专利名称：一种葡萄体细胞胚发生的方法
技术领域：
本发明涉及一种通过体细胞胚发生途径建立葡萄高效再生体系的方法，尤其是一种葡萄体细胞胚发生的方法。
背景技术：
葡萄由于再生困难、生长周期长以及基因数量多且多呈杂合状态而严重制约了分子育种工作的开展，目前葡萄生产上主要利用嫁接技术对栽培品种进行改良，随着分子生物学研究的深入和转基因技术的日趋成熟，虽然葡萄转基因育种也获得了成功，但由于转基因受体系统的不完善，从而影响了葡萄转基因育种的快速发展。当前，葡萄再生体系发生的途径主要有器官发生途径和体细胞胚发生途径，但与器官发生相比，体细胞胚发生产生的胚性细胞分散性好，生长旺盛、生理生化代谢活跃、生命力强且易于分化，以胚性愈伤组织作为遗传转化的受体，植株再生性高，遗传操作的效果较好，因此，在葡萄转基因技术研究过程中，再生体系主要以体细胞胚发生途径为主。自 1976年Mullins等从葡萄珠心愈伤组织上获得了体细胞胚以来，葡萄体细胞胚发生的研究取得了不少成功，Das等Q002)、Semenzato等Q002)通过叶片成功建立了葡萄体细胞胚发生体系；Perrin 等(2001)、Locco 等(2001)、Rubtsova 等(1999)、Jayasankar 等(2000) 通过花药成功建立了葡萄体细胞胚发生体系；salunlche等(1997)通过卷须成功建立了葡萄体细胞胚发生体系；Motoike等Q001)通过子房成功建立了葡萄体细胞胚发生体系； Zlenko等Q002)通过叶柄成功建立了葡萄体细胞胚发生体系。虽然已有了大量的葡萄体细胞胚发生的研究，但主要还存在以下问题①由于葡萄基因型的差异，所建立的葡萄再生体系多数仅适合个别品种；②部分再生体系的胚性愈伤诱导率偏低，仅在20%以下，不适合后期的转基因技术操作；③虽然部分再生体系的胚性愈伤诱导率较高，但操作程序较为复杂，技术难度较大。
发明内容
本发明的目的是提供一种一种葡萄体细胞胚发生的方法，该方法所获再生植株性状均一、稳定，且操作步骤简单，易于遗传工程操作。一种葡萄体细胞胚发生的方法，包括如下步骤(1)在葡萄盛花期，采集开花前 5-7天的花蕾，将采集的花蕾置于2-4°C条件下存放2-3天，再清洗消毒并吸干水分备用； ⑵将步骤⑴得到的花蕾置于解剖镜下，用无菌的解剖针刺破花瓣，将单个雄蕊取出接种在培养基上进行培养，培养条件为暗培养，温度观士 1 °C ； (3)暗培养45 50天后，选取步骤 (2)中得到的浅黄色或白色的颗粒状、质地紧实的胚性愈伤组织，将其接种在培养基上进行培养，培养条件为暗培养，温度(4)暗培养时间30天后，将步骤C3)得到的诱导形成的体细胞胚继代在与步骤C3)中同样的培养基上进行培养，培养条件为500-10001X弱光照培养，光照时间16h/d，温度弱光照条件下培养30天后，将步骤(4)得到的体细胞胚同样继代在与步骤C3)中同样的培养基上进行培养，培养条件为2000-300001X强光照培养，光照时间16h/d，温度^±1°C。步骤(1)中清洗消毒并吸干水分是先用洗涤剂清洗5-lOmin，自来水冲洗 20-30min，75%体积百分比浓度的乙醇消毒30S后，2%体积百分比浓度的次氯酸钠溶液消毒6min，无菌水洗涤4-5次，然后用无菌滤纸吸干花蕾上多余的水分。步骤O)中的培养基为NN基本培养基再添加1. 0-1. 2mg · Γ1 2,4- 二氯苯氧乙酸、1. 5-2. Omg · L-1 6-苄基氨基腺嘌呤、5. Omg · L、gN03、60g · L-1 蔗糖和 0. 6g/L 琼脂。步骤O)中用IN的盐酸或氢氧化钠调节培养基pH 5. 8 6. 0。步骤(3)中的培养基为NN基本培养基，或NN培养基大量元素、MS培养基微量元素、MS培养基铁盐和B5培养基有机元素的混合，并且添加2. Omg · L—1萘氧乙酸、 0. 