专利名称：一种快速获得辣椒转基因植株的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域中转基因植株的获取方法，尤其涉及一种通过农杆 菌侵染辣椒未成熟胚快速获得转基因植株的方法。
背景技术：
转基因技术是利用重组DNA、细胞组织培养或种质系统转化等技术，将外源基因导入植物细胞或组织，使之定向重组遗传物质，改良植物性状，培育优质高产作物新品种。自 1983年首例转基因植株诞生，天然植物基因工程开始在人工控制下定向改良植物的遗传性状。与常规育种方法相比，它具有以下一些特点1)不受亲缘关系的限制，可实现动物、植物和微生物间遗传物质的交流，从而充分利用自然界存在的各种遗传资源；2)有效地打破有利基因和不利基因的连锁，充分利用有用基因；3)加快育种进程，缩短育种年限。自第一例转基因烟草问世以来，植物转基因研究和应用发展迅速。到1997年为止，全世界转基因植物涉及到至少35科的200多个种。目前，植株转基因已成为植物分子生物学研究的强有力的实验手段；更是基因克隆、功能基因组研究必不可少的实验工具。近年来，遗传转化方法不断创新，已发表的植物转基因操作体系有近10种，以转化系统的原理大致可分为三类1)农杆菌介导的基因转移；2)以原生质体、细胞或组织为受体的直接转移，如电激、微注射、PEG介导法；3)种质系统的基因转移，如利用子房注射、种胚、体细胞胚及花粉。目前应用最多的是根癌农杆菌介导的转基因方法，迄今所获得的200多种转基因植物中，80%以上是利用该方法获得的。截至1999年，至少30个国家进行了总计3万次以上的转基因作物的田间试验，改良的经济性状有10多个；已有大豆、玉米、棉花、油菜、番茄、马铃薯、烟草、西葫芦和蕃木瓜等9种作物的转基因品种投入了商业化生产，取得了良好的社会效益和经济效益。辣椒为茄科辣椒属蔬菜作物，是我国栽培面积最大的蔬菜作物之一。自从首次开展辣椒组织培养工作以来，国内外相继出现采用不同的辣椒外植体，如子叶、茎尖、茎段、叶片、下胚轴、子叶柄、花药及其原生质体等进行组织培养的报道。但辣椒组织培养具有很强的基因型特异性，再生效率不理想，在多数试验中植株的再生周期长或分化频率低，其不定芽的生长能力较差，有的甚至停留在芽诱导阶段而不能进一步生长，这在很大程度上限制了辣椒基因工程的研究进展。目前，关于辣椒转基因工作研究主要集中遗传转化体系的建立上，但遗传转化过程仍存在一些主要问题限制了辣椒转基因技术在实际育种中的应用， 如培养周期长、植株再生困难和遗传转化率低等。因此，如何建立成熟的遗传转化体系、提高遗传转化率是辣椒转基因工作中急需解决的一个难题。
发明内容
技术问题本发明的目的是提供一种通过农杆菌侵染辣椒未成熟胚快速获得转基因植株的方法。该方法可用于新基因功能的验证以及优良转基因育种材料的获得，也为其他作物的转基因研究提供参考。
技术方案本发明提供了一种通过农杆菌侵染辣椒未成熟胚快速获得转基因植株的方法。其过程是对辣椒未成熟胚先进行农杆菌侵染，再进行培养，然后对获得的再生植株进行PCR鉴定，在短期内获得转基因植株。具体步骤如下
1)取样在果实采摘期晴天从健壮植株上取自然成熟的红果(授粉后4(Γ50天)。2)农杆菌活化和侵染将含有目的基因(掌叶半夏凝集素基因ΡΡΑ，基因全长 777bp)的农杆菌LBA4404接种于含有45mg/L卡那霉素及50mg/L利福平的YEB的固体培养基上，27 °C暗培养2d后，挑单菌落接种至含有45mg/L卡那霉素及45mg/L利福平的YEB液体培养基中，27°C，250rpm振荡培养至OD6tltl值为0. 4、6，将菌液转入50mL离心管中，4000rpm 离心菌液后，用等体积的无菌水悬浮菌液后备用。取1)中果实的种子，用解剖刀将其一分为二，随后取出未成熟胚转移至已准备好的农杆菌菌液中，浸没5分钟。3)再生培养基(R培养基)和筛选培养基(S培养基)制备R和S培养基所用基本培养基为MS培养基，所用碳源为蔗糖，凝固剂为琼脂。R培养基的组成成分为MS+2mg/L 6-BA+3%蔗糖+0. 8%琼脂，S培养基的组成成分为MS+2mg/L 6_BA+3%蔗糖+0. 8%琼脂+60mg/ L卡那霉素。4)未成熟胚接种和培养将2)中侵染的未成熟胚在灭菌滤纸上浙干菌液后，置于 3)中R培养基上培养先在27°C黑暗条件下培养3天后用无菌水冲洗数次外植体，转移到筛选培养基上，黑暗培养1周，后于光照度20001χ、光照时间12h、室温27°C下继续培养，每三角瓶放30个未成熟胚。5)不定芽形成和植株再生接种后一周，可观察到未成熟胚膨大。继续培养三周后，可陆续观察到不定芽的出现，随后形成根、芽、叶俱全的完整植株。 6)转基因植株的PCR鉴定以再生植株的叶片为材料提取基因组DNA，利用所转化基因的序列设计特异引物对DNA进行扩增，以质粒和水为对照。扩展条带的有无表示转基因侵染成功与否。有益效果
