专利名称：一株防治茄果类蔬菜土传病害枯草芽孢杆菌pts-394及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生防菌剂及其应用，尤其是一株枯草芽孢杆菌PTS-394及其在防治茄果类蔬菜两种重要土传病害(枯萎病和青枯病)中的应用。
背景技术：
随着种植业结构的调整，设施蔬菜种植面积逐年增加，高产、连作、多样化的设施蔬菜种植布局为病虫害提供了充裕的营养和繁殖条件。因此，近年来设施蔬菜的重大病害频繁暴发。目前，设施蔬菜生产上防治病害主要依靠化学农药。这不仅造成生态环境严重污染，而且直接增加蔬菜中有毒化学物质的残留，对人类健康带来严重危害。为了解决蔬菜产量和质量之间矛盾，达到防治植物病害、减少化学农药的使用量的目的，使用生物防治控制植物病害的方法越来越受到各国政府和人民的关注。生物防治主要是利用生物多样性，通过在自然界释放或引进有益生物，可持续控制植物病害。1950年以来国内外均开展了利用生防菌剂防治植物病害的研究，取得了初步成效。如利用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)防治水稻纹枯病、大豆锈病、大白菜软腐病等；利用荧光假单胞杆菌(Fluorescent pseudomonads)防治棉花、亚麻、苜蓿、黄瓜等作物的镰刀菌枯萎病；利用酵母菌(Candida saitoana)、丁香假单胞菌(I^eudomonas syringae)和成团泛菌(Pantoea agglomerans)防治多种水果采后病害等等。茄果类蔬菜枯萎病(病原菌为尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici)和青枯病(病原菌为茄青枯劳尔氏菌Ralstonia solanacearum)
中的两种主要土传病害。青枯病又称细菌性枯萎病，田间发病症状与枯萎病非常相似多在番茄开花期间发生，随着坐果及果实膨大，病情逐渐加重。病原菌侵染维管束，阻塞其输送营养物质，病茎纵切面维管束变褐。相似的病症给两种病害的诊断和防治带来了很大难题。 已报道的枯萎病生防菌剂主要有木霉菌、非致病尖孢镰刀菌、假单孢菌和芽孢杆菌等；青枯病生防菌剂主要有无致病力青枯菌和芽孢杆菌等。但是，目前这些生防菌剂都是针对单一病害为作用靶标，由于两种病害病症相似，生产上经常发生用药不当，从而导致防效不佳。解决这个问题的途径之一就是以茄果类蔬菜枯萎病菌和青枯病菌为靶标菌，筛选、鉴定对两种病原菌皆具拮抗作用的生防菌剂并田间应用。江苏省农科院从宁夏银川、江苏沭阳、福建厦门和云南昆明等地的番茄、辣椒、西瓜等作物根际土壤中，分离纯化获得1239个细菌分离物。筛选获得对多种真菌病害有很好防效的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)PTS-394。其特性记载为A、形态特征枯草芽孢杆菌PTS-394菌株营养体为杆状，两端椭圆，周生鞭毛。大小为(0. 7 0. 8)微米X O. 0 3. 0)微米。无荚膜。芽孢中生，椭圆形，大小为(0. 6 0. 9)微米X (1. 0 1. 5)微米。B、菌落形态特征枯草芽孢杆菌PTS-394在牛肉汁蛋白胨琼脂平板上培养时，菌落边缘波浪形，米色，表面有皱褶。质地为不透明状，不产生色素。
