专利名称：B类功能基因AcPI及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种从菠萝中克隆得到的花发育B类功能基因AcPI及其在拟南芥开花调节中的应用。
背景技术：
菠萝(Ananas comosus)是禾本目、凤梨科、凤梨属多年生草本植物，其果实富含多种糖分、有机酸、矿质元素及人体必需的多种维生素，营养价值高，可鲜食和加工，加工后的皮渣可作饲料和肥料，菠萝叶还可提取高质量纤维，菠萝用途广泛，在国内外有广阔的市场和发展前景。据FAO统计，2009年，我国菠萝产量为145万吨，是世界上继泰国和菲律宾之后的世界第三大菠萝生产国。我国自17世纪初开始引种菠萝，主要分布在广东、广西、海南、云南、福建等省区。虽然菠萝是我国比较有优势的热带水果，但在栽培过程中碰到很多问题，主要问题之一是菠萝早花现象。菠萝早花是指营养器官未发育完全就提早开花的现象，是造成菠萝减产的一个重要原因；菠萝早花导致果小，大大降低了果实的商品价值和经济价值。但如果开花太迟，则需要分批采收、销售和加工，增加了成本。目前，生产上多采用催花技术， 以达到同时收果的目的。但品种间催花难易差别比较大，因此需要了解开花机理，以调节花期。PISTILLATA (简称PI)在花发育ABC模型中，属于B类功能基因。B类基因的功能是调控第二、三轮花器官花瓣和雄蕊的发育(Coen et al，1991)。在拟南芥中，B类基因以PI和AP3为代表，它们的突变导致第二轮花器官转变为花萼，第三轮花器官转变为心皮 (Bowman et al，1989 Jack et al，1992)。在PI类基因中，C末端的PI基序高度保守，暗示其具有重要的功能，但是其作用还不能确定(虽然体内功能验证表明B类基因的C末端是必不可少的，体外实验却表明C末端对异源二聚体的结合是不必要的。另外，从拟南芥和金鱼草中分离到的PI突变的PI基序并没有变化)。在矮牵牛、水稻、毛莨等植物中存在由种内独立进化复制产生的多个PI类旁系同源基因，野罂粟等中则存在由插入产生的直系同源基因(Kramer et al，1998)。PI属于MADS-box基因家族，主要由MADS盒、K盒、I区和C末端4个部分组成。其中的MADS盒是由约56-58个氨基酸组成的高度保守的结构域；K盒是一中度保守的序列；I 区位于MADS-box和K盒之间，是由约35个氨基酸组成的微弱保守区域；C末端位于K盒下游，是由约30个氨基酸组成的富含疏水残基的非保守区域；最后是由14个碱基组成的高度保守区域PI基序。PI基序与其蛋白功能相关。目前已经在多种作物上克隆得到PI同源基因的cDNA全长。如番红花的 CsPIC2 (Crocus sativus, ABB22781)，华山姜的 AoPI (Alpinia oblongifolia, ABB92623)， 兰花的 OrcPI (Orchis italica, BAC22579)，风信子的 HPI2 (Hyacinthus orientalis, AAD22494)，葡萄的 VvPI (Vitis vinifera, ABK59993)，苹果的 MdPI (Malus χ domestica, CAC28022)，拟兰芥的 AtPI(Arabidopsis thaliana, BAA06465)等。PI 及其同源基因在拟南芥上表达，可促进开花。随着对模式植物拟南芥等花发育方面的研究，了解菠萝开花机理可有效地指导菠萝育种，加快育种进程。这是首次从分子生物学的角度来初步了解菠萝的花发育，为以后通过目的基因在菠萝中的过量表达或抑制其表达来调节开花时间打下基础。因此，本研究对于利用基因工程来选育菠萝新品种有着重要的意义。
发明内容
