专利名称：一种用于马铃薯茎尖无愈伤成苗的固体培养基的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于马铃薯茎尖无愈伤成苗的固体培养基，属于农业生物技术领域。
背景技术：
马铃薯(Solanum tuberosum L.)原产于南美洲安第斯山，约在16世纪70年代传入中国，在中国已有400多年的栽培历史。它是世界第四大作物，中国第五大作物，在中国和世界都有广泛的种植面积。马铃薯的淀粉含量高达12% 20%，蛋白质含量为1. 5% 2%, Vc含量为10 20mg/100g鲜重，不仅是粮菜兼用的优良作物，而且还是轻工业、食品工业和医药工业不可缺少的重要原料。马铃薯植株在生产过程中，易受多种病毒的侵染。马铃薯感染病毒后，植株的生长势、产量都逐代下降，严重情况下几乎没有商品产量。因此，在马铃薯种植几代后，就要对其进行脱毒。另外为了保存一种新的品种资源，也需要对其进行脱毒。目前，对于脱毒的方式， 主要是茎尖剥离组织培养技术和其他附加的处理技术。而现阶段的茎尖成苗过程中，主要是先产生愈伤组织，再更换生芽培养基成苗。在此过程存在两个弊端，一是极易产生愈伤组织，通过愈伤组织再生的植株可能会发生变异，这些变异可能会改变品种本身的优良性状； 二是由于中间需要更换培养基，延长了培养时间，增加了污染几率。
发明内容
为了保证马铃薯品种原始性状和遗传背景，缩短培养时间，减少污染率，就要改变茎尖的再生方式。本发明针对现有技术的不足，提供了一种茎尖的无愈伤固体培养基，以期减少茎尖再生植株的变异。本发明技术方案如下一种用于培养马铃薯茎尖无愈伤成苗的培养基，包括无机物、有机物、植物激素、 蔗糖和倍力凝；其特征是，无机物包括浓度范围在165 2108mg/L的大量元素氮、磷、钾、 硫、钙、镁，浓度范围在0. 025 38mg/L的微量元素；有机物包括谷氨酰胺、水解酪蛋白、 酵母提取物、烟酸、盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素、甘氨酸中的一种或其组合；植物激素包括玉米素、赤霉素、6-苄氨基腺嘌呤、吲哚乙酸、吲哚丁酸中的一种或其组合。所述的大量元素氮、磷、钾、硫、镁、钙，优选的为氮、磷、钾、硫、镁、钙的硝酸盐、磷酸盐、硫酸盐、氯化物。所述的微量元素为碘、硼、锰、锌、钠、铜、铁、钼、钴。一种用于培养马铃薯茎尖无愈伤成苗的培养基，包括无机物、有机物、植物激素、 蔗糖和倍力凝；其特征是，包括以下组分(1)无机物大量元素硝酸钾 1900-2108mg/L 硝酸铵 1600~1700 mg/L 磷酸二氢钾 165~175 mg/L 硫酸镁 360~380 mg/L 氯化钙 430~450mg/L;
碘化钾0.8~0.9 mg/L
硼酸5.5~6.5mg/L
硫酸锰16~17.5mg/L
硫酸锌9~10mg/L
钼酸钠0.2~0.3 mg/L
硫酸铜0.02~0.03 mg/L
氯化钴0.02~0.03 mg/L 硫酸铁 27~28 mg/L
乙二胺四乙酸二纳 37~38mg/L;⑵有机物微量元素
⑷蔗糖 (5)倍力凝
谷氨酰胺
0-500 mg/L
水解酪蛋白 0~300mg/L
(3)植物激素
酵母提取物
肌醇
烟酸
盐酸吡哆醇盐酸硫胺素甘氨酸
玉米素赤霉素
6-苄氨基腺嘌呤吲哚乙酸
吲哚丁酸
25 35g/L ； 3. 5 4. 5g/L。
0-500 mg/L 80-120 mg/L 0.4-0.6 mg/L 0.4-0.6 mg/L 0.05-0.15 mg/L 1~2 mg/L；
0-0.5 mg/L 0.1-1.0 mg/L 0-0.2 mg/L 0-0.1 mg/L 0~0.2mg/L
优选的，该种用于培养马铃薯茎尖无愈伤成苗的培养基，包括无机物、有机物、植物激素、蔗糖、倍力凝；其特征是，包括以下组分(1)无机物大量元素
硝酸钾 1900~2108 mg/L
硝酸铵
1650 mg/L
磷酸二氢钾 170 mg/L
硫酸镁 370 mg/L
氯化钙 440 mg/L;
微量元素(2)有机物(3)植物激素
碘化钾 0.83 mg/L
硼酸硫酸锰
6.0 mg/L 16.9 mg/L