1-0. 2mg · L^1B-苄基氨基腺嘌呤、2. 5-3. 5mg · L-1吲哚乙酸、0. lg/L活性炭、3g/L蔗糖以及0. 7g/L琼脂。步骤(3)中用IN的盐酸或氢氧化钠调节培养基PH 5. 8 6. 0。针对现有技术的不足，本发明方法以葡萄雄蕊为外植体，利用间接诱导法，胚性愈伤组织诱导率达到30%以上，获得的胚性愈伤组织经体细胞胚诱导培养与植株再生培养后获得高频稳定的再生体系，该方法可以同时适用于多个品种，为进一步利用基因工程对葡萄进行遗传改良奠定了技术平台。本发明方法通过离体培养葡萄雄蕊，建立了再生体系，所获得再生植株性状均一、稳定，且操作步骤简单，易于遗传工程操作。
具体实施例方式本发明所述方法包括两个培养阶段阶段(1)外植体培养诱导胚性愈伤组织； 阶段( 胚性愈伤组织诱导体细胞胚及体细胞胚再生植株。其中阶段(1)为暗培养，阶段(2)早期为暗培养；中期为500-1000勒克斯的弱光培养，光照时间为16h/d;后期为 2000-30000勒克斯的强光培养，光照时间为16h/d。整个培养过程，培养温度^_28°C，阶段 (1)培养时间为45-50d，阶段( 每培养30d换新鲜培养基。本发明通过上述两个阶段的培养，从葡萄雄蕊外植体诱导出胚性愈伤组织，并通过胚性愈伤组织进一步诱导出体细胞胚，通过体细胞胚再生途径得到了再生植株。本发明是一种葡萄体胚一步成苗的方法，其特征是将葡萄花蕾灭菌后，无菌环境下将雄蕊取出接种到诱导培养基中黑暗条件下诱导胚性愈伤组织，并利用一种培养基配方完成从胚性愈伤组织到植株再生的全过程培养，操作简单方便，且植株再生频率较高，达到 80%以上。本发明各阶段的培养基为第(1)阶段的基本培养基是MS、NN和B5培养基(参见附表1、2、3)；第⑵阶段的基本培养基为MS、NN、B5和NN培养基大量元素+MS培养基微量元素+MS培养基铁盐+B5培养基有机元素。第(1)阶段所用激素2，4-二氯苯氧乙酸2， 4-D、6-苄基氨基腺嘌呤6-BA的不同浓度组合，另外添加硝酸银和不同浓度蔗糖；第(2)阶段所用激素6-苄基氨基腺嘌呤6-BA、萘氧乙酸Ν0Α、吲哚乙酸IAA的不同浓度组合。选优为第(1)阶段适合的基本培养基为NN培养基，所用激素及其浓度为2， 4- 二氯苯氧乙酸2,4-D 1. 0-1. 2mg · L-U-苄基氨基腺嘌呤6-ΒΑ1. 5-2. Omg · L-1，另外添加硝酸银AgN035mg · Γ1,蔗糖60g · L—1 ；第⑵阶段适合的基本培养基为NN培养基或NN 培养基大量元素+MS培养基微量元素+MS培养基铁盐+B5培养基有机元素，所用激素及其浓度为萘氧乙酸NOA 2.0mg · L_\6-苄基氨基腺嘌呤6-BA 0. 1-0. 2mg · L—1、吲哚乙酸 IAA2. 5-3. 5mg · Γ1，另外添加活性炭 AC 0. 1%0经本发明方法培养135-140天可获得再生植株。如该方法所述，愈伤组织诱导率达到90%以上，胚性愈伤组织诱导率30%以上，植株再生率达80%以上。获得的再生植株经炼苗后，用自来水洗净根系上残留的培养基，移栽到草炭蛭石珍珠岩为2 1 1的基质中遮强光，保温保湿培养1周，逐渐降低湿度，其成活率达85%以上。实施例1 (1)在葡萄品种森田尼无核盛花期，采集健康植株开花前5天的花蕾，将采集的花蕾置于4°C条件下存放2天，先用洗涤剂(例如洗衣粉、洗洁精、肥皂水、洗衣液等)清洗 5min,自来水冲洗20min，75%体积百分比浓度的乙醇消毒30S后，2%体积百分比浓度的次氯酸钠溶液消毒6min，无菌水洗涤4次，然后用无菌滤纸吸干花蕾上多余的水分备用；(2)将步骤(1)得到的花蕾置于解剖镜下，用无菌的解剖针刺破花瓣，将单个雄蕊取出接种在培养基上进行培养，培养条件为暗培养，温度；培养基配方为NN基本培养基再添加1. Omg d 4_二氯苯氧乙酸、2. Omg化、-苄基氨基腺嘌呤、5. Omg · L-1AgNO3^Og · L-1蔗糖和6g · L-1琼脂；如果配制好的培养基pH值不在5. 