专利名称：一种用于防治室内微生物污染的负载伊曲康唑-溶菌酶电纺纤维膜的制作方法
一种用于防治室内微生物污染的负载伊曲康唑-溶菌酶电纺纤维膜技术领域
本发明属于环境微生物污染控制技术领域，具体涉及一种共固定化抗生素和溶菌酶用于室内微生物污染防治的新型膜功能材料。
背景技术：
细菌、真菌等微生物无处不在、无孔不入，其生存空间与人们日常生活息息相关， 如空调、电脑、电话机等生活用具均为微生物的栖息地。由于这些设备使用频率高、使用人员复杂、消毒灭菌不及时，被微生物污染的趋势愈来愈严重，特别是病原微生物，严重的威胁着人们的身心健康，已夺取了成千上万人的生命。生活用品的微生物的污染与控制已经成为环境保护的一项重要内容，引起越来越多人的重视。
溶菌酶(lysozyme)又称胞壁质酶，是一种专门作用于细菌细胞壁的水解酶，主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β -1，4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶广泛存在于生物组织中，作为一种无毒蛋白质，能选择性地分解微生物的细胞壁又不破坏其它的组织。且溶菌酶抗菌谱较广，不仅对G+菌有很好的灭菌效果，对G—也有很好的抑制效果。 溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。因其具有抑菌效果好、抗热抗酸、活力稳定、安全性高、生产成本低等优点而被广泛用于各种微生物控制领域。伊曲康唑(itraconazole，ICZ)是一种亲脂性三氮唑类广谱抗真菌药，其作用机制是高选择性地抑制真菌细胞的细胞色素酶，依赖酶的活性，导致真菌细胞膜损伤，从而使真菌细胞死亡。亦可抑制真菌细胞膜的主要成份之一麦角留醇的合成，从而发挥抗真菌效应。对包括酵母菌、霉菌等在内的大部分真菌有很好的抑制效果。同时选择使用这两种抗微生物药剂能高效、安全的控制细菌和真菌等绝大部分微生物的滋生，因二者作用机制和作用对象明显不同，理论上同时使用不会发生拮抗作用，然而游离药剂的应用存在技术上的困难，且不能回收利用，易对环境造成二次污染，限制了其在家电维护方面的使用。
电纺纤维膜是以高分子聚合物为原料，利用电纺技术制备而得到的。该技术是一种应用高压电使带电荷的高分子溶液或熔体在静电场中流动或变形，然后由于溶剂蒸发或熔体冷却而固化，最终产生直径数十纳米到几十毫米的纤维的过程。电纺纤维膜具有比表面积大、孔隙率高和吸附性能强等优点，是一种潜在的酶固定化基质。将其作为固定化酶的载体，有利于酶与底物充分接触，能有效提高酶的催化效率，且容易从反应体系中分离回收。伊曲康唑作为一种具有三唑环的唑类抗生素，固定化后不会影响其抑菌效力，且解决了其不能回收利用、易流失等缺点。制备电纺纤维膜所用的高分子聚合物可以选用可生物降解的亲水性高分子材料(如聚乙烯醇)，这类材料在自然界中可逐渐完全降解为二氧化碳和水，并不会对环境造成二次污染，是一种环境友好材料。负载伊曲康唑-溶菌酶电纺纤维膜能同时抑制细菌和真菌的滋生，将其应用于家电设备的微生物污染防治方面，相比其它的微生物防治技术，具有高效、便捷、无二次污染等优点，为微生物防治技术提供了一种新的思路，有着广阔的应用前景。发明内容
本发明的目的在于提供一种新型的用于防治室内微生物污染的负载伊曲康唑-溶菌酶电纺纤维膜，即利用静电纺丝技术将溶菌酶和伊曲康唑直接共固定于聚乙烯醇纳米纤维中，得到负载伊曲康唑-溶菌酶电纺纤维膜。该纤维膜利用溶菌酶的广谱杀菌效果以及伊曲康唑的高效抗真菌效果，抑制大多数微生物的滋长，此方法在于安全、便捷、高效的达到抑菌效果。
本发明是通过采用以下的技术方案来实现上述发明目的
本发明所提供的用于防治室内微生物污染的负载伊曲康唑-溶菌酶电纺纤维膜是以高分子量的聚乙烯醇为原料，通过静电纺丝技术制备得到载有溶菌酶和伊曲康唑的电纺纤维膜，然后将其用于室内空调的微生物防治。本发明主要包括两个步骤负载伊曲康唑-溶菌酶电纺纤维膜的制备及利用其抑制室内空调微生物的滋长。
