专利名称：一种双元载体的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域。本发明主要涉及一种双元载体。
背景技术：
自植物转化用双元载体(binary vector)的概念(Hoekema等1983 ；Bevan, 1984)形成以来，有大致三代的多样化实用型的双元载体得到发展。第一代双元载体以 pBIN19 (GenBank 登录号 U09365，Frisch 等 1995)为代表，包括 ρΒΙΙΟΙ. 1、pBI121 和 pBINm-gfp5-ER等衍生载体，其结构紧凑，但其T-DNA结构不够理想，表现在(1)抗性选择标记基因位于RB端，而目的基因在LB端，会导致在获得的抗性转基因植物中目的基因容易发生缺失；(2)T-DNA内的抗性选择标记基因的转录方向不好，理想的设置是指向T-DNA的外侧。第二代双元载体是对第一代双元载体的修改，其将T-DNA内的抗性选择标记基因设置在LB端，且指向T-DNA的外侧；代表性的载体如pGPTV系列(Becker等1992)和pBINPLUS (van Engelen等1995)；其中，pGPTV系列的T-DNA外侧完全同pBIN19，大小为8590 bp，而 pBINPLUS的T-DNA外侧是在pBIN19的基础上，插入了一个额外的大肠杆菌复制子ColEl， 以期提高该载体的拷贝数。由于第一代和第二代双元载体的T-DNA外侧序列较大，将导致双元载体的整体偏大，从而使T-DNA中重组进外源DNA的大小或外源基因数量受到限制， 而载体越大操作难度也越大。第三代双元载体采用了第二代双元载体的T-DNA结构，并尽可能地降低T-DNA外侧序列的大小；代表性的载体如pCAMBIA系列(Roberts等2000)，其 T-DNA外侧序列大小为6259 bp。但是，第三代双元载体仍然较大，限制了较大外源目的基因或多基因的插入。 T-DNA整合进植物基因组过程中，外源基因是否完整整合进基因组，且T-DNA在染色体的具体整合位置和整合位点的旁侧序列，均难以准确地确定，影响了转基因植物的法定鉴定。
发明内容
本发明的目的是提供了一种小型化的、装载量较大的、可以确定转基因整合位点的双元载体。本发明的目的是通过如下技术方案实现的
一种双元载体，带有T-DNA，其T-DNA内侧带有抗性基因和抗性基因的启动元件和终止元件，其特征是所述抗性基因为原核抗性基因，且所述启动元件和终止元件分别为真核启动子和终止子；原核抗性基因位于真核启动子和终止子之间、紧邻T-DNA的LB端；带有一个复制子ColEl ；T-DNA外侧没有原核抗性基因和ColEl复制子。进一步地，上述双元载体带有的原核抗性基因为新霉素磷酸转移酶原核表达基因 (npt II m基因)或者潮霉素原核抗性基因。更进一步地，上述双元载体所述的真核启动子为modified CaMV 35S启动子，所述真核终止子为CaMV 35S终止子。modified CaMV 35S启动子可简写为m;35S，CaMV 35S终止子可简写为T3k。
更进一步地，上述双元载体所述ColEl在T-DNA内侧，且紧邻所述抗性基因真核启动子。发明人根据上述的结构，构建了各种双元载体和衍生载体。更进一步地，上述双元载体，其特征在于所述载体具有如图1结构。更进一步地，上述双元载体，其特征在于所述载体具有如SEQ ID. NO. 1所示的序列。上述双元载体，其特征在于所述载体具有如SEQ ID. NO. 1所示的序列，且编码氨基酸序列包括SEQ ID. NO. 15和SEQ ID. NO. 16所示的序列。上述双元载体的衍生载体，其特征在于所述衍生载体具有如图2结构。上述双元载体的衍生载体，其特征在于所述衍生载体具有如图3结构。将本发明提供的双元载体转入烟草、番茄和黄瓜中表达，实验证明得到了很好的效果。本发明有益效果如下
1.此双元载体仅带有一个抗性选择标记基因，该基因具有原核和植物双重表达特性， 既能使大肠杆菌、农杆菌获得抗性，又能使转基因植物获得抗性。2.此双元载体的T-DNA整合进植物基因组后具有亚克隆整合位点旁侧的植物染色体DNA的特性，便于获取外源基因整合位点的旁侧序列。3.此双元载体较小，可在T-DNA区插入更长或更多的外源基因。