鉴于上述问题，根据本发明的一个目的，提供一个首次从菠萝顶端分生组织中获得的B类功能基因AcPI，其核苷酸序列如SEQ ID NO=I0根据本发明的一个方面，所述AcPI基因大小为907bp，其编码197个氨基酸，含有典型的PI同源基因结构域。根据本发明的另一个方面，所述AcPI基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO :2。根据本发明的另一个方面，所述AcPI基因包含了 56 58个氨基酸组成的MADS 结构域，K盒，由约35个氨基酸组成的I盒，由约30个氨基酸组成的富含疏水残基的C末端及由14个碱基组成的PI基序。根据本发明的又一个方面，经实时荧光定量表达分析，所述AcPI基因在果肉、果柄、萼片、雄蕊、苞片、顶端分生组织、叶片和花瓣8个部位都有表达，且表达量从大到小依次为雄蕊>花瓣>萼片>果柄>顶端分生组织>果肉>叶片>苞片。本发明还提供所述AcPI基因在调节拟南芥开花中的应用，其中所述AcPI基因与载体pBI 121正向相连后得到重组质粒pBI 121-AcPI，将所述重组质粒pBI 121-AcPI转化农杆菌菌株GV3101，经花粉管通道法转化拟南芥后，促使拟南芥平均提前5. 3天现蕾。
图1表示PI同源基因编码的氨基酸序列比对。图2表示AcPI基因在8个不同部位的表达。图3表示植物表达载体pBI121_AcPI的构建图。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的描述，这些实施例只用来说明本发明，并不限制本发明的范围。本发明所提供的PI同源基因，是从菠萝中克隆得到，命名为AcPI基因，核酸序列如 SEQ ID NO :1(序列 1)。AcPI基因编码的蛋白质，命名为AcPI蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2(序列2)。一、AcPI基因的克隆及其序列分析上述AcPI基因的克隆方法及其序列分析，包括如下步骤1、RNA 提取以菠萝品种“巴厘”的顶端分生组织为材料，用北京天恩泽基因科技有限公司的柱式植物RNAout 2. 0试剂盒(产品编号为CAT# 90404-50)提取总RNA，具体操作如下
1)估算组织细胞的用量。每次微量提取一般需要100 200mg顶端分生组织。2)先将新鲜顶端分生组织剪切成小块，用液氮研磨成粉末后，加入Iml经65°C预热的溶液A (用前需要混勻)，制得勻浆物。3)将砚磨后的顶端分生组织或制得的勻浆物转移至干净的1. 5ml塑料离心管中 (可以不转移非液体的细胞碎片)。有的植物组织(比如果实)含有大量水份，勻浆液会多于1ml，转移时也只取1ml。4)在离心管中加入0. 3ml的溶液B和0. 2ml自备氯仿，在振荡器上振荡30秒混勻，此时溶液呈均勻的乳浊状。振荡器振荡时必须使管底溶液震荡起来。5)室温12000rpm离心3 5分钟，两相间将有约5毫米厚的细胞破碎物。6)将上清液(约0.6ml)转移到另一干净的1. 5ml塑料离心管中，下层有机相和中间层含有DNA、蛋白质和其他杂质，避免触及或吸取。最好留下100μ 1上清液不取。7)加入等体积的溶液C，充分颠倒混勻，制得混合溶液。8)将一半上述混合溶液转移到离心吸附柱中，12000rpm室温离心半分钟，弃穿透液。9)将剩下的一半上述混合溶液转移到同一离心吸附柱中，12000rpm室温离心半分钟，弃穿透液。10)将0. 7ml通用洗柱液加入到离心吸附柱中，12000rpm室温离心10 30秒，弃
穿透液。11)重复步骤10) —次。12) 12000rpm室温离心上述吸附柱30秒以便去除残留液体。此步十分重要，否则残留的乙醇会影响RNA的使用。13)将离心吸附柱转移到无RNA酶的收集管中，加入50 μ 1 RNA洗脱液，室温放置 1 2分钟。14) 12000rpm室温离心半分钟，离心管中溶液即为含DNA污染的RNA样品。后续步骤主要是去除DNA污染。15)将上步得到的50ul总RNA溶液与溶液D按1 1的比例混合，充分震荡半分钟。16)加入相当于RNA溶液和溶液D混合液总体积9倍体积的溶液E，颠倒数次充分混勻。注意溶液E在4°C放置后可能会产生沉淀，使用前必须放在65°C水浴使沉淀彻底溶解并充分摇勻后再取用。17)将步骤16)制得的混合液转移到离心吸附柱中，室温12000rpm离心半分钟，弃
