专利名称：一种茶树无性系离体再生培养的方法
技术领域：
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及到一种茶树组织培养再生体系建立的方法。
背景技术：
茶[Camellia sinensis (L. ) 0. Kuntze]是世界三大饮料之一，因富含茶氨酸、儿茶素和咖啡碱而具药理和保健功能。茶树生产常因遭遇低温、病虫害等各种逆境而面临严峻挑战，使得生产者和企业遭受严重损失。茶自交不亲和，遗传背景高度复杂，又因结实率低，常常得不到杂交种子，给育种研究带来很大困难，因而茶树育种至今仍以单株选育为主，这使得茶育种工作不仅周期长， 难度大，而且盲目性也大。无性系遗传转化可以克服上述缺陷，在较短的时间内，不改变原品种的特性，人为定向培育具有优良特异性状的新品种。因此，建立适于茶无性系品种的高效离体再生方法对应用生物技术定向培育具有优良特异性状的茶树新品种十分必要。茶因多年生木本作物和富含酚类化合物，这使得接种后外植体污染和褐化程度严重；又因无性系器官或组织多为已分化成熟细胞，在后续培养过程中较幼胚或种子等幼嫩组织的脱分化和再分化困难很多。目前，有关茶离体再生体系的成功报道多数是建立在幼胚或种子等外植体之上的，而茶自交不亲和，杂交后代性状广泛分离，幼胚或种子的遗传性状已远不同于其亲本，因此对茶品种的定向改良意义不大，且这种再生体系不适于无性系外植体。为此，人们不断尝试利用茶无性系器官或组织进行离体再生体系的建立，直至1996 年，Kato. M利用茶幼叶为外植体获得了离体再生植株，但其外植体诱导体细胞胚胎及体胚再分化为植株的百分率分别只有6%和7. 1%；2001年，桑达尔同样利用茶叶片为外植体进行再生体系的建立，再生率也只有30% ；2005年，Aoshima以茶新梢顶点为外植体，在附加低浓度潮霉素(5mg/L)培养基上获得了 43%的分化率，而对照只有4%，当潮霉素浓度达 40mg/L时，再生率为0，这种再生方法对以抗生素作为筛选标记进行遗传转化时意义不大。 综上所述，迄今为止建立在茶无性系器官或组织上的再生体系中外植体再生率都较低，难以满足遗传转化需要。因此，建立茶无性系器官或组织的高效离体再生体系对利用遗传转化方法培育茶新品种极为必要。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效的茶离体再生培养方法，为茶规模化快繁和遗传转化体系的建立奠定基础。经过大量的试验研究，发明了以离体生长的新梢基部为外植体， 采用新梢-新梢基部愈伤-芽的分化-新梢延伸的方法，在再生培养基1上诱导愈伤，在再生培养基2上进行芽的分化和延伸，建立高频稳定的茶再生体系。本发明愈伤诱导率达 100 %，芽再分化率达67.4%，愈伤再生系数高(> 10个芽/外植体)，生根率达70. 8 %，是一种可直接用于茶遗传转化的高频再生体系。
本发明的具体操作步骤如下(1)选择外植体从田间采集茶[Camellia sinensis (L. ) 0. Kuntze]的新梢，经自来水冲洗干净；(2)杀灭表面菌将洗净的新梢切成带芽的单芽茎段，在超净台中先浸入浓度70%的乙醇溶液 30s ；接着置于含有0. 吐温的浓度0. 的升汞溶液浸泡7-lOmin，并不断搅动，最后用无菌水冲洗，作为茶树初代培养的外植体；(3)初代培养将上述外植体接种在初代培养基上，置于23-27°C、光照时间16h/d、光照强度 800-20001x条件下进行培养；每4周继代转接一次；所述初代培养基为1/2MS加入BA 8. 88 μ M 禾Π ΙΒΑ0. 49 μ M ；(4)离体再生将培养获得的新梢转入再生培养基1，3-4周后，新梢基部形成愈伤，将带有愈伤的新梢转入再生培养基2，直至从新梢基部愈伤上不断分化出新芽；培养条件为23-27°C、 光照时间16h/d、光照强度800-20001x ；所述再生培养基1为:1/2MS加入TDZ 0. 