图1 双元载体pVCT2098物理结构图谱； 图2双元载体pVCT2298物理结构图谱；
图3双元载体pVCT2299物理结构图谱； 图4双元载体pVCT2098的构建和鉴定； 图5双元载体pVCT2298的构建和鉴定； 图6双元载体pVCT2299的构建和鉴定； 图7双元载体pVCT2299的功能验证；
图8 pVCT2299经农杆菌介导转化烟草，获得的Kan抗性植株经PCR鉴定后，采用CTAB 法提取基因组DNA。用CloEl至LB之间没有的限制酶EcoR I, Sac I和BamH I分别单独酶切，酶切产物直接用jM DNA连接酶连接，转化大肠杆菌XLl-Blue感受态细胞，得Kan抗性重组子，PCR检测有m35S::npt II m: 基因的阳性克隆，表明该克隆必定是由源自 PVCT2299的LB端的亚克隆片段连接上了一段烟草染色体DNA。所得序列与与烟草M14对应序列的序列比对；
图9双元载体pVCT2299的T-DNA整合进烟草基因组后的亚克隆流程； 图10 pCAM-HEMA-CAO物理结构图谱。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。本发明实施例中的试剂药品未做具体说明的均为普通市售，材料方法未做具体说明的均参考《分子克隆实验指南》(Sambrook和Russell，2001)
实施例1
一、双元载体PVCT2098构建方法
采用 PCR 方法，用引物 5，-ccataccaacaaaaaagacagag-3，(位于 AtCBF3 上游)和 5，-g tactaaaaatggaaataataatctgag-3，(位于 AtCBF3 TSf )>PrimStar HS DNA 聚合酶(TaKaRa, 曰本)从 以南芥生态型 Columbia (.Arabidopsis thaliana L. Ecotype Columbia)基因组 DNA 中扩增出 755 bp 大小的基因 AtCBF3 (GenBank accession No. AB013815)，PCR 反应条件为95°C预变性2 min，95°C变性10 sec，51°C退火20 sec，72°C延伸1 min，30个循环；72 °C延伸10 min,；回收产物经用Taq DNA聚合酶加“A”尾后，TA克隆进T载体 pCR2. 1-T0P0 (Invitrogen, US)，转化大肠杆菌XLl-Blue感受态细胞，Amp和Kan抗性重组子经PCR扩增筛选，引物为5，-ccataccaacaaaaaagacagag-3，(位于AtCBF3上游)和 5‘-gtaacgccagggttttccca-3‘(位于 LacZ 下游)，PCR 反应条件为94°C预变性 3 min, 94°C 变性20 sec，52°C退火20 sec，72°C延伸1 min，；35个循环，最后72°C延伸10 min,电泳检测得到预期898 bp大小的产物，测序结果显示得到了预期的序列(见图4-1A)。因此，得阳性克隆pCR2. l-AtCBF3。构建结果见图4-1A、图4-1B。用EcoR I酶切载体pCR2. l_AtCBF3，电泳回收3890 bp片段，弃773 bp片段；将回收片段纯化后用jM DNA连接酶连接，转化大肠杆菌XLl-Blue感受态细胞，得Amp和Kan抗性重组子，经PCR扩增筛选，引物为5，-gtggatccttctagtgtagccgtag _3，(位于ColEl上游)和 5，-gtaacgccagggttttccca _3，(位于 LacZ 下游)，PCR 反应条件为94°C预变性 3 min，94°C变性 20 sec，52°C退火20 sec，72°C延伸 1 min，；35个循环，最后 72°C延伸 10 min, 电泳检测得到预期1048 bp大小的产物，再经EcoR I酶切，显示为单位点，表明得到阳性克隆pCR2. lm。构建过程及结果见图4-2A、图4-2B。