专利名称：一种集胞藻蛋白在改良水稻性状中的新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域中一种集胞藻蛋白在改良水稻性状中的新用途。
背景技术：
近年来，由于能源短缺，发展以粮食为基础的替代能源加剧了粮食紧缺。2008年末，世界谷物库存已降至4. 05亿吨，是近25年来的最低水平。海地、菲律宾和埃及等37个国家曾因粮食价格急剧上涨引发抗议和骚乱。因此，提高作物产量、保障粮食供给与价格稳定，对维护世界的和平与安定，具有十分重要的战略意义。在我国，可耕地面积日益减少，因此提高主要农作物单位面积产量，是解决我国粮食问题最现实、最有效、最根本的途径。由于作物中90%以上的干物质来源于光合作用，因此，作物产量的高低很大程度上取决于其光合效率。
蓝藻是古老的光合生物，具有特有的二氧化碳浓缩机制(CCM)。通过该机制能够提高CO2同化的关键酶Rubisco活性部位周围的CO2浓度，克服自身Rubisco对CO2的低亲和力，有效的同化CO2，从而提高光合作用效率。集胞藻(Synechocystis PCC6803)是蓝藻生物学研究的模式藻种。过去的研究发现，将集胞藻与CCM机制相关基因转入高等植物拟南芥，能够提高其光合效率并且改善水分利用效率。这一作用机制在以水稻为代表的单子叶植物中是否有效仍不清楚。
发明内容
本发明的一个目的是提供序列表中序列2所示的蛋白在提高植物叶绿素含量和/或植物抽穗率中的应用。本发明提供了序列表中序列2所示的蛋白在提高植物叶绿素含量和/或植物抽穗率中的应用。所述植物为单子叶植物或双子叶植物；所述单子叶植物为水稻。本发明的另一个目的是提供序列表中序列2所示的蛋白的编码基因在提高植物叶绿素含量和/或植物抽穗率中的应用。本发明提供了序列表中序列2所示的蛋白的编码基因在提高植物叶绿素含量和/或植物抽穗率中的应用；所述蛋白的编码基因为如下1)-3)中任一所述的基因I)序列表中序列I所示的DNA分子；2)在严格条件下与I)所不的DNA分子杂交且编码所述蛋白的DNA分子；3)与I)或2)所述的DNA分子具有90%以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子。所述植物为单子叶植物或双子叶植物；所述单子叶植物为水稻。本发明的又一个目的是提供含有序列表中序列2所示蛋白的编码基因的重组表达载体在提高植物叶绿素含量和/或植物抽穗率中的应用。本发明提供了含有序列表中序列2所不蛋白的编码基因的重组表达载体在提闻植物叶绿素含量和/或植物抽穗率中的应用。所述植物为单子叶植物或双子叶植物；所述单子叶植物为水稻；所述重组表达载体为在pH7WG2D，l载体的att R位点插入了序列表中序列2所示蛋白的编码基因得到的重组表达载体。本发明的又一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。本发明所提供的培育转基因植物的方法，是将序列表中序列2所示的蛋白的编码基因导入目的植物中，得到转基因植物；所述转基因植物与所述目的植物相比叶绿素含量和/或抽穗率提高。
所述序列表中序列2所示的蛋白的编码基因是通过含有序列表中序列2所示蛋白的编码基因的重组表达载体导入目的植物中的。所述含有序列表中序列2所不蛋白的编码基因的重组表达载体为在pH7WG2D, I载体的att R位点插入了序列表中序列2所示蛋白的编码基因得到的重组表达载体。所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物；所述单子叶植物为水稻。序列表中序列2所示的蛋白在提高植物光合作用能力中的应用也属于本发明的保护范围。本发明从集胞藻(Synechocystis PCC 6803)中克隆了一个与集胞藻碳酸氢钠转运相关的蛋白复合体基因slrl512。将该基因导入水稻的转基因实验证明，转入slrl512基因的水稻叶绿素含量和抽穗率明显提高，说明slrl512基因及其编码产物对于培育光合作用增强的作物新品种具有重要的理论及实际意义，可用于农业高产植物品种的培育。