C、生理生化特性枯草芽孢杆菌PTS-394革兰氏反应阳性。H2A酶反应阳性， V. P.反应阳性。L-阿拉伯糖、D-葡萄糖、D-木糖、D-甘露醇利用为阳性。淀粉水解、明胶液化、柠檬酸钠利用、二羟基丙酮形成反应也均为阳性。最佳生长温度30°C，55°C以上不生长。D、种属鉴定枯草芽孢杆菌PTS-394的DNA提取采用常规方法，采用1 %琼脂糖凝胶电泳检测其纯度和浓度。以提取的基因组DNA为模板，用细菌通用引物扩增16S rRNA序列。引物 BSF(27f) :AGAGTTTGATCCTGGCTCAG ；BSR(1541r) :AAGGAGGTGATCCAGCCGCA。PCR 反应条件95°C 4min ；94°C 40s, 55°C 45s, 72°C lmin，25 个循环；72°C 5min，PCR 产物经 1 %琼脂糖凝胶电泳验证后，送上海生工生物工程技术服务有限公司测序，将测得的16S rRNA序列在NCBI核酸数据库上采用Blast程序进行同源性搜索。测序结果显示枯草芽孢杆菌 PTS-39416S rRNA序列与枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis有很高的同源性，递交GenBank 获取基因登录号为JF419551。E、枯草芽孢杆菌PTS-394还具有许多优良性能，如生长速度快；适应环境能力强；能在土壤和植物表面定殖，并形成优势种群；诱导寄主产生抗病性；分泌产生多种抗菌物质。目前，将生防菌剂(枯草芽孢杆菌PTS-394)用于防治茄果类蔬菜两种重要土传病害(枯萎病和青枯病)并未见诸报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) PTS-394，该菌株已于2011年2月M日在NCBI核酸数据库GenBank上获取基因登录号JF419551。本发明的另一目的是针对目前生产上茄果类蔬菜两种重要土传病害(枯萎病和青枯病)病症相似，难以诊断和防治不佳的问题，筛选获得一株对枯萎病和青枯病均具有良好防治效果的生防菌剂(枯草芽孢杆菌PTS-394)及其应用。枯草芽孢杆菌PTS-394能在植物根围迅速定殖，形成优势种群；分泌抗菌相关物质；诱导植物抗病性；从而实现利用该生防菌剂持久控制茄果类蔬菜土传病害流行的目的。本发明提供了一种生防菌剂，其中有效活性成分由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)PTS-394 组成。本发明所述的生防菌剂，其中枯草芽孢杆菌PTS-394分泌的代谢产物中包括蛋白酶和嗜铁素两种抗菌相关物质。本发明所述的生防菌剂，它是水剂或可湿性粉剂。水剂各组分的重量百分比为
枯草芽孢杆菌PTS-394发酵液中菌含量 101()-2xl01() cfu/mL 助剂0.5%-20%
表面活性剂0%-20°/o防腐剂
水
pH
0.1%-0.5%
余量
4.0-7.0可湿性粉剂各组分的重量百分比为
枯草芽孢杆菌PTS-394粉剂(菌含量101Q-5xl01Qcfu/g) 10%-90%本发明所述的生防菌剂，其中助剂可任选一种或多种下列物质ΝΝ0(亚甲基二萘磺酸钠)、氮酮、噻酮；粘合剂可任选一种或多种下列物质聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚乙烯醇(聚合数12000-20000)；表面活性剂可任选一种或多种下列物质十二烷基磺酸钠、 十二烷基苯磺酸钠、木质素磺酸钠、茶枯粉、皂角粉；防腐剂可任选一种或多种下列物质 苯甲酸钠、山梨酸钾、脱氢乙酸钠、丙酸钙、双乙酸钠。