采用PCR方法，用引物5’ -TCATGACCAAAATCCCT-3’(位于pCR2. Im载体的原核基因终止子上游)和引物5’ -TTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGG -3’(位于pCR2. Im载体的Kan抗性基因CDS的下游)、PrimStar HS DNA聚合酶(TaKaRa，日本)从pCR2. Im载体DNA中扩增出 2919 bp大小的Kan原核抗性基因(nptll，新霉素磷酸转移酶基因)、fl复制子、LacZ基因、 大肠杆菌复制子ColEl和原核抗性基因终止子等序列，并除去Amp编码区，PCR反应条件 95°C预变性 2 min，95°C变性 10 sec，50°C退火 20 sec，72°C延伸 3 min，30 个循环；72°C延伸10 min ；将回收片段纯化后用T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌XLl-Blue感受态细胞， 得到Kan抗性重组子，表明重组的nptll基因(命名为nptnm，即nptll modified)具有预期Kan抗性功能；经PCR扩增筛选，引物为5，-atactcgagctactgggctatctgg _3，(位于 nptll 原核启动子上游)和 5，-tttctcgagttggtagctcttgatcc _3，(位于 nptll 原核终止子下游)，PCR反应条件为94°C预变性3 min，94°C变性20 sec，52°C退火20 sec，72°C延伸 1 min 10 sec，3 个循环，94°C变性 20 sec，59°C退火 20 sec，72°C延伸 1 min 10 sec，32 个循环，最后72°C延伸10 min,电泳检测得到预期1240 bp大小的产物，证实nptll编码区与原核终止子之间的Amp基因编码区被清除，再经EcoRI酶切，显示为单位点，表明得到阳性克隆PVCT1191。该载体使pCR2. Im载体的Amp抗性基因得到删除，并使nptll基因末端带
5上原核基因终止子，构成nptnm基因，该基因能赋予大肠杆菌Kan抗性。构建过程及结果见图 4-3A、图 4-3B。采用PCR方法，用SEQ ID. NO. 3所示序列的引物(位于nptlLii基因的启动子上游) 与SEQ 10.而.4所示序列的引物从？￥01191载体0嫩中扩增出1265 bp大小的新霉素磷酸转移酶基因nptnm;PCR反应条件为95°C预变性2 min，95°C变性10 sec，52°C退火20 sec，72°C延伸 1 min 20 sec，3 个循环，再经 95°C变性 10 sec，60°C退火 20 sec，72°C延伸 1 min 20 sec，27个循环，最后72°C延伸10 min ；用纯化的PCR产物再次进行PCR扩增，用 SEQ ID. NO. 3所示序列的引物(位于nptnm基因的启动子上游)和SEQ ID. NO. 6所示序列的引物，反应条件为:95°C预变性2 min，95°C变性10 sec，46°C退火20 sec，72°C延伸1 min 20 sec，3 个循环，再经 95°C变性 10 sec，60°C退火 20 sec，72°C延伸 1 min 20 sec，27 个循环，最后72°C延伸10 min;电泳回收1283 bp片段，用Taq DNA聚合酶加“A”尾后，TA克隆进T载体pMD18-T中，转化大肠杆菌XLl-Blue感受态细胞，得Amp和Kan抗性重组子，表明所克隆的nptnm在大肠杆菌中具有Kan抗性功能；经PCR扩增筛选，SEQ ID. NO. 3所示序列的引物为5，-atactCgagCtactgggCtatCtgg -3，(位于nptll原核启动子上游，划线部分为Xho I位点)和5，-gtaacgccagggttttccca _3，(位于LacZ下游)，PCR反应条件为 94°C预变性 3 min，94°C变性 20 sec，52°C退火 20 sec，72°C延伸 1 min 10 sec，;35 个循环， 最后72°C延伸10 min，电泳检测得到预期1363 bp大小的产物，证实nptnm已得到克隆， 且表达方向与IacZ的一致。