专利名称：大豆食心虫核糖体蛋白基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物基因工程领域，尤其涉及一种大豆食心虫核糖体蛋白基因及其应用。
背景技术：
大豆食心虫(Leguminivora glycinivorella(Mats. Obraztsov))是我国东北大豆产区发生最严重的一种虫害，主要是幼虫蛀入豆荚危害豆粒。一般年份虫食率10% 20 %，重害年份30% 40 %，个别年份超过50 %以上。造成被害豆粒不完整或破粒，降低大豆产量和品质。黑龙江是我国大豆之乡，大豆种植面积占全国的33. 2 %，占东北的64%， 总产量占全国的37. 3%，在我国大豆生产中起着举足轻重的作用。但近年来由于气候变化和“豆麦产区”小麦种植面积逐年减少，重迎茬大豆种植比例逐渐增力卩，致使大豆食心虫发生加重。据黑龙江省植保站统计2009年黑龙江省大豆食心虫的发生面积为1720. 5万亩； 2010年大豆食心虫的发生面积为1383. 7万亩。黑龙省每年大豆种植面积都在6000万亩左右，接近1/3大豆田遭受不同程度的害虫侵害，不仅使大豆田严重减产，而且降低大豆商品质量使大豆优质率只有50% -60%，严重影响其在国际市场的竞争力。为了减少害虫对大豆产量和品质的危害，以黑龙江为例，豆农每年至少使用2次化学杀虫剂对大豆食心虫和草地螟进行防治。现在使用的化学杀虫剂都是广谱性杀虫剂，不仅杀死目标昆虫，而且杀死有益昆虫，同时化学杀虫剂在自然界可以长期存在，在土壤和河流中逐渐积累，破坏土壤和河流的生态环境；化学杀虫剂还可以通过食物链进入人体，诱发致畸、致癌、严重损害人体健康。因此各种不必利用化学农药来防治大豆害虫的方法日益受到重视。转苏云金杆菌(Bacillusthuringiensis，简称Bt)抗虫基因虽为害虫防治一度带来了希望，并在抗虫棉的应用上获得了举世瞩目的成果。培育抗大豆食心虫的大豆品种的传统育种方法虽然有效，但周期长，效率低。所以，现在需要建立一种防治大豆食心虫的新方法，能够更精确、更高效的控制大大豆食心虫，加快我国抗大豆食心虫育种研究速度。RNA干扰是利用外源导入或转录载体在体内转录的双链RNA介导受体细胞中的序列特异的同源性mRNA发生降解或翻译受阻，引发受体细胞产生转录后基因沉默，使与此相应的内源靶基因的表达被阻抑，从而得到类似于“基因敲除”的基因阻抑效果。显微注射法是RNAi研究中最广泛使用的dsRNA导入方法，该方法在蟋蟀G. bimaculatus、拟谷盗 Tribolium castaneum、家香Bombyx mori、舌甘菜液蛾S. exigua、褐飞風Nilaparvata Iugens 等昆虫中均取得成功。但显微注射法dsRNA方法只能用于研究昆虫基因功能，不能采用该方法在田间对害虫进行防控。如果利用植物表达与昆虫生长关键基因匹配的dsRNA分子， 当昆虫取食这类植物后，将这些dsRNA摄入体内，在昆虫体内发生RNA干扰现象，使关键基因的表达被明显抑制，从而达到控制害虫的目的。这就是利用RNA干扰技术防治害虫的基本过程。RNA干扰利用的是基因片段，在转录后诱导相应靶基因沉默，与常规转抗虫基因相比，RNA干扰介导的昆虫基因沉默不产生新的蛋白质，具有更高的生物安全性。由于该方法具有高效、特异、安全等特点，被认为是一种非常具有前途的控制害虫的新方法，能够更好的防治那些以农作物为食、影响农作物产量的害虫，是农作物害虫防御领域的突破。而且， 目前国内外尚无利用RNA干扰防治大豆食心虫的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种编码大豆食心虫核糖体蛋白的基因，其碱基序列如 SEQ ID NO 1 所示。本发明的第二个目的在于提供一种含有大豆食心虫核糖体蛋白基因的载体。本发明的第三个目的在于提供大豆食心虫核糖体蛋白基因在提高大豆抗食心虫能力中的应用。本发明的第四个目的在于提供一种提高大豆抗食心虫能力的方法，将大豆食心虫核糖体蛋白基因导入大豆组织或细胞，得到食心虫抗性提高的大豆，所述大豆食心虫核糖体蛋白基因的核苷酸序列如如SEQ IDNO 1所示。所述大豆食心虫核糖体蛋白基因通过含有所述大豆食心虫核糖体蛋白基因的载体导入植物组织或细胞。