05-0. 1 μ M 和IBA 0. 49 μ M ；所述再生培养基2为1/2MS加入BA 8. 88 μ M和IBA 0. 49 μ M ；(5)新梢延伸新梢基部愈伤分化出的新芽需在愈伤上进行延伸，延伸培养基为再生培养基2; 待愈伤分化的新芽延伸为2-3cm的新梢时，将新梢从愈伤上切除，继续用于离体再生，再生条件、培养条件同步骤⑷；(6)生根培养切取步骤(5)中形成的新梢，用Μ50μΜΙΒΑ处理新梢基部5min，再接种于生根培养基，培养条件同步骤G)，所述生根培养基为1/4MS加入0. 活性炭；(7)移栽将步骤(6)中生根的茶无性系组培苗移栽至营养土中。本发明技术方案中步骤(1)中新梢剪除叶片，每一节位留下叶柄保护腋芽，经自来水冲洗干净后，转入每升滴加2-3滴洗涤剂的自来水中浸泡15-20min，边浸泡边晃动，再用自来水冲洗干净。步骤O)中经表面灭菌后的单芽茎段需置入无菌的0.2%聚乙烯吡咯烷酮中，聚乙烯吡咯烷酮为过滤除菌后使用。初代培养中外植体接种后先置于10_15°C避光2-3天，再置于23_27°C、光照时间 16h/d、光照强度800-20001χ条件下进行培养。步骤中的愈伤是新梢基部经脱分化而形成的愈伤；该步骤中的新芽是新梢基部脱分化而来的愈伤经再分化而形成的。步骤中的愈伤在再生培养基1上诱导出来后，需转至再生培养基2上进行芽的进一步分化和延伸。步骤(5)和(6)中的新梢是步骤(4)中的愈伤再生出的新芽在愈伤上延伸生长而来的。所述初代培养基、再生培养基1、再生培养基2和生根培养基灭菌前均于50-60°C下,调节pH至5. 8，且均于121°C、104kPa下灭菌18_20min。本发明首次报道了经新梢基部形成愈伤诱导不定芽的茶再生体系。本发明的有益技术效果体现在以下方面1、本发明外植体经表面灭菌后，为降低褐化率，灭菌后外植体先置于无菌的0. 2% 聚乙烯吡咯烷酮(PVP)中，接种在初代培养基上后，再10-15°c避光2-3天，可有效减轻褐化程度。2、本发明新梢基部愈伤形成率为100%，愈伤再分化率达67. 4%，愈伤再生系数高(> 10个芽/外植体)，分化出的芽生长健壮，经M50 μ M IBA处理5min后转移至生根培养基，3-4周生根率达70. 8 %，移栽成活率达70 %。3、与现有的茶无性系器官或组织再生体系相比，本发明提供了一个高再生率和高再生系数的茶无性系的再生体系，为利用遗传转化方法进行茶品种的定向改良提供了技术
D ο
图1 以单个带芽茎段为外植体在1/2MS+BA 8. 88 μ Μ+ΙΒΑ 0. 49 μ M培养基上获得的新梢。图2 新梢基部在1/2MS+TDZ 0. 05-0. 1 μ Μ+ΙΒΑ0. 49 μ M培养上诱导的愈伤。图3 在1/2MS+TDZ 0. 05-0. 1 μ Μ+ΙΒΑ0. 49 μ M培养上诱导的新梢愈伤，转入 1/2MS+BA8. 88 μ Μ+ΙΒΑ 0. 49 μ M培养基上进行芽的再生和新梢延伸。图4 延伸的新梢基部经Μ50 μ M IBA处理5min后转入添加了 0. 活性炭的 1/4MS培养基上进行生根培养，获得的生根苗。图5 再生苗移栽入营养土后3个月长成的小植株。本发明要建立再生体系必须先在培养基1/2MS+TDZ 0. 05-0. 1 μ Μ+ΙΒΑ 0. 49 μ M 上诱导新梢基部愈伤组织，3-4周后将带有愈伤的新梢转移至1/2MS+BA 8. 88 μ Μ+ΙΒΑ 0. 49 μ M上进一步诱导芽和进行芽的延伸，当芽长成2-3cm的新梢时，可从愈伤上切下继续进行新梢基部愈伤诱导和芽的诱导及延伸。每一块愈伤上可诱导出十多个甚至数十个不定芽，芽的再生系数很高。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步地说明。本发明的特点和优点将随着描述而更清楚，但这示例性的实施例仅仅用来说明本发明，并不对本发明的范围构成任何限制。实施例(1)选择外植体申请人:在春季4-5月从安徽农业大学农业园茶园采集茶[Camellia sinensis (L. )0. Kuntze]品种‘龙井43’的新梢，剪除叶片留下叶柄保护芽，经自来水冲洗干净；转移至每升滴加2-3滴立白洗涤剂的自来水中漂洗15-20min，再用自来水冲洗干净后作为离体再生的外植体备用。试验结果表明，采用成熟度合适的新梢作为外植体可减轻褐化，提高成活率。(2)杀灭表面菌