用Hind III和Xho I酶切，得到预期1302 bp和洸75 bp产物，用Ml I和Me I，得到预期1314 bp和沈64 bp产物，并证实了插入的方向；测序结果显示得到如SEQ ID. NO. 5所示引物序列和nptnm基因的序列，以及T载体上的多克隆位点，均与预期的序列完全一致。因此，得阳性克隆PVCT1202。构建过程及结果见图4-4A、图 4-4B、图 4-4C。用Xho I 酶切载体 pCAMBIA1302 (GenBank accession No. AF234298)，电泳回收 9455 bp片段，弃1094 bp片段；用Xho I和Ml I酶切载体pVCT1202，回收1284 bp片段 (带有nptll-LoxP)，弃沈93 bp片段；将回收片段纯化后用T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌XLl-Blue感受态细胞，Kan抗性重组子经PCR扩增筛选，引物为SEQ ID. NO. 5所示序列 (位于nptnm基因的原核启动子上游)和5，-CATGAGCGAAACCCTATAGGAACC -3，(位于T35s 真核终止子中)为引物，PCR反应条件为94°C预变性3 min，94°C变性20 Sec，52°C退火20 sec，72°C延伸1 min 20 sec，35个循环，最后72°C延伸10 min，电泳检测得到预期1362 bp 大小的产物，表明带有原核启动子和终止子的nptnm基因按预期方向插进pCAMBIA1302的 Xho I位点；Bio I酶切鉴定，显示为预期的单位点；因此，得阳性克隆pVCT2072。pVCT2072 经农杆菌介导转化烟草，得到了具有卡那霉素抗性的植株，结果显示h35S::nptIIm::T35s 基因表达正常，能赋予转基因烟草细胞卡那霉素抗性。构建过程及结果见图4-5A、图4-5B。用Bspl20 I和PamC I酶切载体pVCT2072，电泳回收6923 bp片段，弃413 bp 和3403 bp片段；采用PCR方法，用引物如SEQ ID. N0. 7所示序列(位于pVCT2072载体的 2x35S 启动子中)和引物 5’ -catgagcgaaaccctataggaacc-3，(位于 CaMV 35S 基因终止子pA或T!35s中)、PrimStar HS DNA聚合酶(TaKaRa，日本)从pVCT2072载体DNA中扩增出1514 bp大小的m35S: :nptllm基因(其中，m35S为自-107 bp处截短的微小CamV 35S启动子)，再用Bspl20 I酶切，回收1382 bp片段，弃132 bp片段；将回收片段纯化后用jM DNA连接酶连接，转化大肠杆菌XLl-Blue感受态细胞，得Kan抗性重组子， 经PCR扩增筛选，引物为5，-atcgcaagaccggcaacagg-3，(位于真核终止子iTnos中)和 5，-catgagcgaaaccctataggaacc -3，(位于 T35s 真核终止子中)，PCR 反应条件为94°C预变性 3 min，94°C变性 20 sec，50°C退火 20 sec，72°C延伸 1 min 40 sec，3 个循环，94°C变性 20 sec，58°C退火 20 sec，72°C延伸 1 min 40 sec，32 个循环，最后 72°C延伸 10 min，电泳检测得到预期1607 bp大小的产物，表明Tnos克隆进了 pVCT2072，而且直接与m35S启动子相连；EcoRI和AseI酶切出预期的1375 bp和6930 bp产物；测序结果显示得到预期序列。因此，得阳性克隆PVCT2073。构建过程及结果见图4-6A、图4-6B、图4-6C。采用PCR方法，用引物如SEQ ID. NO. 8所示序列(位于LB外侧)和引物如SEQ ID. NO. 9所示序列(位于RB外侧)、Prin^tar HS DNA聚合酶(TaKaRa，日本)从pVCT2073载体DNA中扩增出T-DNA区，PCR反应条件95°C预变性2 min，95°C变性10 sec，58°C退火20 sec，72°C延伸2 min 30 sec，30个循环；72°C延伸10 min，电泳回收2347 bp片段；用引物 5，-GTAACGCCAGGGTTTTCCCA -3，(位于 LacZ 下游)和引物 