硫酸锌 9.6 mg/L 钼酸钠 0.25mg/L 硫酸铜 0.025mg/L 氯化钴 0.025mg/L
硫酸铁
27.8 mg/L
乙二胺四乙酸二纳37.3 mg/L;
谷氨酰胺
0-500 mg/L,
水解酪蛋白 0~300mg/L，
酵母提取物
肌醇
烟酸
盐酸吡哆醇盐酸硫胺素甘氨酸
0-500 mg/L 100 mg/L 0.5 mg/L 0.5 mg/L 0.1 mg/L 2 mg/L；玉米素赤霉素
6-苄氨基腺嘌呤吲哚乙酸
吲哚丁酸(4)蔗糖 30g/L ；(5)倍力凝 4g/L。本发明进一步技术方案该种用于马铃薯茎尖无愈伤成苗的培养基，包括无机物、有机物、植物激素、蔗糖、 倍力凝；其特征是，包括以下组分(1)无机物大量元素
硝酸钾2108 mg/L
硝酸铵1650 mg/L 磷酸二氢钾 170 mg/L
硫酸镁370 mg/L
氯化钙440 mg/L;微量元素
0-0.5 mg/L 0.1-1.0 mg/L 0-0.2 mg/L 0-0.1 mg/L 0~0.2mg/L；碘化钾 0.83 mg/L 硼酸 6.0 mg/L 硫酸锰 16.9 mg/L 硫酸锌 9.6 mg/L 钼酸钠 0.25mg/L 硫酸铜 0.025mg/L 氯化钴 0.025mg/L 硫酸铁 27.8 mg/L 乙二胺四乙酸二纳37.3 mg/L;⑵有机物
谷氨酰胺 250 mg/L 水解酪蛋白 100 mg/L 酵母提取物 250 mg/L 肌醇100 mg/L
烟酸0.5 mg/L
盐酸吡哆醇 0.5 mg/L 盐酸硫胺素 0.1 mg/L 甘氨酸2 mg/L；(3)植物激素玉米素0. 2 0. 5mg/L赤霉素0. 5 1. Omg/L吲哚丁酸0 0. lmg/L ；(4)蔗糖 30g/L ；(5)倍力凝 4g/L。配制方法按照配方准确称量各组分，所用试剂为分析纯，加去离子水充分溶解，定容，调整pH至5. 8 6. 0，分装，121°C灭菌15分钟。本发明还提供所述培养基用于马铃薯茎尖无愈伤成苗的方法，具体操作过程如下待剥离样品的准备块茎自然通过休眠后，分别播种于花盆内。待幼苗长到3-4cm 时剪切下来。去掉所有叶片，用自来水连续冲洗15分钟以上，然后用0. 1 %的生汞表面灭菌 10分钟(也可用次氯酸钠溶液)，最后在无菌条件下用无菌水彻底冲洗3-5次。剥离茎尖无菌条件下，在解剖镜下将含有1个叶原基的生长点，大小约为0. 1 0. 2mm，接种到本发明培养基上。然后在温度为22士2°C，光照强度7001x，光照时间他/d，相对湿度65 75%的培养室内培养。本发明将大量元素里的铵态氮和硝态氮进行了调节，并增加了有机添加物，主要是调节了激素种类和水平，由于新选用的培养基各种因素的综合作用，应用改良后的培养基，茎尖培养成苗基本无愈伤组织产生(见表1)，解决了长期困扰马铃薯茎尖再生变异的关键技术难题，保证了脱毒马铃薯品种的原始性状和遗传背景。另外，该培养基上成苗快， 缩短了培养时间。表1马铃薯茎尖再生培养基改良前后出愈率及成苗率的比较
权利要求
1.一种用于培养马铃薯茎尖无愈伤成苗的培养基，包括无机物、有机物、植物激素、蔗糖和倍力凝；其特征是，无机物包括浓度范围在165 2108mg/L的大量元素氮、磷、钾、硫、 钙、镁，浓度范围在0. 025 38mg/L的微量元素；有机物包括谷氨酰胺、水解酪蛋白、酵母提取物、烟酸、盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素、甘氨酸中的一种或其组合；植物激素包括玉米素、赤霉素、6-苄氨基腺嘌呤、吲哚乙酸、吲哚丁酸中的一种或其组合。
2.如权利要求1所述的用于培养马铃薯茎尖无愈伤成苗的培养基，其特征是，所述氮、 磷、钾、硫、镁、钙，优选氮、磷、钾、硫、镁、钙的硝酸盐、磷酸盐、硫酸盐、氯化物；所述微量元素为碘、硼、锰、锌、铜、钠、钼。