本发明的技术路线为1)利用分子生物学方法克隆大豆食心虫核糖体蛋白基因，命名为大豆食心虫核糖体蛋白PO基因；2)体外合成PO基因的dsRNA，利用显微注射技术将PO基因dsRNA导入到一龄末大豆食心虫幼虫体内，结果证明P0基因是大豆食心虫核糖体重要组成部分，在蛋白质的合成中起着重要作用，PO基因mRNA被降解后，大豆幼虫由于不能合成生长发育所需的蛋白质而大量死亡。本发明克隆了一种大豆食心虫核糖体蛋白PO基因，体外合成PO基因的dsRNA，利用显微注射技术将PO基因dsRNA导入到一龄末大豆食心虫幼虫体内，结果证明P0基因是大豆食心虫核糖体重要组成部分，在蛋白质的合成中起着重要作用，PO基因mRNA被降解后，大豆幼虫由于不能合成生长发育所需的蛋白质而大量死亡。该基因可以作为靶基因用于构建RNAi表达载体，用于培育高抗大豆食心虫大豆种质。
图1大豆食心虫核糖体蛋白PO基因的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图，M :DL15000DNA 分子量标准，1 引物1和引物2的PCR产物；图2大豆食心虫核糖体蛋白PO基因的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图，M :DL15000DNA 分子量标准；1 引物3和引物4PCR产物；图3大豆食心虫核糖体蛋白PO基因3’ race的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图，M DL15000DNA分子量标准；1 引物GPSl和引物GPS2PCR产物；图4大豆食心虫核糖体蛋白PO基因全长的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图，M DL15000DNA分子量标准；1 :PCR产物；图5大豆食心虫核糖体蛋白PO在大豆食心虫不同发育阶段的表达模式；图6大豆食心虫核糖体蛋白PO在大豆食心虫不同组织的表达模式；图718srDNA和PO基因目的片段体外合成的dsRNA电泳检测结果图，a)M =DNA分子量标准；1-3 :18srDNA 的 dsRNA ；4-6 :P0 基因的 dsRNA ；图8注射不同浓度POdsRNA对大豆食心虫幼虫死亡率的影响；图9注射不同浓度dsRNA对大豆食心虫幼虫POmRNA表达水平的影响；图10注射POdsRNA对大豆食心虫幼虫死亡率的影响；图11注射dsRNA对大豆食心虫幼PO基因mRNA表达水平的影响；图12注射POdsRNA对大豆食心虫幼虫体重的影响；图13注射POdsRNA对大豆食心虫幼虫发育的影响；图14RNAi植物表达载体pJawohl8_P0RNAi的构建流程图。
具体实施例方式以下结合具体实施例对本发明的技术路线做进一步详细说明。实施例1大豆食心虫核糖体蛋白PO基因克隆及序列分析利用反转录试剂盒合成cDNA第一链，根据文献报道的7个昆虫的大豆食心虫核糖体蛋白PO基因序列，利用DNAMAN软件进行保守性分析，设计2条引物引物 1 5-GATGGG (T) TAGGGAGG (A) ACAA-3 ；
引物 2 5-GNACATCGTTGATGATTTC-3利用引物1和引物2进行PCR扩增，条件为:95°C 5min，95°C lmin，57. 1°C lmin， 72°C 2min，30循环；最后72°C延伸lOmin。扩增产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳检测，产物约为479bp，电泳结果如图1所示。将PCR产物回收并进行测序。利用NCBI的Blast相似搜索分析表明，该序列与Bombyx mori等鳞翅目昆虫的核糖体蛋白PO基因同源性为80%左右， 表明该序列是大豆食心虫核糖体蛋白基因片段，而且该序列包括基因的起始密码子ATG，为大豆食心虫核糖体蛋白基因片断1。根据测序结果和7个昆虫的大豆食心虫核糖体蛋白PO基因3’端另一个保守区设计2条引物引物 3 5-GGGTACTATTGAAATCATCAACGAT-3 ；引物 4 5-TARTCRAAVAGACCRAAGCCCAT-3。利用引物3 和引物 4 进行 PCR 扩增，95°C 5min，95°C lmin,48°C lmin，72°C 2min, 30循环；最后72°C延伸lOmin。扩增产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳检测，产物约为45!3bp， 电泳结果如图2所示。