8 6. 0，则还需要用IN的盐酸或氢氧化钠调节培养基pH值至5. 8 6. 0 ；(3)暗培养45天后，选取步骤(2)中得到的浅黄色或白色的颗粒状、质地紧实的胚性愈伤组织，将其接种在培养基上进行培养，培养条件为暗培养，温度；培养基为NN培养基大量元素、MS培养基微量元素、MS培养基铁盐和B5培养基有机的混合，并且添加2. Omg · Γ1萘氧乙酸、0. 2mg · Π苄基氨基腺嘌呤、3. 5mg · Γ1吲哚乙酸、Ig · L—1活性炭、30g · L—1蔗糖以及7g · L—1琼脂；如果配制好的培养基pH值不在5. 8 6. 0，则还需要用IN的盐酸或氢氧化钠调节培养基pH值5. 8 6. 0 ；(4)暗培养时间30天后，将步骤(3)得到的培养物继代在与步骤(3)中同样的培养基上进行培养，培养条件为5001x弱光照培养，光照时间16h/d，温度；(5)弱光照条件下培养30天后，将步骤(4)得到的培养物同样继代在与步骤 (3)中同样的培养基上进行培养，培养条件为20001x强光照培养，光照时间16h/d，温度观士 1 °C，培养30天后，可得到森田尼无核通过体细胞胚再生的植株。实施例2 (1)在葡萄品种赤霞珠盛花期，采集健康植株开花前7天的花蕾，将采集的花蕾置于4°C条件下存放3天，先用洗涤剂(例如洗衣粉、洗洁精、肥皂水、洗衣液等)清洗lOmin， 自来水冲洗30min，75%体积百分比浓度的乙醇消毒30S后，2%体积百分比浓度的次氯酸钠溶液消毒6min，无菌水洗涤4次，然后用无菌滤纸吸干花蕾上多余的水分备用；(2)将步骤(1)得到的花蕾置于解剖镜下，用无菌的解剖针刺破花瓣，将单个雄蕊取出接种在培养基上进行培养，培养条件为暗培养，温度；培养基配方为NN基本培养基再添加1. 2mg d 4_二氯苯氧乙酸、2. Omg化、-苄基氨基腺嘌呤、5. Omg · L-1AgNO3^Og · L-1蔗糖和6g · L-1琼脂；如果配制好的培养基pH值不在5. 8 6. 0，则还需要用IN的盐酸或氢氧化钠调节培养基pH值至5. 8 6. O ；(3)暗培养50天后，选取步骤(2)中得到的浅黄色或白色的颗粒状、质地紧实的胚性愈伤组织，将其接种在培养基上进行培养，培养条件为暗培养，温度；
培养基为NN培养基，并且添加2. Omg · L—1萘氧乙酸、0. Img · Π苄基氨基腺嘌呤、2. 5mg · L-1吲哚乙酸、Ig · L-1活性炭、30g · L-1蔗糖以及7g · L-1琼脂；如果配制好的培养基PH值不在5. 8 6. 0，则还需要用IN的盐酸或氢氧化钠调节培养基pH值5. 8 6. 0 ；(4)暗培养时间30天后，将步骤(3)得到的培养物继代在与步骤(3)中同样的培养基上进行培养，培养条件为IOOOIx弱光照培养，光照时间16h/d，温度；(5)弱光照条件下培养30天后，将步骤(4)得到的培养物同样继代在与步骤 (3)中同样的培养基上进行培养，培养条件为30001x强光照培养，光照时间16h/d，温度观士 1 °C，培养30天后，可得到森田尼无核通过体细胞胚再生的植株。实施例3 (1)与实施例2中的步骤(1) 一致，不同品种换为蛇龙珠；(2)将步骤(1)得到的花蕾置于解剖镜下，用无菌的解剖针刺破花瓣，将单个雄蕊取出接种在培养基上进行培养，培养条件为暗培养，温度；培养基配方为NN基本培养基再添加1. Omg · L"12,4- 二氯苯氧乙酸、1. 5mg · L—1 6-苄基氨基腺嘌呤、5. Omg · L—1 AgN03、60g · L—1蔗糖和6g · L—1琼脂；如果配制好的培养基 PH值不在5. 8 6. 0，则还需要用IN的盐酸或氢氧化钠调节培养基pH值至5. 8 6. 0 ；(3)与实施例2中的步骤(3) —致；(4)与实施例2中的步骤(4) 一致；(5)与实施例2中的步骤⑷一致。附表1:NN基本培养基成分
