专利名称：改造的cryX基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及苏云金芽孢杆菌对鳞翅目害虫高毒力的新的杀虫基因cryX及其应用。
背景技术：
虫害是造成农作物减产的重要原因之一，减少虫害的损失是增加粮食与饲料作物产量的重要途径。据统计全球粮食与饲料作物总产量每年因虫害造成的损失达14%，直接给农业生产造成的经济损失高达数千亿美元。我国每年因虫害造成的损失水稻减产10%、 小麦减产20%、棉花减产30%以上[夏启中，张明菊，抗植物虫害基因及其应用，鄂州大学学报，2005，(5) :56-60.]。采用喷施化学农药和生物杀虫剂等防治手段固然可以减轻害虫对农作物的为害，但化学农药造成环境污染，生物杀虫剂成本较高。长期以来，大量喷施化学杀虫剂，不仅会增强害虫的抗药性，使益虫及其它生态区系遭受破坏，而且严重污染环境，提高生产成本，破坏生态平衡。因此，减少杀虫剂使用量，发展现代植物保护技术，已成为可持续发展农业中必须正视的课题之一。苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)是一种分布广泛的革兰氏阳性细菌，是一种对害虫毒力强且对天敌无毒性的昆虫病原微生物，对高等动物和人无毒性。它是目前研究最为深入、使用最为广泛的微生物杀虫剂，对16个目3000多种害虫有活性。Bt在芽孢形成期可形成杀虫晶体蛋白(Insecticidal CrystalProteins, ICPs),也称 5-内毒素(delta-endotoxin) [Bravo. A. , Gill S. S. , Soberon M. Bacillus thuringiensis Mechanisms and Use. Comprehensive Molecular Insect Science Elsevier, 2005,175 206.]，它的形状、结构和大小均与其毒力有着密切关系[Schn
E, Crickmore. N, Van Rie. J. , Lereclus. D, Baum. J, Feitelson. J, Zeigler. D. R. , Dean. D. H. Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins. Microbiol. Mol. Biol. Rev, 1998,62(3) :775-806.]。从 1981 年，Schn印f 和 Whiteley 克隆了第一个编码
6-内毒素的cryIAal基因，截止2008年6月已发现和克隆了 412种ICPs基因。苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白因其杀虫效果好、对人畜无害[De Maagd R. A. , Bravo A. , Crickmore N. How Bacillus thuringiensis has evolved specific toxins to col onize the insect world. Trends Genet, 2001,17 :193 199.],不污染环境，因而Bt在害虫的生物防治中得到了最广泛的应用。1996年全世界第一例转基因抗虫植物在美国获准应用，它使用的基因来自Bt crylAc。在接下来的几年里,转cryIAb基因的抗虫玉米,转cry3Aa基因的抗虫土豆等相距问世。在中国，自1998年开始正式推广含有crylAc/crylA基因的抗虫棉以来，已经被普遍种植。在转基因作物商业化的第一个12年(1996-2007)中，由于能得到持续稳定的收益，农民种植转基因作物量逐年增加。2009年有25个国家的1400万小农户和大农场主种植了 1.34亿公顷(3.3亿英亩)的转基因作物，比2008年增长了 7%，即900万公顷(2200万英亩)，达到历史最高点；相应的“性状或实际面积”增长了 8%，即相比2008年的1.66亿公顷，增长了 1400万公顷，达到2009年的1. 8亿公顷。1996年至2009年间转基因作物种植面积空前地增长了 80倍，使转基因成为农业近代史上利用最快的作物技术。由于目前商品化的转基因抗虫作物的抗虫基因种类比较单一，如此大面积推广种植存在害虫避难所减少与害虫抗药性上升的风险。因此需要不断分离高毒力的或者新的基因组合来避免害虫抗药性上升的风险。因此，筛选分离克隆新的、高毒力的Bt杀虫基因，可以丰富杀虫基因资源，为转基因作物与工程菌株提供新的基因来源，提高Bt转基因产品的抗虫效果，并且可以降低害虫对Bt毒蛋白的抗性风险，避免新的生态灾难降临，具有重要的经济、社会和生态效益。
发明内容