填充剂可任选一种或多种下列物质 轻质碳酸钙、硅藻土、高岭土、绢云母粉和白碳黑。本发明所述的生防菌剂的用途是将所述的生防菌剂稀释后灌入蔬菜根部用于防治多种土传病害；其特征包括所述的土传病害是茄果类蔬菜枯萎病和青枯病。本发明进一步提供了所述生防菌剂的应用，其特征在于成品药剂稀释后的有效药物成分含量 104-108Cfu/mL 或 104-108cfu/g。本发明的优点在于通过引进对人畜安全、对茄果类蔬菜枯萎病、青枯病均具有较强抑制作用的枯草芽孢杆菌PTS-394，达到利用一种生防菌剂同时防治茄果类蔬菜两种重要土传病害的目的；减少化学药剂用药量、降低用药成本；同时改善生态环境、减少了化学药剂在蔬菜中的残留量。
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1是枯草芽孢杆菌PTS-394及其稀释液对番茄枯萎病菌菌丝生长的抑制作用。 图2是枯草芽孢杆菌PTS-394及其稀释液对番茄青枯病菌的抑制作用。 图3是枯草芽孢杆菌PTS-394能产生嗜铁素。 图4是枯草芽孢杆菌PTS-394能产生蛋白酶。
图中A 枯草芽孢杆菌PTS-394原液；A-I 枯草芽孢杆菌PTS-394的100倍稀释液； A-2 枯草芽孢杆菌PTS-394的500倍稀释液；B 番茄枯萎病菌。
具体实施例方式实施例1、枯草芽孢杆菌PTS-394对枯萎病菌和青枯病菌的抑制作用。供试病原菌菌株番茄枯萎病菌由江苏省农科院植保所提供。用PSA培养基(200g马铃薯、20g蔗
助剂粘合剂表面活性剂填充剂 pH
1%-20% 2%-20% 0.5%-20% 10%-90% 6.0-7.0糖、20g琼胶和IOOOmL蒸馏水，pH 5. 6 6. 6) 培养5d，备用。番茄青枯病菌由江苏省农科院植保所提供。用NA培养基(牛肉浸膏3. 0g，酵母膏lg，蛋白胨5g，葡萄糖10g，琼脂20g，蒸馏水IOOOmL) 28°C振荡(150rpm/min)培养2d，备用。将江苏省农业科学院筛选获得的枯草芽孢杆菌PTS-394在NA培养基上进行活化，然后移入50mL NA培养液中，在下振荡(150rpm/min)培养2d，备用。番茄枯萎菌饼(直径为7mm)置于空白PDA平板一侧(距平板边缘30mm)。平行另一侧(距平板边缘 30mm)放置5mm灭菌滤纸片(距平板中心30mm)，滤纸片加入不同稀释倍数的枯草芽孢杆菌 PTS-394菌液5yL。每处理重复3皿。设清水对照。恒温培养，待对照平板菌落长满时测量调查病原菌菌落直径，并计算抑制率。抑制率=(对照病原菌菌落直径-处理病原菌菌落直径)/对照病原菌菌落直径X 100 %。吸取青枯菌液涂布NA平板(0. 3mL菌液/平板)。培养皿成十字架形放置4张灭菌滤纸片，滤纸片上加入不同稀释倍数的枯草芽孢杆菌PTS-394菌液5 μ L 设清水对照。每处理重复3皿。恒温培养2d，测量抑菌圈直径。试验结果见表1、图1-2。试验结果表明枯草芽孢杆菌PTS-394原液、100倍稀释液和500倍稀释液对番茄枯萎病菌和青枯病菌均具有较强的抑制作用。表1枯草芽孢杆菌PTS-394对番茄枯萎病菌和青枯病菌的抑制作用如图1和图2所示。实施例2枯草芽孢杆菌PTS-394代谢分泌物-抗菌相关物质的产生供试材料蛋白酶检测培养基脱脂奶粉100g，琼脂20g，定容至1000mL。