1)首次在辣椒转基因研究中利用未成熟胚为试材快速获得转基因再生植株。该发明缩短了转基因接种再生培养时间，提高了转化效率，获得的转基因植株可用于新基因的功能验证。同时，获得的转基因植株可作为优异育种材料运用于育种实践。2)辣椒annuum L.)属茄科辣椒属，是一种被广泛种植的重要蔬菜作物。然而，由于辣椒遗传基础狭窄，种质资源有限，仅采用常规育种手段选育新品种不仅耗时耗力、效率低，且难以使新品种在抗性和品质等方面有显著提高。而利用本发明方法可快速转基因植株，不仅可以缩短转基因过程中遗传转化的培养时间，提高转化效率，短期内就可以进行完成目的基因的功能验证，而且可以提供新的种质资源，使新株系在特定性状(抗性和品质)等方面得到显著提高。应用本发明获得的转基因植株可作为育种材料直接用于新品种的培育。3)本发明是建立在以辣椒未成熟胚为试材进行转基因培养包括基因型、取材时期、接种菌液浓度和时间以及培养基成分等系统研究工作基础上的。通过农杆菌侵染未成熟胚获得转基因再生植株可以缩短培养时间、提高转化效率。本发明从农杆菌侵染未成熟胚到再生植株的获得一般需要7周时间，培养过程中再生植株形成率最高可达50%，转基因植株阳性率高达80%。而未成熟胚具有取材方面、结构简单、基因型丰富等优点，对未成熟胚进行离体培养可以准确地研究植株再生条件，以及可以快速获得多种基因型的转基因育种材料。同时，通过农杆菌侵染未成熟胚培养可以进行优良辣椒无性系变异材料的筛选，创制新的种质资源，扩大辣椒基因池。总之，本方法具有坚实的理论依据，科学性强、方法简便， 易于操作和实际应用。
图1利用未成熟胚进行辣椒转基因研究流程图
图2实施例农杆菌侵染未成熟胚获得转基因植株。A.刚接种的辣椒未成熟胚；B. 膨大的辣椒未成熟胚；C.不定芽形成；D.根芽叶俱全的转基因再生植株；
图3实施例转基因植株PCR验证结果，750bp附近处有目的条带表示为转基因植株。
具体实施例方式植物转基因技术在改善生物的抗性、提高生物品质、创造新种质或品种、人类保健和医药等方面具有较大应用前景。生物技术作为辅助手段可以解决一些常规技术难以解决的问题，使农业出现一次新的产业革命。转基因技术不受作物种间限制，将控制某生物性状的目的具有从生物中取出，通过基因操作，将其导入待改良的寄主细胞内并表达，从而培育出新品种。这一技术可大大提高育种效果，加速育种进程，丰富农作物的营养和功能，延长保质期，去除过敏成分，提高作物耐高温、盐碱、病害等抗逆性。植株组织培养再生体系的建立是进行基因遗传转化的基础。自从首次开展辣椒组织培养工作以来，国内外相继出现采用不同的辣椒外植体，如子叶、茎尖、茎段、叶片、下胚轴、子叶柄、花药及其原生质体等进行组织培养的报道。但辣椒组织培养具有很强的基因型特异性，再生效率不理想，在多数试验中植株的再生周期长或分化频率低，其不定芽的生长能力较差，有的甚至停留在芽诱导阶段而不能进一步生长，这在很大程度上限制了辣椒基因工程的研究进展。而利用未成熟胚作为转基因受体材料具有再生能力强、取材方便、基因型丰富、群体数量大等优点，因此对未成熟胚进行离体培养可以更好地控制遗传转化和植株再生条件，快速获得多种基因型的转基因材料，以及容易获得体细胞无性系变异材料。我们应用本发明的方法，通过农杆菌侵染辣椒未成熟胚可在短时间内获得了转基因再生植株。本实例就以辣椒未成熟为材料，采用本发明方法通过农杆菌侵染未成熟胚在50 天之内获得转基因再生植株。含有目的基因掌叶半夏凝集素基因PPA的农杆菌LBA4404 可以从市面购得或采用经典分子生物学操作方法获取(参见Sambrook J, Fristsh E F, Maniatis T. Molecular Cloning; A Laboratory Manual 2nd ed.NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)。实施过程如下
1)取样在果实采摘期晴天从健壮植株上取自然成熟的红果，授粉后4(Γ50天；