本发明提供一种新的对小菜蛾、玉米螟、棉铃虫等鳞翅目害虫具有高毒力的苏云金芽孢杆菌晶体杀虫蛋白基因序列，以应用于转化微生物，使之表现出对相关害虫的毒性， 并克服、延缓害虫对工程菌的抗药性产生。对鳞翅目害虫高毒力的杀虫基因蛋白CryX，其具有如SEQ ID N02所示的第31 位-601位氨基酸序列。对鳞翅目害虫高毒力的杀虫基因蛋白CryX，其具有如SEQ ID N02所示的氨基酸序列。对鳞翅目害虫高毒力的杀虫基因cryX，其核苷酸序列编码上述杀虫基因蛋白 CryX0对鳞翅目害虫高毒力的杀虫基因cryX，其具有如SEQ ID NOl所示的核苷酸序列。对鳞翅目害虫高毒力的杀虫基因cryX，其具有如SEQ ID N03所示的核苷酸序列。一种表达载体，其含有上述杀虫基因cryX。所述表达载体为pUX，其结构如图4中所示。对鳞翅目害虫高毒力的杀虫基因cryX在防治鳞翅目害虫中的应用。所述应用为将上述杀虫基因蛋白CryX制成杀虫剂用于防治鳞翅目害虫，或者将上述杀虫基因cryX转入植物或微生物中表达抗鳞翅目害虫的特性。所述植物为玉米。本发明是从菌株T0;3B001 (保藏号BGSC No. 4 API，公众可以从中国农业科学院植物保护研究所取得)克隆得到的一个新基因，全长为1.8Kb，其核苷酸序列为SEQ ID N01, 其编码的氨基酸序列为600个见SEQ ID N02所示，通过分析比例，该蛋白氨基酸序列的31 位至601位氨基酸是该蛋白的杀虫活性区域。经过杀虫活性测定，该基因蛋白对小菜蛾、玉米螟、棉铃虫有高毒力。针对上述杀虫活性区氨基酸序列，本发明设计合成了用于转基因植物开发的DNA 序列，如SEQ ID N03所示。该合成序列导入到玉米中，对玉米螟有较好的抗虫活性。
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图IcryX阳性克隆PCR鉴定其中I, I. 9kb PCR 产物 M，入/Ecol30I图2CryX在大肠肝菌中的表达图3序列比对图Query 为 SEQ ID N03Sbjct 为原有 cryX 序列，即 SEQ ID NOl图4表达载体pUX构建流程5植物表达载pUlAi的酶切鉴定其中M :入DNA/Ecol30I，I :pUlAi/Sac I+BamH 1,2 pT8A/Sac I+BamH 1,3 p3300-Ubi/Sac I+BamH I图6抗性植株PCR检测M DM2000 P pUX CK :阴性对照I 9 :部分转基因植株图7PCR阳性植株中CryX蛋白占可溶性蛋白比例图8T0代转基因植株的玉米螟生物活性测定A，B :未转化植株C :转基因植株
具体实施例方式菌株T03B001 (保藏号BGSC No. 4 API，公众可以从中国农业科学院植物保护研究所取得)杀虫活性测定将菌株接种到LB固体培养基上，培养72小时，至芽孢与晶体释放。将芽孢与晶体用灭菌水洗下来，悬浮起来，稀释到I亿芽孢每毫升的浓度用于杀虫活性测定。以小菜蛾、 玉米螟、棉铃虫，测定对鳞翅目害虫的杀虫活性。结果显示该浓度的芽孢晶体混合物对小菜蛾、玉米螟、棉铃虫具有高活性。三种试虫的死亡率都为100%。设计引物扩增cryX全长基因用solexa方法对T03B001基因组测序。利用已经报道的Bt杀虫基因作为比对数据库进行基因筛选。结果如下表所示，其中contig00361编码的基因与crylCa最为相似,但是得分(score)也只有174,说明这是一
个新基因。
QueryNameScoreE-valueOverlap/totalIdentitySbjectNamecontig00023558602923/295898cry9ebcontig00360691203506/351099cry9dacontig00360229001440/153693cry9dacontig003611740154/17682crylCacontig00363538802894/295597cry9aa
根据COntig00361编码的基因设计了一对引物(LIU5/LIU3)，序列如下LIU5-ATGAATTCAAAGGAACATGATTATCTLIU3-TTCAACAGGAATAAATTCAATTTTATCC通过PCR扩增的方法，以IXXBBOOl的基因组为模版，克隆cryX基因全长，见图1，连接PEB表达载体得到阳性克隆。获得的重组表达载体质粒命名为pEBs6。用pfuDNA聚合酶，用如下体系进行PCR扩增。。
权利要求
1.改造的cryX基因，其具有如SEQID N03所示的核苷酸序列。
2.一种表达载体，其含有权利要求1所述的改造的cryX基因。
3.如权利要求2所述的表述载体，其为pUX，结构如图4中所示。
4.权利要求1所述的改造的cryX基因在杀害鳞翅目害虫中的应用，所述应用将权利要求2或3所述的表达载体转入植物或微生物中，表达抗鳞翅目害虫的特性。
5.如权利要求4所述的应用，所述植物为玉米。
6.如权利要求4所述的应用，所述鳞翅目害虫为棉铃虫，亚洲玉米螟、小菜蛾。
全文摘要
本发明涉及“改造的cryX基因及其应用”属于生物技术领域。改造的cryX基因，其序列如SEQ ID NO3所示，应用于转化微生物或植物，使之表现出对相关害虫的毒性，并克服、延缓害虫对工程菌的抗药性产生，实验表明，其表达CryX蛋白的含量最高可占总可溶蛋白的0.21％。
文档编号A01H5/00GK102533792SQ20111039676
公开日2012年7月4日 申请日期2010年6月2日 优先权日2010年6月2日
发明者刘东明, 宋福平, 张 杰, 束长龙, 耿丽丽, 黄大昉 申请人:中国农业科学院植物保护研究所