其中，负载伊曲康唑-溶菌酶电纺纤维膜的制备步骤包括
1)将分子量为10万的聚乙烯醇颗粒和聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物F108溶于6. 4克去离子水中，均勻混合后加热搅拌至澄清，制备成共聚物混合凝胶；
2)分别将一定量的溶菌酶、伊曲康唑溶于1. 0毫升磷酸盐缓冲溶液(pH值为6. 5) 和121°C，0. IMPa条件下灭菌21分钟所得到的无菌水中，振荡摇勻至全部溶解；
3)将步骤幻中的溶菌酶与伊曲康唑溶液全部同时加入步骤1)所得的共聚物混合凝胶中，并剧烈震荡混合20分钟制备成均质溶液；
4)将步骤幻中所得均质溶液引入到高压静电纺丝装置中，调节各参数以获得稳定连续的喷射；
5)在接收板的铝箔上收集纤维，4 5小时后待纤维膜厚度达到0. 5 1毫米，停止纺丝，得到负载伊曲康唑-溶菌酶电纺纤维膜；
利用负载伊曲康唑-溶菌酶电纺纤维膜抑制室内空调微生物的滋长的步骤包括
a)将制备得到的负载伊曲康唑-溶菌酶电纺纤维膜剪成4片(规格为3厘米X3 厘米)，然后向100毫升的液体牛肉膏蛋白胨培养基和100毫升马液体铃薯葡萄糖培养基中各加入2片膜；
b)对办公室空调过滤网采样后制备菌悬液，然后分别取1毫升菌悬液加入到步骤 a)中所述的牛肉膏蛋白胨培养基和马铃薯葡萄糖培养基中，培养过程中采用比浊法测定微生物含量。
本发明中聚乙烯醇的醇解度为98 99%，平均聚合度为MOO 2500，其在水中的质量浓度为6%。
本发明的方法中，负载伊曲康唑-溶菌酶电纺纤维膜的制备步骤1)中所述的聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物F108，其分子式为PE0132-PP050-PE0132，分子量为 15500克/摩尔，F108的用量为聚乙烯醇质量的5%。
本发明的方法中，伊曲康唑分子式为C35H38Cl2N8O4，分子量为582. 58克/摩尔，溶菌酶为超纯级(ultra pure Grade)，均可由相应的供应商获得。
本发明的方法中，微生物测定采用比浊法，即用空白培养基为阴性对照，利用分光光度计(Varian，Cary50)在450纳米条件下测培养液的吸光度值。
本发明的优点在于本发明利用静电纺丝技术将伊曲康唑和溶菌酶直接共固定于电纺纤维膜中，从而解决了游离溶菌酶和伊曲康唑易流失、不能回收利用等问题。而且，将此负载伊曲康唑-溶菌酶电纺纤维膜应用于室内家电设备的微生物污染防治方面具有高效、便捷、无二次污染的优点。
图1为负载伊曲康唑-溶菌酶电纺纤维膜的扫描电子显微镜图像；
图2为将菌悬液分别接种不同培养基的培养结果(a 有负载伊曲康唑-溶菌酶电纺纤维膜的富集细菌的牛肉膏蛋白胨培养基；b 有负载伊曲康唑-溶菌酶电纺纤维膜的富集真菌的马铃薯葡萄糖培养基；c 无负载伊曲康唑-溶菌酶电纺纤维膜的富集细菌的牛肉膏蛋白胨培养基；d 无负载伊曲康唑-溶菌酶电纺纤维膜富集真菌的马铃薯葡萄糖培养基)。
具体实施方式
本发明所提供的用于防治室内微生物污染的负载伊曲康唑-溶菌酶电纺纤维膜主要包括两个步骤负载伊曲康唑-溶菌酶电纺纤维膜的制备及利用其抑制室内空调微生物的滋长。
其中，负载伊曲康唑-溶菌酶电纺纤维膜的制备步骤包括
1)将分子量为10万的聚乙烯醇颗粒和聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物F108溶于6. 4克去离子水中，均勻混合后加热搅拌至澄清，制备成共聚物混合凝胶；
2)分别将一定量的溶菌酶、伊曲康唑溶于1. 0毫升磷酸盐缓冲溶液(pH值为6. 5) 和121°C，0. IMPa条件下灭菌21分钟所得到的无菌水中，振荡摇勻至全部溶解；
3)将步骤幻中的溶菌酶与伊曲康唑溶液全部同时加入步骤1)所得的共聚物混合凝胶中，并剧烈震荡混合20分钟制备成均质溶液；