几丁质酶检测培养基胶状几丁质 15g，MgS04 ·7Η20 0. 5g，FeSO4 · 7Η20 0. OlgjK2HPO4 0. 7g, KH2PO4 0. 3g、琼脂20g，定容至IOOOmL, ρΗ7· 0 7. 2。纤维素酶检测培养基蛋白胨10g，酵母粉 10g，羧甲基纤维素钠log, NaCl 5g，KH2PO4 lg，琼脂20g，定容至IOOOmL, ρΗ7· 0。嗜铁素检测培养基=CAS 60. 5g，IOmL 三价铁溶液(lmmol. L^1FeCl3 ·6Η20)，HDTMA 72. 9g，琼脂 20g,定容至 lOOOmL，pH7. 0。将江苏省农业科学院筛选获得的枯草芽孢杆菌PTS-394在NA培养基上进行活化， 然后移入50mL NA培养液中，在下振荡(150rpm/min)培养2d，备用。蛋白酶检测蛋白酶检测培养基平板中央放置5mm灭菌滤纸片，每张滤纸片上滴
6拈抗菌液5 μ L。每处理重复4皿。培养2d，观察有无透明圈产生。几丁质酶检测几丁质酶检测培养基中央放置5mm灭菌滤纸片，每张滤纸片上滴拈抗菌液5 μ L。每处理重复4皿。培养3 7d，观察有无透明圈产生。纤维素酶检测纤维素酶检测培养基平板中央放置5mm灭菌滤纸片，每张滤纸片上滴拮抗菌液5 μ L。每处理重复4皿。培养3 7d，观察有无透明圈产生。嗜铁素检测嗜铁素检测培养基平板中央放置5mm灭菌滤纸片，每张滤纸片上滴检拮抗菌液5 μ L。每处理重复4皿。培养3 7d观察颜色变化，若有桔黄色晕圈产生，则有嗜铁素产生。试验结果表明枯草芽孢杆菌PTS-394不能分泌几丁质酶和纤维素酶；能分泌蛋白酶；也能分泌嗜铁素，在测试平板上能螯合三价铁离子，形成淡黄色晕圈(图3和图4)。如图3和图4所示。实施例3200亿枯草芽孢杆菌PTS-394水剂的配制A、菌种准备及活化。NA培养基(同实施例1)按常规方法灭菌，做成斜面，预培养2天后，接种枯草芽孢杆菌PTS-394，培养温度；培养时间2天。B、液体发酵。—级发酵将上述培养好的试管斜面，用接种环移一环菌苔入500mLNA培养液(同实施例1)中，共移2瓶。在下振荡(150rpm/min)培养2d，备用。二级发酵培养基配方豆饼粉^^，大豆粉化日^^，酵母粉。.15%，玉米粉 2. 0%，鱼粉 1. 0%，NaCl 0.05%,CaCO3 0.3%。消前pH 7. 5。2 吨发酵罐中投料 1 吨。121°C 灭菌30分钟。冷却至30°C左右时接种上述一级发酵菌种液1000mL。液体发酵温度30°C， 搅拌转速250rpm/min。通气量1 1.5。发酵周期为M小时。三级发酵培养基配方同二级发酵。15吨发酵罐中投料10吨。121°C灭菌30分钟。 冷却至30°C左右时接种上述二级发酵菌种液1吨。液体发酵温度33°C，搅拌转速300rpm/ min。通气量1 1.5。发酵周期为36小时左右，发酵液中90%菌体形成芽孢时放罐。C、水剂配置。 发酵液放入储罐中，加入NNO (亚甲基二萘磺酸钠)0. 5 %、十二烷基苯磺酸钠6 %、 苯甲酸钠0. 1 %，搅拌均勻。测得发酵液PH值为5. 4，活芽孢数为2 X 101(lCfU/mL。实施例4200亿枯草芽孢杆菌PTS-394可湿性粉剂的配制A、菌种准备及活化。同实施例3。B、液体发酵。同实施例3。C、制备活菌原粉。将发酵液放入沉降池中，利用等电点沉降3天后，经碟片式离心机离心去水，留菌浆。菌浆中按体积加入10% (w/v)的轻质碳酸钙(细目325目)，用喷雾干燥方法将菌浆喷干成枯草芽孢杆菌PTS-394的芽孢原粉。喷雾干燥时进口温度175°C，出口风温72°C。测得原粉中活芽孢数5X 101QCfU/g。