将洗净的新梢切成带芽的单芽茎段，在超净台中先浸入浓度70%的乙醇溶液30s，边浸泡边晃动；接着置于浓度0. 的升汞(HgCl2)(含0. 1 %吐温)溶液浸泡 7-lOmin，并不断搅动，最后用无菌水冲洗5次，放入无菌的0.2%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)中， 作为茶初代培养的外植体。试验结果表明，在进行70%乙醇和0. 升汞灭菌时，边灭菌边晃动，可提高灭菌效果；将灭菌后的外植体在接种之前浸泡于0. 2%聚乙烯吡咯烷酮(PVP) 中，可有效减轻褐化程度。0.2%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)为过滤灭菌。(3)初代培养将上述外植体接种在1/2MS+BA 8. 88 μ Μ+ΙΒΑ 0. 49 μ M培养基上，10-15°C避光 2-3天后，置于23-27°C、光照时间16h/d、光照强度800-20001x条件下进行培养；每4周继代转接一次。试验结果表明，接种后10_15°C避光培养2-3天可有效减轻褐化程度；在此培养基上培养一段时间后，无菌外植体可萌发成新梢(附图1)。(4)离体再生将培养获得的新梢转入1/2MS+TDZ 0. 05-0. 1 μ Μ+ΙΒΑ0. 49 μ M培养基中，3_4周后，新梢基部形成愈伤，将带有愈伤的新梢转入1/2MS+BA 8. 88 μ Μ+ΙΒΑ 0. 49 μ M培养基中，2-3周后，从新梢基部愈伤上不断分化出新芽。培养条件为23-27°C、光照时间16h/d、光照强度800-20001x。试验结果表明，新梢基部需在1/2MS+TDZ 0. 05-0. 1 μ Μ+ΙΒΑ 0. 49 μ M 培养基上诱导愈伤，愈伤诱导率为100% (附图2)；而1/2MS+BA 8. 88 μ Μ+ΙΒΑ0. 49 μ M培养基更利于芽的诱导，诱导出的芽生长健壮，芽的诱导率为67. 4%，每块愈伤芽的再生系数可达10个以上甚至数十个(附图3)。(5)新梢延伸新梢基部愈伤分化出的新芽需在愈伤上进行延伸，延伸培养基为V2MS+BA 8. 88 μ Μ+ΙΒΑ 0. 49 μ M ；培养条件为23_27°C、光照时间16h/d、光照强度800_20001x，待由愈伤分化的新芽延伸为2-3cm左右的新梢时，将新梢从愈伤上切除，继续用于离体再生， 再生条件、培养条件同G)。试验结果表明，愈伤上分化的新芽需连同愈伤一起在培养基 1/2MS+BA8. 88 μ Μ+ΙΒΑ 0. 49 μ M上进行芽的伸长生长(附图3)。(6)生根培养切取步骤(5)中形成的新梢，用Μ50μΜ IBA处理新梢基部5min，再接种于添加了 0. 活性炭的1/4MS培养基中进行生根培养，培养条件同0)。试验结果表明，3-4周生根率达70. 8%，所有根基部均无愈伤，系直接从新梢基部维管组织发育而来(附图4)。(7)移栽将步骤(6)中生根的茶无性系组培苗移栽至营养土中，移栽成活率达70% (附图 5)。上述步骤中所有培养基灭菌前均于50_60°C下，调节pH至5. 8，且均于121 V、 104kPa 下灭菌 18-20min。
权利要求