4)步骤幻中所得均质溶液引入到高压静电纺丝装置中，调节各参数，在电压为18 千伏-20千伏，接收距离为15厘米，溶液流速为0. 5毫升/分 1. 0毫升/分条件下获得稳定连续的喷射；
5)在接收板的铝箔上收集纤维，4 5小时后待纤维膜厚度达到0. 5 1毫米，停止纺丝，得到负载伊曲康唑-溶菌酶电纺纤维膜；
利用负载伊曲康唑-溶菌酶电纺纤维膜抑制室内空调微生物的滋长的步骤包括
a)将制备得到的负载伊曲康唑-溶菌酶电纺纤维膜剪成4片(规格为3厘米X3 厘米)，然后向100毫升的液体牛肉膏蛋白胨培养基和100毫升马铃薯葡萄糖培养基中各加入2片膜；
b)对办公室空调过滤网采用五点取样法进行2厘米X 2厘米取样，用无菌棉签在空调过滤网的每个采样点往返涂抹五次采样，之后将棉签放入2. 0毫升无菌水中，充分振荡制备菌悬液，然后分别取1毫升菌悬液加入到步骤a)中所述的牛肉膏蛋白胨培养基和马铃薯葡萄糖培养基中，培养过程中采用比浊法测定微生物含量。
本发明中聚乙烯醇的醇解度为98 99%，平均聚合度为MOO 2500，其在水中的质量浓度为6%。
本发明的方法中，负载伊曲康唑-溶菌酶电纺纤维膜的制备步骤1)中所述的聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物F108，其分子式为PE0132-PP050-PE0132，分子量为 15500克/摩尔，F108的用量为聚乙烯醇质量的5%。
本发明的方法中，伊曲康唑分子式为C35H38Cl2N8O4，分子量为582. 58克/摩尔，溶菌酶为超纯级(ultra pure Grade)，均可由相应的供应商获得。
本发明方法中，负载伊曲康唑-溶菌酶电纺纤维膜的制备步骤幻中添加溶菌酶的质量范围为2. 8 4. 8克，添加伊曲康唑的质量范围为0. 2 0. 4克。
本发明方法中，利用负载伊曲康唑-溶菌酶电纺纤维膜抑制室内空调微生物的滋长的步骤a)中加入2片负载伊曲康唑-溶菌酶电纺纤维膜(规格为3厘米X3厘米)的质量范围为0. 10 0.11克。
本发明的方法中，微生物测定采用比浊法，即用空白培养基为阴性对照，利用分光光度计(Varian，Cary50)在450纳米条件下测培养液的吸光度值。
实施例1
1)将0. 6g分子量为10万的聚乙烯醇颗粒和0. 03g嵌段共聚物F108溶于6. 4克去离子水中，均勻混合后加热搅拌至澄清，制备共聚物混合凝胶；
2)分别将2. 8克溶菌酶、0. 2克伊曲康唑溶于pH值为6. 5的1. 0毫升磷酸盐缓冲溶液和1. 0毫升在121°C，0. IMPa条件下灭菌21分钟所得到的无菌水中，振荡摇勻至全部溶解；
3)将步骤幻中的溶菌酶与伊曲康唑溶液全部同时加入步骤1)所得的共聚物混合凝胶中，并在旋涡混合器上混合20分钟制备成均质溶液；
4)步骤幻中所得均质溶液引入到高压静电纺丝装置中，调节各参数，在电压为18 千伏-20千伏，接收距离为15厘米，溶液流速为0. 5毫升/分 1. 0毫升/分条件下获得稳定连续的喷射，并在接收板的铝箔上收集纤维膜，4 5小时后待纤维膜厚度达到0. 5 1.0毫米，停止纺丝，得到负载伊曲康唑-溶菌酶电纺纤维膜；
5)将制备得到的负载伊曲康唑-溶菌酶电纺纤维膜剪成4片(规格为3厘米X3 厘米)，然后向100毫升的液体牛肉膏蛋白胨培养基和100毫升马铃薯葡萄糖培养基中各加入2片膜；
6)对办公室空调过滤网采用五点取样法进行2厘米X 2厘米取样，用无菌棉签在空调过滤网的每个采样点往返涂抹五次采样，之后将棉签放入2. 0毫升无菌水中，充分振荡制备菌悬液；然后分别取1毫升菌悬液加入到步骤幻中所述的牛肉膏蛋白胨培养基和马铃薯葡萄糖培养基中，培养过程中采用比浊法测定微生物含量，观察到负载伊曲康唑-溶菌酶电纺纤维膜对细菌的抑制周期为3天，对真菌的抑制周期为7天。
实施例2