5，-TCTCATGACCAAAATCCCT-3， (位于ColEl上游)从pUC18载体(Sangon，上海)DNA中扩增大肠杆菌复制子ColEl等序列，PCR反应条件95°C预变性2 min，95°C变性10 sec，50°C退火20 sec，72°C延伸1 min 20 sec，30个循环；72°C延伸10 min，电泳回收1186 bp条带，再用Ase I酶切，Klenow 酶补平后，回收897 bp片段，弃59 bp和232 bp片段；将回收片段纯化后用T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌XLl-Blue感受态细胞，Kan抗性重组子经PCR扩增筛选，引物为 5，-cgggaattaaactatcagtg-3，(位于 RB 内侧)和弓丨物 5，-TCTCATGACCAAAATCCCT-3，(位于ColEl上游)，PCR反应条件为94°C预变性3 min，94°C变性20 sec，50°C退火20 sec, 72°C延伸1 min 20 sec，35个循环，最后72°C延伸10 min，电泳检测得到预期1362 bp大小的产物，引物为5，-catactcgagctactgggctatctgg-3，(位于nptnm基因的原核启动子上游)和引物5，-ttccgcttcctcgctcactga-3，(位于ColEl下游)，PCR反应条件为-MV 预变性 3 min，94°C变性 20 sec，58°C退火 20 sec，72°C延伸 2 min 20 sec，；35 个循环，最后 72°C延伸10 min,电泳检测得到预期沈01 bp大小的产物，表明源自pVCT2073的T-DNA区与ColEl按预期得到重组；EcoR I、BamHI和Mu I酶切显示均为预期的单位点，且出出现了 pVCT2073中没有的BamHI和Mu I位点；测序结果显示RB的上游序列与ColEl相连，且连接处为对应引物序列5’ -CGGGATCCTGGTTACCCTGTGGTTGGCATGCAC-3’和Ase I平端的精确重组。因此，得阳性克隆PVCT2076。构建过程及结果见图4-7A、图4-7B、图4-7C。用EcoR I和BamH I酶切载体pVCT2076，Klenow酶补平后，电泳回收沘03 bp片段，弃441 bp片段；将回收片段纯化后用T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌XLl-Blue感受态细胞，Kan抗性重组子经PCR扩增筛，引物为5’-gcaaacaaaccaccgctgg_3’(位于nptlLn 基因原核终止子下游)和5’ -ccaatacgcaaaccgcctct-3，(位于ColEl下游)，PCR反应条件为94°C预变性 3 min，94°C变性 20 sec，50°C退火 20 sec，72°C延伸 1 min 30 sec, 35 循环，最后72°C延伸10 min，电泳检测得到预期1403 bp大小的产物，表明ColEl与nptnm 直接连到了一起；用Mu I和AseI酶切鉴定，显示有沈5 bp和2542 bp目的带。得阳性克隆pVCT2077。构建过程及结果见图4-8A、图4-8B。采用PCR方法，用引物如SEQ ID. NO. 10所示序列(位于Tnos上游)和引物如SEQ ID. NO. 11所示序列(位于RB外侧)、PrimStar HS DNA聚合酶(TaKaRa，日本)从PCAMBIA1302载体DNA中扩增出430 bp大小的Tons和右边界RB及其外侧序列，PCR 反应条件95°C 预变性 2 min，95°C 变性 10 sec，50°C 退火 20 sec，72°C 延伸 40 min, 3个循环；95 °C变性10 sec，65 °C退火20 sec，72 °C延伸40 min，27个循环；72 °C延伸 10 min，电泳回收，再用BstE II酶切后，回收415 bp片段，弃15 bp片段；用Mu I 和BstE II酶切载体pVCT2077，电泳回收观02 bp片段，弃5 