1.一种茶树无性系离体再生培养的方法，其特征在于包括以下步骤(1)选择外植体从田间采集茶的新梢，经自来水冲洗干净；(2)杀灭表面菌将洗净的新梢切成带芽的单芽茎段，在超净台中先浸入浓度70%的乙醇溶液30s;接着置于含有0. 吐温的浓度0. 的升汞溶液浸泡7-lOmin，并不断搅动，最后用无菌水冲洗，作为茶树初代培养的外植体；(3)初代培养将上述外植体接种在初代培养基上，置于23-27 °C、光照时间16h/d、光照强度 800-20001x条件下进行培养；每4周继代转接一次；所述初代培养基为1/2MS加入BA 8. 88 μ M 禾Π ΙΒΑ0. 49 μ M ；(4)离体再生将培养获得的新梢转入再生培养基1，3-4周后，新梢基部形成愈伤，将带有愈伤的新梢转入再生培养基2，直至从新梢基部愈伤上不断分化出新芽；培养条件为23-27°C、光照时间16h/d、光照强度800-20001x ；所述再生培养基1为:1/2MS加入TDZ 0. 05-0. 1 μ M禾口 IBA 0. 49 μ M ；所述再生培养基 2 为:1/2MS 加入 BA 8. 88 μ M 和 IBA 0. 49 μ M ；(5)新梢延伸新梢基部愈伤分化出的新芽需在愈伤上进行延伸，延伸培养基为再生培养基2;待愈伤分化的新芽延伸为2-3cm的新梢时，将新梢从愈伤上切除，继续用于离体再生，再生条件、培养条件同步骤⑷；(6)生根培养切取步骤(5)中形成的新梢，用Μ50μΜ IBA处理新梢基部5min，再接种于生根培养基，培养条件同步骤G)，所述生根培养基为1/4MS加入0. 活性炭；(7)移栽将步骤(6)中生根的茶无性系组培苗移栽至营养土中。
2.根据权利要求1所述的一种茶树无性系离体再生培养的方法，其特征在于所述步骤(1)中新梢剪除叶片，每一节位留下叶柄保护腋芽，经自来水冲洗干净后，转入每升滴加 2-3滴洗涤剂的自来水中浸泡15-20min，边浸泡边晃动，再用自来水冲洗干净。
3.根据权利要求1所述的一种茶无性系离体再生培养的方法，其特征在于所述步骤(2)中经表面灭菌后的单芽茎段需置入无菌的0.2%聚乙烯吡咯烷酮中，聚乙烯吡咯烷酮为过滤除菌后使用。
4.根据权利要求11所述的一种茶无性系离体再生培养的方法，其特征在于所述步骤(3)初代培养中外植体接种后先置于10-15°C避光2-3天，再置于23-27°C、光照时间16h/ d、光照强度800-20001X条件下进行培养。
5.根据权利要求1所述的一种茶无性系离体再生培养的方法，其特征在于所述步骤(4)中的愈伤是新梢基部经脱分化而形成的愈伤；该步骤中所述的新芽是新梢基部脱分化而来的愈伤经再分化而形成的。
6.根据权利要求1所述的一种茶无性系离体再生培养的方法，其特征在于所述步骤 (4)中的愈伤是在再生培养基1上诱导出来后，需转至再生培养基2上进行芽的进一步分化和延伸。
7.根据权利要求1所述的一种茶无性系离体再生培养的方法，其特征在于所述步骤 (5)和(6)中的新梢是步骤中的愈伤再生出的新芽在愈伤上延伸生长而来的。
8.根据权利要求1所述的一种茶无性系离体再生培养的方法，其特征在于所述初代培养基、再生培养基1、再生培养基2和生根培养基灭菌前均于50-60°C下，调节pH至5. 8， 且均于 121°C、104kPa 下灭菌 18_20min。
全文摘要
本发明公开了一种茶树无性系离体再生培养的方法。该方法包括外植体选择、杀灭表面菌、初代培养、继代再生、新梢延伸和生根培养操作步骤。茶是一种富含有益人体健康的次生代谢物质的多年生木本作物，种子系有性杂交后代且自交不亲和，传统的育种方法育种周期长，效率低，无法实现品种的定向快速改良；现有的无性系再生方法再生率低，无法满足遗传转化对高频再生体系的需要。本发明方法简便易行，再生效率高，再生体系完善，为利用现代生物技术培育茶新品种提供了重要的技术支持。
文档编号A01H4/00GK102422810SQ20111025872
公开日2012年4月25日 申请日期2011年9月2日 优先权日2011年9月2日
发明者孙俊, 宛晓春, 张正竹, 朱善玉, 汤志近, 石冠华, 雷攀登 申请人:安徽农业大学