图1为重组表达载体pH7WG2D，l_slrl512的示意图。图2为Ttl代转sir 1512基因水稻植株的PCR检测结果。图3为转基因T1代萌发种子的GFP荧光检测。图4为转slrl512基因水稻T1代叶绿素含量和抽穗率分析结果。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、过表达sir 1512基因提高转基因水稻的叶绿素含量和抽穗率一、slrl512过表达水稻植株的获得和鉴定1、过表达slrl512基因载体的构建提取对数生长期的集胞藻(Synechocystis PCC 6803)(公众可从中国科学院植物研究所获得，记载过该材料的非专利文献是Zhang LF et al. Proteomic analysis ofplasma membranes of cyanobacterium Synechocystis sp. Strain PCC 6803 in responseto high pH stress. J Proteome Res. 2009)细胞的DNA，以其为模板，通过PCR进行扩增基因slrl512，该基因在转基因受体植物水稻中未发现高同源性基因。将PCR扩增产物经电泳分离回收后，连接到基因克隆载体PMD18并转化大肠杆菌，对获得的单克隆菌落的质粒测序分析。
扩增引物上游引物F :5’ -ATGGATTTTTTGTCCAATTTCTTGACG-3’,下游引物 R :5’ -TTAACCTGCACCAAGGGTCTG-3’。反应体系DNA (I y g/ y L)1. 0 y L，上游引物 F 和下游引物 R(IOiiM)各1. Oii L，dNTP(2. 5mM)4. Ou L, ddH20 37. 5 y L，rTaqO. 5 y L(Takara 公司)，10XPCR buffer (Mg2+Plus) 5 ii L。反应程序94 °C 4min, (94 °C 30s, 50 °C 30s, 72 °Clmin) 30cycles, 72°C lOmin。PCR产物纯化回收(TIANgen Midi Purification Kit 琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒)。将上述回收产物与克隆载体pMD18 (Takara pMD18_T VECTOR试剂盒)连接后转化大肠杆菌进行测序。测序结果表明该PCR产物与NCBI数据库中slrl512基因(Gene ID 954687)序列相同。slrl512基因的核昔酸序列为序列表中序列I所不，该基因的编码区为序列表中序列I自5’末端第1-1125位核苷酸，该序列所编码的Slrl512蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。将回收得到的PCR 产物连接到 PCR8/GW/T0P0 载体(PCR8/GW/T0P0 TACL0NINGKIT购买于Invitrogen公司，目录号K252002)att L位点上，连接后转化大肠杆菌进行 测序，测序结果表明，在PCR8/GW/T0P0载体的att L位点上插入了序列表中序列I所示的核苷酸序列。利用LR Clonase II (购买于Invitrogen公司，目录号11791-020),通过位点特异重组将目的基因整合到表达载体PH7WG2D，I (公众可从中国科学院植物研究所获得，记载过该材料的非专利文献是Zhubo Dai et al, Cloning and characterizationof a novel 3-hydroxy-3-methylglutaryI coenzyme A reductase genefrom S alviamiltiorrhiza involved in diterpenoid tanshinone accumulation. Journal ofPlantPhysiology [J]. 2011)的att R位点，得到目的质粒。将目的质粒转化大肠杆菌后，挑取单克隆进行PCR检测(上游引物F CGGAAGATAATCGGGTCAAA,下游引物R :GGCAGATGGGATACCTGCTC)，获得了 407bp的扩增产物。同时，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明在载体PH7WG2D，I的attR位点插入了序列表中序列I所示的slrl512基因片段，证明质粒构建正确，将重组载体命名为pH7WG2D，