将PCR产物回收并进行测序，为大豆食心虫核糖体蛋白基因片断2。根据测序结果和Takara公司3’ race试剂盒说明书，设计GPSl和GPS2条引物GPSl 5-CTTGTTGGCTATTGCTG-3GPS2 5-AGAAGAAGGTCGAGGAG-3根据3’ race试剂盒说明书利用GPSl和GPS2克隆核糖体蛋白质PO基因的3’端序列，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，产物约为261bp，电泳结果如图3所示。将 PCR产物回收并进行测序，为大豆食心虫核糖体蛋白基因片断3。将上述大豆食心虫核糖体蛋白基因片断1、片断2和片断3，3段序列利用DNAman 软件拼接成全长的大豆食心虫核糖体基因序列，利用拼接序列结果设计引物扩增基因全长，琼脂糖凝胶电泳如图4所示，将PCR产物回收并进行测序，大豆食心虫核糖体基因全长 PCR产物测序结果与3段序列拼接序列结果完全一致，全长1084bp，其碱基序列如SEQ IDNO 1所示，命名为大豆食心虫核糖体蛋白PO基因。利用ORF Finder软件预测的开放阅读框位置为2bp到95^p，3 ‘ UTR区含有推测的加尾信号AATAAA及Ploy A尾巴。大豆食心虫核糖体蛋白PO基因开放阅读框长度为 954bp，编码317个氨基酸，预测的蛋白质的分子量为34kDa，其核苷酸序列如SEQ ID NO 2 所示。大豆食心虫核糖体蛋白质序列包括3个保守功能结构域第一功能结构是位于氨基酸44-47的rRNA结合结构域；第二功能结构域是位于氨基酸182498的与核糖体蛋白质 Pl和P2互作的结构域；第三个高度保守的功能结构域位于四0-317的延伸因子结合的结构域。实施例2大豆食心虫核糖体蛋白PO基因的表达模式分析为了确定大豆食心虫PO基因在大豆食心虫不同发育时期和大豆食心虫幼虫不同组织的表达情况，从7月末8月初大豆田间出现大豆食心虫成虫开始，收集卵、幼虫、蛹、成虫四个时期的大豆食心虫样品，收集的虫样分别放入无toase的EP管后立即在液氮中冷冻，放入_80°C的低温冰箱中保存。每个试验重复3次。选取大豆食心虫3-4龄幼虫进行解剖，剖取的神经节、表皮、唾腺、中肠、卵巢、睾丸和脂肪体7个组织分别放入无toase的EP 管后立即在液氮中冷冻，放入-80°C的低温冰箱中保存。每个试验重复3次。利用Trizol reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA)提取大豆卵、幼虫、蛹、成虫四个时期和神经节、表皮、 唾腺、中肠、卵巢、睾丸和脂肪体7个组织的总RNA，利用采用!^rmentas公司M-MLV反转录酶合成cDNA第一链.以cDNA为模板，利用RT-PCR和荧光定量PCR对结果表明POmRNA的表达情况进行检测。荧光定量PCR按照Τ0Υ0Β0公司SYBR Green Realtime PCR Master Mix-Plus-的程序进行。荧光定量PCR反应中所使用的基因及其引物如下actin-s 5' GGC GACATAGCACAGCTTCTC 3'actin-a 5' ATCCTCCGTCTGGACTTGGC3‘PO-s 5' CAGCAAATCCGTATGTCCCT3‘ΡΟ-a 5' CTTGATATGCGGCAACAGC 3'RT-PCR和荧光定量PCR结果表明pOmRNA在各发育阶段均表达，包括卵、幼虫、蛹、 成虫四个时期(图5)；成虫期pOmRNA的表达量最高，幼虫的期pOmRNA表达量较高，卵中表达量最低。同时，结果发现POmRNA在这7个组织中均有表达，其中中肠的表达量最高，神经节、脂肪体POmRNA表达量较高，其他4个组织相对表达量较低(图6)。实施例3不同浓度POdsRNA对大豆食心虫幼虫死亡率的影响体外合成PO基因的dsRNA利用DNAman软件对大豆食心虫和其他鳞翅目昆虫的PO基因进行分析，选择大大豆食心虫PO基因的保守区域，根据T7RiboMAXTMExpress RNAi System试剂盒(Promega， USA)设计如下引物PoT7sense5-GGATCC-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GCACCAGCCATTCTTGACA-3Po antisense-5-CCTCGACCTTCTTCTCCT-3Po sense5-CACCAGCCATTCTTGACA-3Po T7antisense-5-GGATCC-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GCCTCGACCTTCTTCTCCT体外合成长度为349bp的POdsRNA，利用1. 5%的琼脂糖检测dsRNA片段的大小。 结果显示，合成的dsRNA与预期的结果一致，如图7所示。