3.如权利要求1、2所述的用于培养马铃薯茎尖无愈伤成苗的培养基，其特征是，包括以下组分(1)无机物大量元素硝酸钾 1900-2108mg/L 硝酸铵 1600~1700mg/L 磷酸二氢钾 165~175 mg/L 硫酸镁 360~380 mg/L 氯化钙 430~450mg/L;微量元素碘化钾 0.8~0.9 mg/L硼酸5.5-6.5 mg/L硫酸锰16~17.5mg/L硫酸锌9-10 mg/L钼酸钠0.2-0.3 mg/L硫酸铜0.02-0.03 mg/L氯化钴0.02-0.03 mg/L硫酸铁27-28 mg/L乙二胺四乙酸二纳 37~3(2)有机物谷氨酰胺0-500 mg/L(3)植物激素水解酪蛋白 0~300mg/L 酵母提取物 0~500 mg/L肌醇烟酸盐酸吡哆醇盐酸硫胺素甘氨酸玉米素赤霉素6-苄氨基腺嘌呤吲哚乙酸80-120 mg/L 0.4-0.6 mg/L 0.4-0.6 mg/L 0.05-0.15 mg/L 1~2 mg/L；0-0.5 mg/L·0.1-1.0 mg/L0-0.2 mg/L 0-0.1 mg/L0~0.2mg/L；吲哚丁酸(4)蔗糖25 35g/L ；(5)倍力凝3. 5 4. 5g/L。
4.如权利要求3所述的用于培养马铃薯茎尖无愈伤成苗的培养基，其特征是，包括以下组分大量元素硝酸钾 1900~2108mg/L硝酸铵·1650 mg/L磷酸二氢钾 170 mg/L 硫酸镁 370 mg/L 氯化钙 440 mg/L;微量元素(2)有机物(3)植物激素碘化钾0.83 mg/L硼酸6.0 mg/L硫酸锰16.9 mg/L硫酸锌9.6 mg/L钼酸钠0.25mg/L硫酸铜0.025mg/L氯化钴0.025mg/L硫酸铁 27.8 mg/L 乙二胺四乙酸二纳37.3 mg/L;谷氨酰胺0~500 mg/L水解酪蛋白0~300mg/L酵母提取物0~500 mg/L肌醇100 mg/L烟酸0.5 mg/L盐酸吡哆醇0.5 mg/L盐酸硫胺素0.1 mg/L甘氨酸2 mg/L玉米素赤霉素6-苄氨基腺嘌呤吲哚乙酸0-0.5 mg/L 0.1~1.0 mg/L 0-0.2 mg/L 0-0.1 mg/L吲哚丁酸0~0.2mg/L(4)蔗糖30g/L ；(5)倍力凝4g/L。
5.如权利要求4所述的用于培养马铃薯茎尖无愈伤成苗的培养基，其特征是，包括以下组分(1)无机物大量元素硝酸钾 2108 mg/L 硝酸铵 1650 mg/L 磷酸二氢钾 170 mg/L 硫酸镁 370 mg/L 氯化钙 440 mg/L;微量元素碘化钾 0.83 mg/L 硼酸 6.0 mg/L 硫酸锰 16.9 mg/L 硫酸锌 9.6 mg/L 钼酸钠 0.25mg/L 硫酸铜 0.025mg/L 氯化钴 0.025mg/L 硫酸铁 27.8 mg/L 乙二胺四乙酸二纳37.3 mg/L;(2)有机物谷氨酰胺250 mg/L水解酪蛋白100 mg/L酵母提取物250 mg/L肌醇100 mg/L烟酸0.5 mg/L盐酸吡哆醇0.5 mg/L盐酸硫胺素0.1 mg/L甘氨酸2 mg/L；(3)植物激素玉米素 0. 2 0. 5mg/L 赤霉素 0. 1. Omg/L 吲哚丁酸O 0. lmg/L ；(4)蔗糖30g/L ；(5)倍力凝4g/L
6.如权利要求1 5任一项所述的用于培养马铃薯茎尖无愈伤成苗的培养基的配制方法，其特征是，按照配方准确称量各组分，所用试剂为分析纯，加去离子水充分溶解，定容， 调整pH至5. 8 6. 0，分装，121°C灭菌15分钟。
全文摘要
本发明公开了一种用于马铃薯茎尖无愈伤成苗的固体培养基，属于农业生物技术领域。它包括以下组分硝酸钾、硝酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙、碘化钾、硼酸、硫酸锰、硫酸锌、钼酸钠、硫酸铜、氯化钴、硫酸铁、乙二胺四乙酸二纳、烟酸、盐酸吡哆醇、甘氨酸、谷氨酰胺、水解酪蛋白、酵母提取物、蔗糖、6-苄氨基腺嘌呤、玉米素、吲哚乙酸、吲哚丁酸、赤霉素、倍力凝。该培养基用于马铃薯茎尖的培养，试验效果好，基本无愈伤组织产生，成苗率高，大大减少了茎尖再生植株的变异，保证了马铃薯品种的完整的原始性状和遗传背景；并且这种培养方式采用一步成苗法，较原有方式缩短了培养时间，降低了污染几率。
文档编号A01H4/00GK102405831SQ201110233008
公开日2012年4月11日 申请日期2011年8月15日 优先权日2011年8月15日
发明者刘芳, 杨元军, 王培伦, 董道峰, 陈广侠, 马伟清, 马蕾 申请人:山东省农业科学院蔬菜研究所