l-slrl512(图1，p35S :启动子，T35S :终止子，HygB :潮霉素抗性基因，Sm/SpR :壮观霉素抗性基因，EgfpER:绿色荧光蛋白基因，prolD :来自农杆菌的根表达启动子)。重组载体pH7WG2D，l-slrl512是以组成性表达的35S为启动子，增强型的绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因，具有潮霉素和壮观霉素抗性基因，可通过潮霉素和壮观霉素进行筛选。2、含目的基因的农杆菌的获得提取验证正确的克隆中的重组质粒pH7WG2D，l_slrl512，通过电击转化法，把重组质粒pH7WG2D，l-slrl512转入农杆菌(A. tumefaciens)菌株EHA105 (公众可从中国科学院植物研究所获得，记载过该材料的非专利文献是Y.-M. Bi et al. Resistance to Botrytiscinerea in scented geranium transformed with a gene encoding the antimicrobialprotein Ace-AMPl. Plant Cell Reports [J] 1999)。具体方法如下取2mL农杆菌(A. tumefaciens)EHA105菌液转接于IOOmL LB液体培养基(含50^8/1^链霉素)中，281250印111振荡培养至0D600在0. 5到I之间。将农杆菌菌液转入无菌50mL离心管中，AUOOOrpm离心5min，去上清液。用20mL预冷的HEPES (lmM，pH7. 0)重悬，4°C、4000rpm离心5min，去上清液，重复2 3次。用2mL预冷的10%甘油重悬。每管100 u L分装于1. 5mL无菌Eppendorf管中。加入2 u L重组载体pH7WG2D，l_slrl512质粒于上述Eppendorf管中，用枪头轻轻搅拌混勻。取出细胞与质粒的混合物转入电击杯中(_20°C预冷)，在2500V 5ms下电击。取出电击杯，加入500 u L预冷的LB培养基，轻轻吹打混匀，吸出菌液转入1.5mL离心管中，28°C，200rpm培养2h。将菌液涂布于平板上(链霉素50 u g/mL,潮霉素50 u g/mL、壮观霉素50 u g/mL) 28 V 2天，挑取单克隆进行PCR检测(上游引物 F CGGAAGATAATCGGGTCAAA,下游引物 R GGCAGATGGGATACCTGCTC)。将正确的菌株用于水稻的转化。3、转基因水稻的获得水稻(中花11)(公众可从中国科学院植物研究所获得，记载过该材料的非专利文献是朱旭东.水稻中花11辐射突变体的分离与鉴定.中国水稻科学[J].2003)种子去壳用30% NaClO浸15min，用ImL枪将残留的溶液吸干净。重复该步骤，无菌水冲洗3_5次。用ImL枪将残留的水吸干净。将灭菌后的种子接种于N6D培养基上，32°C持续光照培养一周左右。去除芽和残留胚乳继代培养的很小的颗粒愈伤(10-20天)用于转化。将转 A pH7WG2D, l-slrl512 载体的农杆菌 EHA105 菌株，在 YEB+Rif (25_50mg/L) +Kan (50mg/L)培养基上28°C暗培养2 3天。挑单菌落于3 5mL YEB+Kan+Rif培养基中，28°C暗培养约24h。取500 ii L接于50mL AAM培养基中，过夜培养至0D600约0.1。将上述去除芽和残留胚乳进行继代培养的愈伤组织浸于农杆菌菌液中，立即用镊子取出置于无菌滤纸上吸去多余菌液，吹干。愈伤接于N6D-As培养基(N6D培养基中含有10mg/mL乙酰丁香酮)，培养基上预先垫一层浸有AAM(0.5mL即可)的无菌滤纸。用保鲜膜将培养皿包好置于25°C暗培养3天。共培养后的愈伤先用无菌水冲洗2-3次，再用含500mg/L羧苄的无菌水冲洗