不同浓度POdsRNA对大豆食心虫幼虫死亡率的影响国内外的研究结果表明只有合适浓度的dsRNA才可以引起RNAi效果，因此本发明设计了 5 μ g/ μ L(高浓度)，2. 5 μ g/ μ L(中浓度)，0. 5 μ g/ μ L(低浓度)的dsRNA进行试验，以期找到一个合适的抑制靶基因表达的浓度。禾_显微注射技术将相同体积的靶基因3 种浓度dsRNA和生理盐水分别导入到100条一龄末大豆食心虫幼虫体内，试验设3次重复。 注射后的幼虫放入温度^TC,湿度80%，光照18h的人工气候箱内利用天然饲料豆荚进行饲养，7 后统计不同浓度的大豆食心虫幼虫的死亡率，提取注射相应处理组的总RNA，利用荧光定量PCR对靶基因的mRNA表达水平进行检测。结果表明dsRNA为μ L时大豆食心虫的死亡率明显高于生理盐水和其他浓度(图8)。利用荧光定量PCR检测注射5 μ g/μ L，2. 5g/μ L，0.5 μ g/μ L三种浓度的 POdsRNA和生理盐水7 幼虫的POmRNA表达水平，结果表明注射5 μ g/ μ LdsRNA 72h时幼虫体内的PO基因的基本被沉默，而且基因表达抑制水平显著高于注射2. 5 μ g/ μ L和 0. 5 μ g/ μ L (图9)，因此表明采用浓度5 μ g/ μ L POdsRNA进行注射，PO基因沉默效果最好， 对大豆食心虫影响最大。将浓度为5 μ g/μ L的大豆食心虫pOdsRNA导入大豆食心虫幼虫1 后，幼虫的死亡率就达到了 63. 6%极显著高于对照生理盐水8%的死亡率(图10)。利用荧光定量PCR 检测PO基因mRNA相对表达水平实验结果表明，注射大豆食心虫pOdsRNA 12h后，pOdsRNA 诱导的大豆食心虫幼虫内源的PO基因mRNA降解，基本抑制96%的大豆食心虫幼虫内源的 PO基因mRNA相对表达水平(图11)。核糖体蛋白PO基因是大豆食心虫核糖体重要组成部分，在蛋白质的合成中起着重要作用，PO基因mRNA被降解后，大豆幼虫由于不能合成生长发育所需的蛋白质而大量死亡。到第IOd时注射POdsRNA的大豆食心虫幼虫的死亡率达到了 96. 8%，而对照生理盐水仅为31. 3%，进一步表明PO基因沉默后对大豆食心虫有致死作用。同时注射POdsRNA的大豆食心虫幼虫体重也显著降低低于对照(图12)，而且注射生理盐水的大豆食心虫幼虫基本发育到4龄，而注射POdsRNA的大豆食心虫幼虫大部分还处于二龄(图13)。因此表明核糖体蛋白PO基因在大豆食心虫生长发育过程中起着关键的作用，该基因可以作为靶基因用于构建RNAi表达载体，用于培育高抗抗大豆食心虫大豆种质。实施例4核糖体蛋白PO基因RNAi表达载体构建及大豆遗传转化核糖体蛋白PO基因RNAi表达载体构建核糖体蛋白PO基因RNAi表达载体构建流程参见图14，由于大豆转化效率较低， 而且转化效率因基因型不同差别很大，所以在进行体外人工合成PO的dsRNA的同时，利用introgen公司的Gateway技术构建高效植物表达载体构建，在设计扩增用于体外转录 dsRNA的PO目的片段引物时，在引物上下游的5’端加上attb特异序列形成Gateway接头， 引物具体如下Po attB 15-GGGG ACA AGT TTG TAC AM AM GCA GGC TTCCACCAGCCATTCTTGACA-3Po attB25-GGGG AC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTCCCTCGACCTTCTTCTCCT-3利用引物Po attBl和引物Po attB2以大豆食心虫cDNA为模板进行PCR扩增，条件为95°C 5min,95°C lmin,62°C lmin,72°C 2min，30 循环；最后 72°C延伸 lOmin。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，产物约为356bp，将扩增产物利用DNA凝胶回收试剂盒获得带Gateway接头的PO目的片段。