权利要求
1.一种葡萄体细胞胚发生的方法，包括如下步骤(1)在葡萄盛花期，采集开花前5-7天的花蕾，将采集的花蕾置于2-4°C条件下存放2-3 天，再清洗消毒并吸干水分备用；(2)将步骤(1)得到的花蕾置于解剖镜下，用无菌的解剖针刺破花瓣，将单个雄蕊取出接种在培养基上进行培养，培养条件为暗培养，温度；(3)暗培养45 50天后，选取步骤(2)中得到的浅黄色或白色的颗粒状、质地紧实的胚性愈伤组织，将其接种在培养基上进行培养，培养条件为暗培养，温度；(4)暗培养时间30天后，将步骤(3)得到的诱导形成的体细胞胚继代在与步骤(3) 中同样的培养基上进行培养，培养条件为500-10001X弱光照培养，光照时间16h/d，温度 28 士 1°C ；(5)弱光照条件下培养30天后，将步骤(4)得到的体细胞胚同样继代在与步骤(3)中同样的培养基上进行培养，培养条件为2000-300001X强光照培养，光照时间16h/d，温度 28 士 1°C。
2.如权利要求1所述的一种葡萄体细胞胚发生的方法，其特征在于步骤(1)中清洗消毒并吸干水分是先用洗涤剂清洗5-lOmin，自来水冲洗20-30min，75 %体积百分比浓度的乙醇消毒30S后，2%体积百分比浓度的次氯酸钠溶液消毒6min，无菌水洗涤4-5次，然后用无菌滤纸吸干花蕾上多余的水分。
3.如权利要求1所述的一种葡萄体细胞胚发生的方法，其特征在于步骤O)中的培养基为NN基本培养基再添加1. 0-1. 2mg · L^2,4- 二氯苯氧乙酸、1. 5-2. < Omg · L、-苄基氨基腺嘌呤、5. Omg · L-1AgNO3AOg · L—1 蔗糖和 0. 6g/L 琼脂。
4.如权利要求1所述的一种葡萄体细胞胚发生的方法，其特征在于步骤O)中用IN 的盐酸或氢氧化钠调节培养基pH 5. 8 6. 0。
5.如权利要求1所述的一种葡萄体细胞胚发生的方法，其特征在于步骤(3)中的培养基为NN基本培养基，或NN培养基大量元素、MS培养基微量元素、MS培养基铁盐和&培养基有机元素的混合，并且添加2. Omg · Γ1萘氧乙酸、0. 1-0. 2mg · L^1B-苄基氨基腺嘌呤、 2. 5-3. 5mg · L-1吲哚乙酸、0. lg/L活性炭、3g/L蔗糖以及0. 7g/L琼脂。
6.如权利要求1所述的一种葡萄体细胞胚发生的方法，其特征在于步骤(3)中用IN 的盐酸或氢氧化钠调节培养基pH 5. 8 6. 0。
全文摘要
本发明涉及一种通过体细胞胚发生途径建立葡萄高效再生体系的方法，尤其是一种葡萄体细胞胚发生的方法。包括如下步骤(1)采集开花前5-7天的花蕾，再清洗消毒并吸干水分备用；(2)将单个雄蕊取出接种在培养基上进行培养；(3)选取浅黄色或白色的颗粒状、质地紧实的胚性愈伤组织，将其接种在培养基上进行培养；(4)将得到的诱导形成的体细胞胚继代在同样的培养基上进行培养；(5)将得到的体细胞胚同样继代在培养基上进行培养。本发明方法通过离体培养葡萄雄蕊，建立了再生体系，所获得再生植株性状均一、稳定，且操作步骤简单，易于遗传工程操作。
文档编号A01H4/00GK102499079SQ20111032219
公开日2012年6月20日 申请日期2011年10月21日 优先权日2011年10月21日
发明者徐美隆, 李健, 柳金凤, 秦彬彬, 陈春伶 申请人:宁夏林业研究所股份有限公司