2-3次，并用之浸泡30min左右(若浸染愈伤的菌液浓度0D600 > 0. 1，可将浸泡时间增加到Ih左右，30min左右更换一次)。无菌滤纸上吸去水分，并吹干。接种于含50mg/L潮霉素B和400mg/L羧苄的N6D-S培养基(用于选择阳性克隆，N6D培养基中加入50mg/L潮霉素B和400mg/L羧苄)上32°C持续光照培养两周。将生长旺盛的愈伤转移到含50mg/L潮霉素B和250mg/L羧苄的再生培养基上32°C持续光照培养诱导分化。转移分化出的幼苗至含50mg/L潮霉素B和200mg/L羧苄的MS-HF (在MS培养基中加入30g/L蔗糖)培养基上诱导生根，从而得到Ttl代转基因水稻株系。共侵染270个愈伤组织，得到了 50个带有报告基因的愈伤组织。按照获得转slrl512基因水稻的方法，用空载体pH7WG2D，I转化水稻植株，得到转空载体对照水稻Ttl代植株。同时，设水稻(中花11)为野生型对照。提取Ttl代转基因水稻株系的基因组DNA并通过PCR对外源基因进行分子检测(上游引物 F :CGGAAGATAATCGGGTCAAA，下游引物 R :GGCAGATGGGATACCTGCTC)，检测结果见图2(图2中泳道M :D2000，泳道CK :转空载体水稻，泳道wt :中花11，泳道1-泳道25 :转基因水稻株系)，从图2中可见，与转空载体对照水稻Ttl代植株和野生型对照水稻相比，Ttl代转基因水稻植株中均获得了 407bp的目的基因片段，说明泳道1-泳道25均为阳性转基因植株，共获得阳性转基因植株25株。将上述25株Ttl代转基因水稻进行自交获得其种子(即T1代转基因水稻)。对19个株系T1代幼苗的报告基因GFP进行检测，检测方法如下将Ttl代种子(即1\代)置于30°C，黑暗条件下萌发后，用400nm激发波激发并在470nm发射波下，观察是否有绿色荧光。结果如图3所示(图3中，A :转入基因水稻，B :中花11)，在转基因水稻中观察到绿色荧光蛋白所发出的绿色，而野生型对照水稻中花11中未观察到绿色。选取遗传性状分离比为3 :1的株系(表I)，并将该株系中有报告基因GFP表型的T1代转基因水稻苗的成活幼苗移至温室培养。结果共获得了 16株T1代转slrl512基因阳性株系。 表I转基因T1代分离比及拷贝数分析
权利要求
1.序列表中序列2所示的蛋白在提高植物叶绿素含量和/或植物抽穗率中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述植物为单子叶植物或双子叶植物；所述单子叶植物为水稻。
3.序列表中序列2所示的蛋白的编码基因在提高植物叶绿素含量和/或植物抽穗率中的应用；所述蛋白的编码基因为如下1)-3)中任一所述的基因1)序列表中序列I所不的DNA分子；2)在严格条件下与I)所示的DNA分子杂交且编码所述蛋白的DNA分子；3)与I)或2)所述的DNA分子具有90%以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述植物为单子叶植物或双子叶植物；所述单子叶植物为水稻。
5.含有序列表中序列2所不蛋白的编码基因的重组表达载体在提闻植物叶绿素含量和/或植物抽穗率中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述植物为单子叶植物或双子叶植物；所述单子叶植物为水稻。
7.一种培育转基因植物的方法，是将序列表中序列2所示的蛋白的编码基因导入目的植物中，得到转基因植物；所述转基因植物与所述目的植物相比叶绿素含量和/或抽穗率提闻。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述序列表中序列2所示的蛋白的编码基因是通过含有序列表中序列2所示蛋白的编码基因的重组表达载体导入目的植物中的。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物；所述单子叶植物为水稻。
10.序列表中序列2所示的蛋白在提高植物光合作用能力中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种集胞藻蛋白在改良水稻性状中的新用途。本发明提供了序列表中序列2所示的蛋白在提高植物叶绿素含量和/或植物抽穗率中的应用。本发明还提供了序列表中序列2所示的蛋白的编码基因在提高植物叶绿素含量和/或植物抽穗率中的应用。本发明将slr1512基因导入水稻的转基因实验证明，转入slr1512基因的水稻叶绿素含量和抽穗率明显提高，说明slr1512基因及其编码产物对于培育光合作用增强的作物新品种具有重要的理论及实际意义，可用于农业高产植物品种的培育。
文档编号A01H5/00GK102993284SQ20111027094
公开日2013年3月27日 申请日期2011年9月14日 优先权日2011年9月14日
发明者黄芳, 杨浩萌, 赵乐, 薛哲勇, 周荷益, 漆小泉 申请人:中国科学院植物研究所