bp片段；将回收片段纯化后用T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌XLl-Blue感受态细胞，Kan抗性重组子经PCR 扩增筛选，引物为5’ -atcgcaagaccggcaacagg-3’(位于真核终止子Tnos中)和引物 5，-ttccgcttcctcgctcactga-3，(位于 ColEl 下游)，PCR 反应条件为94°C预变性 3 min, 94°C变性 20 sec，58°C退火 20 sec，72°C延伸 1 min，；35 个循环，最后 72°C延伸 10 min，电泳检测得到预期941 bp大小的产物，表明Tnos与ColEl相连；酶切结果显示，BstEII和 ^icI切出396bp预期条带，而EcoR I和Xba I为预期单位点。因此，得阳性克
隆pVCT2078。构建过程及结果见图4-9A、图4-9B。用BstE II酶切载体pVCT2078，Klenow酶补平后，再用EcoR I切割，电泳回收 2809 bp 片段，弃 413 bp 片段；用 Ehe I 和 EcoR I 酶切载体 pCAMBIA1302，回收 5769 bp 片段，弃4780 bp片段；将回收片段纯化后用T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌XLl-Blue 感受态细胞，Kan抗性重组子经PCR扩增筛选，引物为5’ -gtaacgccagggttttccca-3’ (位于 LacZ 下游)和引物 5，-ttccgcttcctcgctcactga-3，(位于 ColEl 下游)，PCR 反应条件94°C 预变性 3 min，94°C 变性 20 sec，52°C 退火 20 sec，72°C 延伸 1 min， 30个循环；72 V延伸10 min,得到972 bp的目的条带，表明CloEl与LacZ下游片段相连；引物为5’ -atgacgcacaatcccactatcc-3’(位于!35S启动子中)和引物5’ -Atcgcaagaccggcaacagg-3，(位于Tnos终止子中)进行PCR扩增检测，PCR反应条件为 94 °C 预变性 3 min，94°C 变性 20 sec，55 °C 退火 20 86(；，721延伸1 min，;35 个循环，最后72°C延伸10 min,电泳检测得到预期933 bp大小的产物，表明含有35S: :mGFP: :Tnos 基因；引物为5，-catgagcgaaaccctataggaacc -3，(位于T35s终止子中)和引物5，-ccaatacgcaaaccgcctct-3，(位于ColEl的下游)进行PCR扩增检测，PCR反应条件为 94°C预变性 3 min，94°C变性 20 sec，55°C退火 20 sec，72°C延伸 1 min 30 sec，;35 个循环，最后72°C延伸10 min,电泳检测得到预期1562 bp大小的产物；用位于上的引物 5，-catgagcgaaaccctataggaacc-3，测序结果显示,得到了预期的 T!^s、LoxP 和 nptnm 顺序相连的结构，并证实了》ιο I与Ml I酶切补平后的重组位点；用位于CloEl下游的引物 5’ -ccaatacgcaaaccgcctct-3’测序结果显示，得到了预期的-107 bp的m35S启动子完整序列、啦连于其下游的nptnm原核启动子和毗连于其上游的CloEl部分序列，而且证实了 EcoR I和BamH I酶切补平后的重组位点及Ase I的酶切补平后的重组位点。因此，得阳性克隆PVCT2098。构建过程及结果见图4-10A、图4-10B、图4-10C、图4-10D、图4-10E。实施例2由PVCT2098构建的衍生载体