D、制备可湿性粉剂助剂选择NNO(亚甲基二萘磺酸钠)；粘合剂为聚乙二醇；表面活性剂为十二烷基苯磺酸钠；填充剂为轻质碳酸钙。将各组分按照下列重量百分比备料枯草芽孢杆菌PTS-394活菌原粉40%;NN0(亚甲基二萘磺酸钠)7%;聚乙二醇 3% ；十二烷基苯磺酸钠5% ；轻质碳酸钙45%。制备过程将枯草芽孢杆菌PTS-394活菌原粉等按上述比例置于混合器中，混合均勻后，经气流粉碎机粉碎至325目过筛，包装，即成200亿枯草芽孢杆菌PTS-394可湿性粉剂。实施例5200亿枯草芽孢杆菌PTS-394水剂对番茄枯萎病和青枯病的盆栽防治试验。试验时间于2010年10月1日左右(番茄落种)在江苏省农科院温室内进行。试验品种江蔬一号(由江苏省农科院蔬菜所提供)。供试病原菌菌株番茄青枯病菌制备同实施例1。番茄枯萎病菌孢子液的制备如下将实施例1中的平板用无菌水洗下，打散，使之成均勻的孢子悬浮液。显微镜下用血球计数板计数，用无菌水调至浓度106孢子/mL。试验药剂和对比药剂200亿枯草芽孢杆菌PTS-394水剂由实施例3提供。对照药剂为50%多菌灵(由江苏辉丰农化股份有限公司提供)和72%农用硫酸链霉素(由河北省石家庄曙光制药厂提供)，它们都是生产上防治枯萎病和青枯病的常用化学药剂。田间药效试验将江蔬1号番茄种播于灭菌土壤中，当番茄苗长出6片真叶时，移
田ο枯萎病防治试验将秧苗移栽至装有IOOg无菌土的盆钵中，每盆1株。每株番茄苗灌根20mL枯萎病菌孢子液(浓度为IO6孢子/mL)，6h后灌根20mL枯草芽孢杆菌PTS-394 水剂(菌含量为108Cfu/mL)。每处理20盆，常规管理。清水和常用化学药剂50%多菌灵为对照。生长30d后调查病情，计算防效。青枯病防治试验将秧苗移栽至装有IOOg无菌土的盆钵中，每盆1株。每株番茄苗灌根20mL枯草芽孢杆菌PTS-394水剂(菌含量为108cfu/mL)，6h后灌根20mL青枯菌液 (菌含量为108CfU/mL)。每处理20盆，常规管理。清水和72%农用硫酸链霉素为对照。生长30d后调查病情，计算防效。番茄枯萎病和青枯病发病症状非常相似，病情分级标准如下0级为茎内维管束正常，外部无症状；1级为茎内维管束1/4以下变色；3级为茎内维管束1/4 1/2变色；5 级为茎内维管束1/2 3/4变色；7级为茎内维管束3/4以上变色，部分叶片萎蔫；9级为整株枯死。病情指数=[(各级发病数X各级代表值)/(调查总株数X最高级代表 it)] XlOO防治效果(％)=[(对照的病情指数-防治的病情指数)/对照的病情指数]X100%
试验结果见表(表幻。人工接种后，番茄枯萎病的病情指数是48. M %，番茄青枯病的病情指数为78. 39%。枯草芽孢杆菌PTS-394水剂对番茄枯萎病和青枯病的防效较高， 分别为77. 40%和74. 49%。常规化学药剂多菌灵和农用硫酸链霉素盆栽防效均不理想，分别为46. 09%和55. 35%，明显低于枯草芽孢杆菌PTS-394水剂的防治效果。表2枯草芽孢杆菌PTS-394水剂对番茄枯萎病菌和青枯病菌的盆栽防治效果
权利要求
1.一种生防菌剂，其中有效活性成分由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)PTS-394 组成。