穿透液。18)加0. 7ml通用洗柱液到离心吸附柱中，12000rpm室温离心半分钟，弃穿透液。19) 一次洗涤一般足够去除杂质。如果有必要，可以再加0. 3ml通用洗柱液到离心吸附柱中，12000rpm室温离心半分钟并弃穿透液。一般情况，此步可以省略。20)室温12000rpm离心步骤19)处理过的离心吸附柱半分钟。此步十分重要，否则残留的乙醇会影响RNA的使用。21)将离心吸附柱转移到一个新的1. 5ml离心管中，加入30 50 μ 1 RNA洗脱液，
室温放置1 2分钟。
22)将上述离心管在室温12000rpm离心半分钟，离心管中溶液即为去除DNA污染的RNA样品，可以立即使用或存放于-80°C待用。RNA的质量和浓度用核酸蛋白仪来测定，同时用1. 0g/100ml (简称1. 0% )的琼脂糖凝胶电泳来检测。2、反转录采用大连宝生物工程公司(TAKARA)第一链反转录试剂盒来进行反转录，得到 cDNA第一链，作为随后PCR扩增的模板。3、引物设计根据美国生物技术信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information,简称为 NCBI) (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)上其他作物同源基因的序列比对，设计核心片段的引物正向引物PI-F :5，-CCAGGTCTCCVTCGTCAT-3，反向引物PI-R 5，-ACACCAGTNAGACCATTC-3，反应体系为12. 5μ1 PCR缓冲液，8. 4μ 1灭菌去离子水，0. 1μ 1 Taq酶，正向、反向引物各1μ 1(10pM)，cDNA模板2μ 1 ；PCR扩增条件为94°C变性3min ；94°C变性0. 5min， 50°C退火 0. 5min, 72°C延伸 1. 5min, 32 个循环；72°C延伸 IOmin04、目的DNA回收PCR产物电泳后，按照 TAKARA 的 Agarose Gel DNA Purification Kit Ver2.0(编号为DV805A)的说明书，从琼脂糖凝胶中回收目的DNA片段。具体步骤如下1)使用三羟甲基氨基甲烷-乙酸(简称为TAE)缓冲液制作1.0%的琼脂糖凝胶， 对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。2)在紫外灯下切下含有目的DNA片段的凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。此时应尽量切除不含目的DNA部分的凝胶，尽量减小凝胶体积，提高DNA回收率。3)切碎胶块。胶块切碎后可以加快胶块融化时间，提高DNA的回收率。4)称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时以Ig = Iml进行计算。5)向胶块中加入胶块融化液DR-I缓冲液，DR-I缓冲液的加量如下
凝胶浓度(g/100ml) DR-I缓沖液使用量
1.03倍凝胶体积量
1.0-1.54倍凝胶体积量
1.5-2.05倍凝胶体积量6)均勻混合后75°C加热融化胶块(低熔点琼脂糖凝胶只需在45°C加热)。此时应间断振荡混合，使胶块充分融化(约6 IOmin)。7)向上述胶块融化液中加入DR-I缓冲液的1/2体积量的DR-II缓冲液，均勻混合。当分离小于400bp的DNA片段时，应在此溶液中再加入终浓度为20%的异丙醇。8)将试剂盒中的吸附柱安置到收集管上。9)将上述操作步骤7)的溶液转移至吸附柱中，12000rpm离心lmin，弃滤液。