2)农杆菌活化和侵染将含有目的基因(掌叶半夏凝集素基因ΡΡΑ，基因全长777bp)的农杆菌LBA4404接种于含有45mg/L卡那霉素及45mg/L利福平的YEB的固体培养基上，27 °C 暗培养2天后，挑单菌落接种至含有45mg/L卡那霉素及45mg/L利福平的YEB液体培养基中，27°C，250rpm振荡培养至0D_值为0. 4 06，将菌液转入50mL离心管中，4000rpm离心菌液后，用等体积的无菌水悬浮菌液后备用。取1)中果实的种子，用解剖 刀将其一分为二，随后取出未成熟胚转移至已准备好的农杆菌菌液中，浸没5分钟；
3)再生培养基(R培养基)和筛选培养基(S培养基)制备R和S培养基所用基本培养基为MS培养基，所用碳源为蔗糖，凝固剂为琼脂。R培养基的组成成分为MS+2mg/L 6-BA+3%wt 蔗糖+0. 8%wt琼脂，S培养基的组成成分为MS+2mg/L 6-BA+3%wt蔗糖+0. 8%wt琼脂+60mg/ L卡那霉素；
4)未成熟胚接种和培养将2)中侵染的未成熟胚在灭菌滤纸上浙干菌液后，置于3)中 R培养基上培养先在27°C黑暗条件下培养3天后用无菌水冲洗数次外植体，转移到筛选培养基上，黑暗培养1周，后于光照度20001χ、光照时间12h、室温27°C下继续培养，每三角瓶放30个未成熟胚；
5)不定芽形成和植株再生接种后一周，可观察到未成熟胚膨大。继续培养三周后，可陆续观察到不定芽的出现，随后形成根、芽、叶俱全的完整植株；
6)转基因植株的PCR鉴定以再生植株的叶片为材料提取基因组DNA，利用所转化基因的序列设计特异引物对DNA进行扩增，以质粒和水为对照。
权利要求
1.一种快速获得辣椒转基因植株的方法，其特征在于包含下列步骤1)取样在果实采摘期晴天从健壮植株上取自然成熟的红果；2)农杆菌活化和侵染将含有目的基因的农杆菌LBA4404接种于含有45mg/L卡那霉素及45mg/L利福平的YEB的固体培养基上，27°C暗培养2天后，挑单菌落接种至含有 45mg/L卡那霉素及45mg/L利福平的YEB液体培养基中，27°C，250rpm振荡培养至0D_值为0. 4 06，将菌液转入50mL离心管中，4000rpm离心菌液后，用等体积的无菌水悬浮菌液后备用；取1)中果实的种子，取出未成熟胚转移至已准备好的农杆菌菌液中，浸没5分钟；3)再生培养基和筛选培养基制备再生和筛选培养基所用基本培养基为MS培养基， 所用碳源为蔗糖，凝固剂为琼脂；再生培养基的组成成分为MS+f5mg/L 6-BA+3%wt蔗糖 +0. 8%wt琼脂，筛选培养基的组成成分为MS+l 5mg/L 6-BA +3%wt蔗糖+0. 8%wt琼脂+60mg/ L卡那霉素；4)未成熟胚接种和培养将2)中侵染的未成熟胚在灭菌滤纸上浙干菌液后，置于3)中再生培养基上，在27°C黑暗条件下培养后用无菌水冲洗外植体，转移到筛选培养基上黑暗培养，然后于光照度20001x、光照时间12h、室温27°C下继续培养，每三角瓶放30个未成熟胚；5)不定芽形成和植株再生接种后四周形成完整植株。
2.根据权利要求1所述的获取辣椒转基因植株的方法，其特征在于再生培养基和筛选培养基制备过程中，再生和筛选培养基组成中BA的浓度为2mg/L。
3.根据权利要求1所述的获取辣椒转基因植株的方法，其特征在于未成熟胚接种和培养过程中，将2)中侵染的未成熟胚在灭菌滤纸上浙干菌液后，置于3)中再生培养基上，先在27°C黑暗条件下培养广5天后用无菌水冲洗外植体，转移到筛选培养基上黑暗培养5 10 天。
全文摘要
一种快速获得辣椒转基因植株的方法，该方法包括取样；农杆菌活化和侵染；再生培养基和筛选培养基制备；未成熟胚接种和培养；不定芽形成和植株再。在短时间内即可高效地获得辣椒转基因再生植株。本发明从农杆菌侵染未成熟胚到再生植株的获得一般需要7周时间，培养过程中再生植株形成率最高可达50%，转基因植株阳性率高达80%。该发明中以未成熟胚为受体材料进行农杆菌侵染、接种培养后直接形成再生植株，缩短了培养周期、提高了培养效果和遗传转化效率，本发明若应用于基因功能验证和育种实践，必将大大加快辣椒基因功能组学的研究和育种实践进展。
文档编号A01H5/00GK102286526SQ20111023105
公开日2011年12月21日 申请日期2011年8月12日 优先权日2011年8月12日
发明者刁卫平, 刘金兵, 戈伟, 潘宝贵, 王述彬 申请人:江苏省农业科学院