调整实施例1步骤2)中溶菌酶和伊曲康唑的添加量分别为3. 8克和0. 28克，其余步骤与实施例1相同，观察到负载伊曲康唑-溶菌酶电纺纤维膜对细菌的抑制周期为4 天，对真菌的抑制周期为8天。
实施例3
调整实施例1步骤2)中溶菌酶和伊曲康唑的添加量分别为4. 4克和0. 3克，其余步骤与实施例1相同，观察到负载伊曲康唑-溶菌酶电纺纤维膜对细菌的抑制周期为4天， 对真菌的抑制周期为8天。
实施例4
调整实施例1步骤2)中溶菌酶和伊曲康唑的添加量分别为4. 6克和0. 35克，其余步骤与实施例1相同，观察到负载伊曲康唑-溶菌酶电纺纤维膜对细菌的抑制周期为5 天，对真菌的抑制周期为9天。
实施例5
调整实施例1步骤2)中溶菌酶和伊曲康唑的添加量分别为4. 8克和0. 4克，其余步骤与实施例1相同，观察到负载伊曲康唑-溶菌酶电纺纤维膜对细菌的抑制周期为5天， 对真菌的抑制周期为9天。
权利要求
1.一种用于防治室内微生物污染的负载伊曲康唑-溶菌酶电纺纤维膜，其特征在于 负载伊曲康唑-溶菌酶电纺纤维膜的制备步骤包括1)将分子量为10万的聚乙烯醇颗粒和聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物 F108溶于6. 4克去离子水中，均勻混合后加热搅拌至澄清，制备成共聚物混合凝胶；2)分别将一定量的溶菌酶、伊曲康唑溶于1.0毫升磷酸盐缓冲溶液(pH值为6. 5)和 1. 0毫升121°C，0. IMPa条件下灭菌21分钟所得到的无菌水中，振荡摇勻至全部溶解；3)将步骤幻中的溶菌酶与伊曲康唑溶液全部同时加入步骤1)所得的共聚物混合凝胶中，并剧烈震荡混合20分钟制备成均质溶液；4)步骤幻中所得均质溶液引入到高压静电纺丝装置中，调节各参数以获得稳定连续的喷射；5)在接收板的铝箔上收集纤维，4 5小时后待纤维膜厚度达到0.5 1毫米，停止纺丝，得到负载伊曲康唑-溶菌酶电纺纤维膜。
2.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于负载伊曲康唑-溶菌酶电纺纤维膜的制备步骤1)中所述的聚乙烯醇的醇解度为98 99%，平均聚合度为MOO 2500，其在水中的质量浓度为6%。
3.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于负载伊曲康唑-溶菌酶电纺纤维膜的制备步骤1)中所述的聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物F108，其分子式为 PE0132-PP050-PE0132，分子量为15500克/摩尔，F108的用量为聚乙烯醇质量的5%。
4.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于负载伊曲康唑-溶菌酶电纺纤维膜的制备步骤2)中添加溶菌酶的质量范围为2. 8 4. 8克，添加伊曲康唑的质量范围为0. 2 0.4 克。
5.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于负载伊曲康唑-溶菌酶电纺纤维膜的制备步骤4)中所用的电纺参数为电压18千伏-20千伏，接收距离15厘米，溶液流速0. 5毫升/分 1.0毫升/分。
全文摘要
本发明涉及一种用于防治室内微生物污染的负载伊曲康唑-溶菌酶电纺纤维膜。利用静电纺丝技术可以将能抑制真菌的伊曲康唑和溶解细菌的溶菌酶同时共固定于电纺纤维膜中。将负载溶菌酶和伊曲康唑的电纺纤维膜用于抑制空调过滤网上微生物滋长。该负载溶菌酶和伊曲康唑的电纺纤维膜能够高效、便捷的控制微生物的滋长。相比其它的微生物防治技术，负载溶菌酶和伊曲康唑的电纺纤维膜效率高、无能耗、环境友好，可实现对常见室内微生物持续稳定的防治和灭除。
文档编号A01P1/00GK102505180SQ20111027513
公开日2012年6月20日 申请日期2011年9月16日 优先权日2011年9月16日
发明者彭可扬 申请人:彭可扬