10)将500 μ 1的Rinse A加入吸附柱中，12000rpm离心30秒，弃滤液。11)将700 μ 1的Rinse B加入吸附柱中，12000rpm离心30秒，弃滤液。12)重复操作步骤11) 一次。13)将操作步骤12)处理过的吸附柱安置于新的1. 5ml的离心管上，在吸附柱膜的中央处加入25ul的灭菌水或洗脱液，室温静置lmin。14) 12000rpm 离心 lmin，洗脱 DNA。15)立即使用或_20°C保存备用。回收的目的DNA于16°C与pMD18_T载体连接2 4h，连接产物转化大肠杆菌JM109 感受态细胞，采用蓝白斑筛选转化子，取白斑进行菌落PCR检测，挑取检测呈阳性的转化子送公司测序，测序结果证实得到的为AcPI基因的中间片段。5、根据得到的核心片段设计5’和3’端快速扩增cDNA末端(Rapid amplification of cDNA ends，简称为RACE)的特异引物5' PI-OUT 5‘ -CCATTCTGGAGAGCCTCTTCTATCGG-3‘5' PI-IN 5' -GCTCGATCTGCATGTTGTCGTTCTCT-3‘3 ’ PI-OUT 5 ‘ -CGGGAAGATGTCCGAGTACTGTAGCC-3‘3' PI-IN 5' -AACGACAACATGCAGATCGAGCTCAG-3‘按照Clontech RACE试剂盒操作，先用5’ PI-OUT和3’ PI-OUT分别与试剂盒中配备的通用引物(Universal primer，简称为UPM)进行第一轮扩增，扩增产物稀释100倍后用作第二轮扩增的模板，用5’PI-IN和3’PI-IN分别于试剂盒中配备的巢式通用引物(Nested universal primer,简称为NUP)进行第二轮RACE扩增。PCR总反应体积50 μ 1，操作实验步骤应在冰浴上进行。PCR产物用TAKARA的凝胶回收试剂盒回收后，16°C与pMD18_T载体连接2 4h， 连接产物转化JM109感受态细胞，采用蓝白斑筛选转化子，取白斑进行PCR检测，挑取阳性转化子送公司测序，测序结果证实得到的为AcPI基因的5’和3’端片段。6、根据得到的测序结果设计cDNA全长扩增引物PIQC-F 5，-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTA-3，PIQC-R 5，-ATAGCAGACAAAGTCGATGGCAGA-3，反应体系为PCR缓冲液12. 5μ1，8. 4μ1灭菌去离子水，0. Ιμ Taq酶，正向、反向引物各1μ 1(10pM)，cDNA模板2μ 1 ；PCR扩增条件为94°C变性3min ；94°C变性0. 5min， 60°C退火 0. 5min, 72°C延伸 2min，32 个循环；72°C延伸 lOmin。7、扩增后得到的目的片段用TAKARA的凝胶回收试剂盒回收后，16°C与pMD18_T载体连接2 4h，连接产物转化JM109感受态细胞，采用蓝白斑筛选转化子，取白斑进行PCR 检测，挑取阳性转化子送公司测序，测序结果证实得到的为菠萝AcPI cDNA全长基因。8、序列分析从NCBI上搜索同源序列进行比对，结果显示AcPI与番红花(78. 6 % )，华山姜 (77.4%)，兰花(75.7% )和风信子(72.4% )的同源性很高。AcPI基因属于MADS-box基因，含有典型的MIKC结构域包含了 56_58个氨基酸组成的高度保守的MADS结构域，中度保守的K盒，由约35个氨基酸组成的微弱保守区域I 盒，由约30个氨基酸组成的富含疏水残基的非保守区域C末端及由14个碱基组成的保守