2.根据权利要求1所述的生防菌剂，其中，枯草芽孢杆菌PTS-394分泌的代谢产物中包括蛋白酶和嗜铁素两种抗菌相关物质。
3.根据权利要求1-2所述的生防菌剂，其特征在于，它是水剂或可湿性粉剂。
4.根据权利要求3所述的生防菌剂，其中水剂各组分的重量百分比为 枯草芽孢杆菌PTS-3^发酵液中菌含量 101G-2xl01G cfu/mL 助剂0.5%-20%表面活性剂0%-20%防腐剂0.1%-0.5%水余量pH6.0-7.0
5.根据权利要求3所述的生防菌剂，其中可湿性粉剂各组分的重量百分比为 枯草芽孢杆菌PTS-394粉剂(菌含量101G-5xl01GcfU/g) 10%-90% 助剂1%-20% 粘合剂 2%-20% 表面活性剂 0.5%-20% 填充剂 10%-90% pH 6.0-7.0
6.根据权利要求4-5所述的生防菌剂其中助剂可任选一种或多种下列物质ΝΝ0(亚甲基二萘磺酸钠)、氮酮、噻酮；粘合剂可任选一种或多种下列物质聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚乙烯醇(聚合数12000-20000)；表面活性剂可任选一种或多种下列物质十二烷基磺酸钠、十二烷基苯磺酸钠、木质素磺酸钠、茶枯粉、皂角粉；防腐剂可任选一种或多种下列物质苯甲酸钠、山梨酸钾、脱氢乙酸钠、丙酸钙、双乙酸钠。填充剂可任选一种或多种下列物质轻质碳酸钙、硅藻土、高岭土、绢云母粉和白碳黑。
7.—种权利要求1-6所述的生防菌剂的用途，其特征在于将所述的生防菌剂稀释后灌入蔬菜根部用于防治土传病害。
8.根据权利要求7所述的生防菌剂的应用，其特征在于所述的生防菌剂可以同时防治茄果类蔬菜两种重要土传病害(枯萎病和青枯病)。
9.根据权利要求7或8所述的生防菌剂的应用，其特征在于成品药剂稀释后的有效药物成分含量 104-108Cfu/mL 或 104-108cfu/g。
全文摘要
本发明涉及一种生防菌剂，其中有效活性成分由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)PTS-394组成。其特征在于该生防菌剂是水剂或可湿性粉剂。水剂中各组分的重量百分比为枯草芽孢杆菌PTS-394菌含量为2×1010cfu/mL；NNO(亚甲基二萘磺酸钠)0.5％、十二烷基苯磺酸钠6％、苯甲酸钠0.1％。可湿性粉剂各组分的重量百分比为枯草芽孢杆菌PTS-394活菌原粉(菌含量5×1010cfu/g)40％；NNO(亚甲基二萘磺酸钠)7％；聚乙二醇3％；十二烷基苯磺酸钠5％；轻质碳酸钙45％。应用时，将上述生防菌剂稀释后灌入蔬菜根部用于防治蔬菜土传病害，主要是茄果类蔬菜枯萎病和青枯病；成品药剂稀释后的有效药物成分含量104-108cfu/mL或104-108cfu/g。其优点是通过引进对人畜安全、对茄果类蔬菜枯萎病菌、青枯病菌均具有较强抑制作用的枯草芽孢杆菌PTS-394，达到利用一种生防菌剂同时防治两种土传病害；减少化学药剂用药量、降低用药成本；同时改善生态环境、减少了化学药剂在蔬菜中的残留量。
文档编号A01P3/00GK102550607SQ201110339098
公开日2012年7月11日 申请日期2011年11月1日 优先权日2011年11月1日
发明者乔俊卿, 刘邮洲, 梁雪杰, 聂亚峰, 陈志谊 申请人:江苏省农业科学院