利用introgen BP Clonase Enzyme Mix进行中间载体pD0NR201和Gateway接头的PO目的片段的Bp连接反应，构建带有PO目的基因片段的入门克隆(PD0NR201-P0)，利用introgen LPClonase Enzyme Mix将已构建好的入门克隆 (pD0NR201-P0)载体与植物RNAi表达载体pJawohl8_RNAi进行LP反应，构建了 PO基因的 RNAi植物表达载体pJaWOhl8-P0RNAi，PCR鉴定阳性的克隆转化子，用冻融法将构建的载体转化农杆菌LBA4404感受态细胞。大豆种子经氯气消毒处理，萌发培养7d后，将两片子叶从子叶节处纵向切开，保留2-3mm下胚轴，用解剖刀切去萌发的顶芽和侧芽，用带有植物表达RNAi载体 PJawohlS-PORNAi农杆菌浸染大豆子叶节，经ppT筛选得到TO抗性苗，利用PO基因特异性引物Po sense 5’ -CACCAGCCATTCTTGACA-3’Po antisense 5'-CCTCGACCTTCTTCTCCT-3‘对TO代抗性苗进行PCR分子检测，获得PCR阳性10株系(DN50-P0-1，DN50-P0_4， DN50-P0-5, DN50-P0-7, DN50-P0-9， DN50-P0-18， DN50-P0-18， DN50-P0-22， DN50-P0-63， DN50-P0-71)，PO植物表达RNAi载体整合到大豆中，获得表达豆食心虫POdsRNA的转基因株系。实验例转基因大豆抗食心虫性验证转基因后代材料抗食心虫鉴定在东北农业大学转基因中间试验基地进行防虫网室中进行。在防虫网室内种植稳转表达豆食心虫P0dsRNAT2代转基因株系(DN50-P0-9和 N50-P0-71)和受体材料(东农50)，每个品种种15盆，3次重复，随机排列。于8月上中旬 (5 15日)大豆食心虫成虫发生盛期到田间捕蛾，进行网室内人工接虫。接虫密度20对 /m2。每5天接虫一次，分早、中、晚三期接入，以增大成虫选择适宜豆荚产卵的机会。籽粒成熟后，每次重复随机取样10株，脱粒后调查虫食率。大豆抗虫性分级标准虫食率> 30% 为高感(HS) ；30%>虫食率彡20%为感虫⑶；20%>虫食率彡13%为中度感虫(M) ；13% >虫食率彡9%为抗虫(R)；虫食率<9%为高抗0 )。数据分析采用SAS8.02进行。结果如下表1T2转基因大豆部分农艺性状及抗虫分析
权利要求
1.一种编码大豆食心虫核糖体蛋白的基因，其碱基序列如SEQ IDNO :1所示。
2.含有权利要求1所述大豆食心虫核糖体蛋白基因的载体。
3.权利要求2所述载体为RNAi植物表达载体。
4.权利要求3所述RNAi植物表达载体为pJawohl8-P0RNAi。
5.用权利要求2-4任意一项所述含有大豆食心虫核糖体蛋白基因的载体转化的具有杀虫能力的植物细胞、组织或植株。
6.权利要求1所述大豆食心虫核糖体蛋白基因在提高大豆抗食心虫能力中的应用。
7.权利要求2所述含有大豆食心虫核糖体蛋白基因的载体在在提高大豆抗食心虫能力中的应用。
8.一种提高大豆抗食心虫能力的方法，将大豆食心虫核糖体蛋白基因导入大豆组织或细胞，得到食心虫抗性提高的大豆，所述大豆食心虫核糖体蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 1 所示。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述大豆食心虫核糖体蛋白基因通过含有所述大豆食心虫核糖体蛋白基因的载体导入植物组织或细胞。
全文摘要
本发明涉及植物基因工程领域，提供了一种大豆食心虫核糖体蛋白P0基因，其碱基序列如SEQ ID NO1所示。体外合成P0基因的dsRNA，利用显微注射技术将P0基因dsRNA导入到一龄末大豆食心虫幼虫体内，结果证明P0基因是大豆食心虫核糖体重要组成部分，在蛋白质的合成中起着重要作用，P0基因mRNA被降解后，大豆幼虫由于不能合成生长发育所需的蛋白质而大量死亡。该基因可以作为靶基因用于构建RNAi表达载体，用于培育高抗大豆食心虫大豆种质。
文档编号A01H5/00GK102399787SQ201110338659
公开日2012年4月4日 申请日期2011年10月31日 优先权日2011年10月31日
发明者孟凡立, 张大勇, 李文滨, 王志坤 申请人:东北农业大学