专利名称：海岛棉脂质转运蛋白及其在纤维改良上的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种具有脂质转运功能的蛋白，在棉花纤维中特异表达编码该蛋白的基因能够提高棉花品种的纤维长度。
背景技术：
利用基因工程手段提高棉花的纤维品质包括棉花的纤维长度是当前棉花分子育种的重要方向。植物脂质转运蛋白(LTP)是一类小分子碱性蛋白，占植物可溶性总蛋白的4%左右。LTP是一种多功能的蛋白家族，LTP蛋白家族的成员不仅参与了磷脂在生物膜之间的运输，而且还在生物膜、角质和脂质的形成、植物的生殖发育以及信号的转导等生物过程中发挥了重要的作用。近期的研究表明，LTP蛋白具有信号肽，可以从细胞内分泌到细胞外并定位于细胞壁上。LTP蛋白的细胞壁定位功能对于植物的抗病反应、抗逆境反应(高温、高盐、 干旱协迫)、以及生物膜和脂质的形成具有重要作用。在棉花的纤维发育过程中，脂类代谢在棉纤维快速伸长中发挥了重要的作用。在棉花胚培养基中添加碳链长度在20以上的脂类化合物能够促进纤维的伸长发育。烟草中脂类运输蛋白基因的研究表明，脂类运输蛋白具有疏松细胞壁的功能。但是到目前为止，哪种蛋白参与运输C20以上的脂类化合物并不清楚，利用基因工程手段提高棉花的纤维长度也没有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的脂质转运蛋白基因以及其片段、类似物和衍生物。本发明的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。本发明的另一目的是提供生产这些多肽的方法以及该多肽和编码序列的用途，尤其是在提高棉花脂质转运蛋白在胚细胞中的表达水平从而促进棉花纤维伸长方面的用途。本发明人经过广泛而深入的研究，首次采用分子克隆方法从海岛棉胚特异表达的 cDNA中分离获得了新的Itp基因，并且通过实验证实了它具有促进纤维伸长功能，Itp基因转入植物后可导致棉花纤维伸长。在此基础上完成了本发明。本发明包括以下内容1、提供了一种新的分离出的脂质转运蛋白(以下简称为“LTP”蛋白质)，包含具有SEQ ID NO :2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。较佳地，该多肽选自下组(a)具有SEQ ID NO :2氨基酸序列的多肽；(b)将 SEQ ID NO :2氨基酸序列经过一个或多个(较佳地1-20个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有促进棉花纤维伸长功能的LTP蛋白质活性的由(a)衍生的多肽。2、提供了编码上述多肽的多核苷酸，选自(a)编码上述LTP蛋白质多肽的多核苷酸；和(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，该多核苷酸的序列是选自下组的一种(a)具有SEQ ID NO 1中1-363位的序列；(b)具有SEQ ID NO :1中1-400位的序列。3、提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。4、提供了制备上述LTP蛋白质多肽的方法，该方法包含(a)在适合表达的条件下，培养上述被转化或转导的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有活性的多肽。5、提供了上述多核苷酸和LTP蛋白质多肽的用途，即，在培育提高棉花纤维长度的棉花品种方面的应用。6、提供了一种改变植物脂质转运蛋白，以提高棉花纤维品质的方法，它包括步骤(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有SEQ ID NO :1所示序列的多核苷酸，所述的LTP选自下组(a)具有SEQ ID NO 2氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO :2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有促进棉花纤维伸长的由(a)衍生的多肽；(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使Ipt基因编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；(3)选择出转入Ipt基因的DNA编码序列的植物细胞或组织或器官；(4)将步骤(3)中的植物细胞或组织或器官再生成植株。在本发明中，术语“LTP蛋白质”、“LTP多肽”或“脂质转运蛋白”可互换使用，都指具有LTP氨基酸序列(SEQ ID NO 2)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的 LTP蛋白质。如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。如本文所用，“分离的LTP蛋白或多肽”是指LTP多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化LTP 蛋白质。本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主， 本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。本发明还包括LTP蛋白质的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、 “衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然LTP蛋白质相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列)。根据本文所述， 这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。在本发明中，术语“LTP多肽”指具有脂质转运活性的SEQ ID NO. 2序列的多肽。 该术语还包括具有与LTP蛋白质相同功能的、SEQ ID NO. 2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地 1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或 N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括LTP蛋白的活性片段和活性衍生物。该多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨程度条件下能与Itp DNA杂交的DNA所编码的蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含LTP多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了 LTP多肽的可溶性片段。通常，该片段具有LTP多肽序列的至少约10个连续氨基酸， 通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。发明还提供LTP蛋白质或多肽的类似物。这些类似物与天然LTP多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到。在本发明中，“LTP蛋白质保守性变异多肽”指与SEQ ID NO 2的氨基酸序列相比， 有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。表 权利要求
1.一种分离的LTP蛋白质多肽，其特征为包含具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的多肽，或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
2.权利要求1所述的多肽，所述保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物是 SEQ ID NO :2序列被一个或多个氨基酸残基取代、缺失或添加而形成的，且具有脂质转运蛋白抗性和LTP蛋白质活性的多肽。
3.权利要求1或2所述的多肽在提高棉花纤维长度和强度方面的功能与应用。
4.一种分离的多核苷酸，其特征在于，包含(a)编码权利要求1或2所述多肽的多核苷酸；或(b)与(a)互补的多核苷酸。
5.权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，其序列选自(a)具有SEQID NO :1中1-363位的序列；或(b)具有SEQID NO :1中1-400位的序列。
6.权利要求4或5所述的多核苷酸在提高棉花纤维长度和强度方面的功能与应用。
7.一种载体，其特征在于含有权利要求4或5所述的多核苷酸。
8.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于含有权利要求7所述的载体。
9.一种具有LTP蛋白质活性的多肽的制备方法，其特征在于包含(a)在适合表达的条件下，培养权利要求8所述的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有LTP蛋白质活性的多肽。
10.一种改变植物脂质转运蛋白抗性，以提高植物纤维品质的方法，包括(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有权利要求4或5所述的多核苷酸；(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使LTP蛋白质DNA编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；(3)选择出转入LTP蛋白质DNA编码序列的植物细胞或组织或器官；(4)将步骤(3)中的植物细胞或组织或器官再生成植株。
全文摘要
本发明提供了一种新的能够提高棉花纤维品质的脂质转运蛋白基因lpt及其编码的LTP蛋白质多肽，以及经重组技术产生这种LTP蛋白质的方法。本发明还公开了lpt基因在提高棉花纤维长度和强度方面的功能与应用。
文档编号A01H5/00GK102321163SQ20111030535
公开日2012年1月18日 申请日期2011年10月10日 优先权日2011年10月10日
发明者左开井, 王劲, 陈继军, 韩慧超 申请人:左开井, 王劲