L, 4. Ommol/L 5. Ommol/L 为宜，H0E642 优选浓度为 30 μ mol/L 100 μ mol/L,优选 50 μ mol/L。举例例I用于心脏灌注时，成分如下
成分浓度成分浓度
NaCl117mmol/L葡萄糖llmmol/L
KCl23mmol/LHES(130/0.4)50g/L
MgSO41.2mmol/LHOE64220μηιο1/
NaH2P040.8mmol/L NaHCO318mmol/L
Na2HP040.8mmol/L例2用于心脏保存时，成分如下
成分浓度成分浓度
NaCl117mmol/L葡萄糖llmmol/L
KCl6mmol/LHES(130/0.4)50g/L
MgSC>41.2mmol/LHOE64220μιηο1/
NaH2P040.8mmol/LNaHC0318mmol/L
Na2HPC>4_0.8mmol/L_例3用于肝脏、肾脏、肺、胰腺、小肠等移植物灌洗和保存时，成分如下
权利要求
1.一种新型灌注保存液，由人体或动物的生理范围内的电解质成分、营养底物、胶体活性物质、酸碱缓冲系统和钠氢通道I型(NHEl)抑制剂组成；灌注保存液中含NaCl 85. Ommol /I, 145mmol/L> KCl :3. Ommol/L 30mmol/L> Na2HP04 :0. 7mmol/L I. 3mmol/L、NaH2P04 0. 7mmol/L I. 3mmoI/L、NaHCO3 15. Ommol/L 35. Ommol/L、葡萄糖1. OmmoI/L 50mmol/L、MgS04 :0. 9mmol/L 4. 8mmol/L、轻乙基淀粉 HES (130/0. 4) 30g/L IOOg/L或右旋糖酐40 2g/L 20g/L或白蛋白50g/L 100g/L、钠氢通道I型(NHEl)抑制剂H0E642 =IOumoI/L 100umol/L、蒸馏水、其特征是含有钠氢通道I型(HHEl)抑制剂。
2.根据权利要求I所述的新型灌注保存液，其特征是钠氢通道I型(NHEl)抑制剂主要为 H0E642。
3.根据权利要求I所述的新型灌注保存液，其特征是钠氢通道I型(NHEl)抑制剂H0E642 的浓度范围是 10umol/L 100umol/L。
4.根据权利要求I所述的新型灌注保存液，其特征是可用于人体或动物移植手术过程中，移植物的灌注和保存；也可用于相关的医学研究和实验室研究。
5.根据权利要求4所述的新型灌注保存液，其中所述的移植手术特征是自体移植、同质移植、同种异体移植或异种移植。
6.根据权利要求4所述的新型灌注保存液，其中所述的移植物特征是人体或动物的器官及其所属部分、组织及其所属部分或细胞。
全文摘要
本发明为一种新型的灌注保存液，能用于灌注并保存人体或动物的器官、组织或细胞，属于生物医学领域。本发明由人体或动物生理范围内的电解质成分、营养底物、胶体活性物质、酸碱缓冲系统和有效浓度的特异性钠氢通道1型(NHE1)抑制剂HOE642组成。该灌注保存液性能稳定，能减轻人体或动物的器官、组织或细胞在缺血保存期和再灌注期的损伤，有效地保存器官、组织或细胞的生理结构和功能。该灌注保存液适用于人体或动物的自体移植、同质移植、同种异体移植及异种移植中移植物的灌注和保存，也可于相关的医学研究和实验室研究。
文档编号A01N1/02GK102870764SQ201110195800
公开日2013年1月16日 申请日期2011年7月13日 优先权日2011年7月13日
发明者刘斌, 郑剑桥, 余海, 周棱, 李茜 申请人:刘斌, 郑剑桥, 余海