7的PI基序(图1)。这些保守结构域与其蛋白功能密切相关。二、AcPI基因的表达对AcPI基因在菠萝的8个不同部位(叶片、果肉、果柄、萼片、雄蕊、苞片、顶端分生组织和花瓣)进行实时荧光定量表达分析，以验证其功能。具体实施方案如下当花序高为4 5cm时，分别提取8个不同部位的总RNA，用核酸蛋白仪测定其浓度，分别定量取出1 μ g RNA,使用TAKARA定量反转录试剂盒来进行反转录，得到的cDNA用作定量表达的模板。采用ISsRNA作为内参基因。AcPI定量表达的引物PIdl-up GCACCACCAAGAGATGGCGATGPIdl-dn :AGCAGACAAAGTCGATGGCAGAGA反应体系95°C30sec, 1 个循环；95°C 5sec，53°C 30sec,72°C 30sec,40 个循环。 如果制作标准曲线，最后再添加一个溶解曲线的反应95°C 60sec,56°C 30sec,95°C 30sec, 1个循环。实时荧光定量表达结果显示，AcPI基因在8个部位都有表达，表达量从大到小依次为雄蕊>花瓣>萼片>果柄>顶端分生组织>果肉>叶片>苞片(图2)，AcPI基因在雄蕊和花瓣的表达量很高，在雄蕊的表达量是在苞片的306倍，在叶片和苞片的表达量非常小。说明AcPI基因在菠萝花发育过程中发挥重要作用。三、含AcPI基因植物表达载体的构建构建含AcPI基因的植物表达载体，经花粉管通道法转入拟南芥，进一步验证AcPI 基因的功能。1、带酶切位点编码区的扩增设计带酶切位点的引物PImq-F :TGCTCTAGAATGGGGCGGGGGAAGATCGAGATXbaIPImq-R :CGGGATCCATAGCAGACAAAGTCGATGGCAGABamHIPCR反应体系25μ 1总反应体积中含模板第一链cDNA 2 μ 1，上下游引物各 1μ l(10ymol/L),Taq DNA 聚合酶 0. 1 μ 1 (5U/μ 1)，2x Mix 缓冲液 12. 5 μ 1，用无菌重蒸馏水补足体积。PCR反应条件为94°C 3min ；94°C 30sec，50°C 30sec，72°C 2min，35个循环；72°C延伸lOmin。扩增得到的PImq与pMD18_T连接后，命名为pMD18_AcPI，转化JM109感受态后， 采用蓝白斑筛选转化子，取白斑进行PCR检测，挑取阳性转化子送公司测序，测序结果证实得到的为包括编码区的带酶切位点的AcPI基因。2、植物表达载体的构建用限制性内切酶Xbal和BamHI从含有目的基因的重组质粒pMD18_AcPI中切下目的片段，同时用XbaI和BamHI双酶切pBI121载体，琼脂糖凝胶电泳分离后，用TAKARA胶回收试剂盒分别回收目的基因片段和PBI121载体的大片段。利用T4DNA连接酶将AcPI正向插入到pBI 121载体中，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，经PCR鉴定后，获得植物表达载体pBI 121-AcPI (图3)。3、植物表达载体导入农杆菌取农杆菌GV3101的感受态细胞冰上解冻以后，加入1μ g pBI121-AcPI质粒DNA， 混勻，冰浴30min，液氮中放置lmin，迅速转入37°C中水浴5min，融化后加入0. 8ml新鲜的 LB培养基(不含抗生素)，于28°C振荡培养2 4h ；取200 μ 1涂布于含卡那霉素(简称为 Kan) 50mg/L和利福平(简称为Rif) 25mg/L的LB培养基上，28°C培养2 3天。并对菌落进行PCR检测。4、目的基因转化拟南芥挑取鉴定好的阳性农杆菌单克隆于IOml含有Rif (25mg/l)和Kan(50mg/1)的LB 液体培养基中，28°C，200rpm振荡培养至光学密度(Optical density，简称为0D)为0. 5左右。在转化前一天，取Iml转入IOOml含Rif (25mg/l)和Kan(50mg/1)的LB培养基中振荡培养过夜，第二天，当菌液0D600在1. 0 1. 5之间时取出使用。制备好已转化了 pBI121-AcPI重组质粒的农杆菌菌液100ml，室温5000rpm离心 15min，弃上清，沉淀悬浮于相应体积的渗透培养基(l/2MS+5%蔗糖+0.5g 2-吗啉乙磺酸 (简称为MES)/L+Silwet-77 200 μ 1/L，ρΗ5· 8)中，重悬后的菌液0D600在0. 8左右。将农杆菌悬浮液倒在烧杯中，将长有拟南芥的培养杯倒扣其上，保证莲座叶以上部分浸没于农杆菌菌液中，浸泡1分钟，期间不时摇动。取出植株，横放在塑料盘中，用保鲜膜封好以保持高湿，放在恒温室培养。第二天揭开保鲜膜，竖直培养。根据需要一周后可再浸染一次，以提高转化率。培养三至四周，待种子成熟后，收取种子，自然干燥后4°C保存。5、AcPI基因的应用以Kan抗性Tl代转基因拟南芥植株的叶片为材料，提取基因组DNA，以DNA为模板，以PImq-F，PImq-R为引物进行PCR扩增，以未转基因拟南芥叶片的DNA为阴性对照。结果表明AcPI基因已经整合到拟南芥基因组中。转基因拟南芥植株平均在20. 5天现蕾，而野生型拟南芥植株平均在28. 2天现蕾，转基因植株比非转化株平均提前7. 7天现蕾。说明 AcPI具有促进拟南芥开花的功能。因此，可应用AcPI基因来调节菠萝开花时间。以上所述，仅为本发明的较佳实例而已，并非用于限定本发明的保护范围。
权利要求
1.一种从菠萝中克隆得到的B类功能基因AcPI，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1。
2.根据权利要求1所述的AcPI基因，其编码197个氨基酸，含有典型的PISTILLATA同源基因结构域。
3.根据权利要求1所述的AcPI基因，其编码的氨基酸序列如SEQID NO :2。
4.根据权利要求1所述的AcPI基因，其包含了56 58个氨基酸组成的MADS结构域， K盒，由约35个氨基酸组成的I盒，由约30个氨基酸组成的富含疏水残基的非保守区域C 末端及由14个碱基组成的PI基序。
5.根据权利要求1所述的AcPI基因，经实时荧光定量表达分析，所述AcPI基因在果肉、果柄、萼片、雄蕊、苞片、顶端分生组织、叶片和花瓣8个部位都有表达，且表达量从大到小依次为雄蕊>花瓣>萼片>果柄>顶端分生组织>果肉>叶片>苞片。
6.如权利要求1至5中任意一项所述的AcPI基因在调节拟南芥开花中的应用，其中所述AcPI基因与载体正向相连后得到重组质粒，将所述重组质粒转化农杆菌，经花粉管通道法转化拟南芥后，促使拟南芥平均提前5. 3天现蕾。
7.如权利要求6所述的AcPI基因在调节拟南芥开花中的应用，其中所述植物表达载体为pBI 121，所述农杆菌菌株为GV3101。
8.如权利要求1至5中任意一项所述的AcPI基因的载体。
9.如权利要求1至5中任意一项所述的AcPI基因的宿主细胞。
10.如权利要求1至5中任意一项所述的AcPI基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO :2。
全文摘要
本发明涉及一种从菠萝中克隆得到的B类功能基因AcPI，及其在调节拟南芥开花中的应用。所述AcPI基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2。利用同源序列法克隆得到AcPI基因，采用花粉管通道法转化拟南芥，结果证实转基因拟南芥植株与野生型拟南芥植株相比，表现出提前开花。本发明有助于进一步了解菠萝开花机理，从而可利用生物技术手段来调节菠萝花期、选育菠萝新品种。
文档编号A01H5/00GK102329807SQ20111029634
公开日2012年1月25日 申请日期2011年10月8日 优先权日2011年10月8日
发明者刘玉革, 刘胜辉, 吕玲玲, 孙光明, 张建霞, 段俊, 谢江辉, 陈长明, 魏长宾 申请人:中国热带农业科学院南亚热带作物研究所