用 EcoR I 和 Hind III 酶切载体 pUC18(Sangon,上海；GenBank accession L08752), 电泳回收2635 bp, 弃51 bp片段；用相同的酶消化载体pBI121 (GenBank accession AF485783)，回收3032 bp,弃11726 bp片段；将两个回收片段用T4 DNA连接酶连接， 转化大肠杆菌XLl-Blue感受态细胞，得Amp抗性重组子，用CaMV 35S启动子上的引物 5，-ATGACGCACAATCCCACTATCC-3，和位于 Tnos 终止子上的引物 5，-ATCGCAAGACCGGCAACAGG-3，进行PCR扩增，得2056 bp预期大小产物，表明35S:⑶S: Tnos基因已重组进pUC18 载体中，再经EcoR I和HindIII酶切鉴定，得阳性克隆pVCT2006。用Ecll36 II (Sac I的同位异裂酶)和)(ba I酶切载体pVCT2006，电泳回收3773bp，弃1894 bp片段；人工合成138 bp的DNA片段，其序列如SEQ ID. NO. 12 所示，经)(ba I酶切，回收131 bp,构成)(ba I接头；将两个片段用T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，得Amp抗性重组子，用CaMV 35S启动子上的引物 5，-ATGACGCACAATCCCACTATCC-3，和位于 Tnos 终止子上的引物 5，-ATCGCAAGACCGGCAACAGG -3，进行PCR扩增，得四3 bp预期大小产物，再经Nhe I和Not I酶切鉴定，得阳性克隆 PVCT2079。用位于35S启动子上游的引物序列如SEQ ID. NO. 13和位于Tnos下游的引物序列如 SEQ ID. NO. 14 所示、PrimStar HS DNA 聚合酶(TaKaRa，日本)从 pVCT2079 中扩增 1269 bp的!35S::Tnos结构，用EcoR I和Ml I酶切，电泳回收1257 bp的片段，弃4 bp和8 bp 片段；用EcoR I和Ml I酶切载体pVCT2079，电泳回收8545 bp,弃33 bp片段；将两个片段用T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌XLl-Blue感受态细胞，得Kan抗性重组子，用位于CaMV 35S启动子上的引物5，-Atgacgcacaatcccactatcc-3，和位于ColEl下游的引物 5，-ttccgcttcctcgctcactga-3，进行 PCR 扩增，得 1356 bp 预期大小产物，再经 EcoR I 和 Sal I酶切鉴定，显示有1257 bp和8545 bp的目的带。因此，得阳性克隆pVCT2099。用引物 5，-gtcctaatttgtgatgagcttccggtgg-3，(位于 AtHEMAl 基因启动子上游)禾口 5，-ggagacgtgacagcaaaatgatgcacatgg _3， ( AtHEMAl) > PrimStar HS DNA聚合酶(TaKaRa，日本)从拟南芥生态型ColumbiaUra力iiZo^sis thaliana L. Ecotype Columbia)基因组DNA中扩增带有启动子和终止子的AtHEMAl全长基因，PCR反应条件为95°C预变性 2 min，95°C变性 10 sec，63°C退火 20 sec，72°C延伸 4 min 40 sec, 30个循环；72°C延伸10 min,电泳回收4510 bp的片段，用Taq DNA聚合酶加“A”尾后，TA 克隆进T载体pUC19-T (TaKaRa,日本)，转化大肠杆菌XLl-Blue感受态细胞，得Amp抗性重组子，用与克隆该基因相同的方法筛选阳性克隆，经测序证实克隆到预期的目的基因。因此，得阳性克隆PVCT1298。用引物5，-agctcatgagatagggcagacgtag-3，(位于 AtCAOl 基因启动子上游)和 5，-ggttcttagaagacattagtttagtgggg-3，(位于 AtCAOl 基因终止子下游)、PrimStar HS DNA 聚合酶(TaKaRa，日本)从拟南芥生态型 Columbia Ura力ii/oAsis thaliana L. Ecotype Columbia)基因组DNA中扩增带有启动子和终止子的AtCAOl全长基因，PCR反应条件为 95°C预变性 2 min，95°C变性 10 sec，60°C退火 20 sec，72°C延伸 4 min 10 sec，30 个循环； 72°C延伸10 min，电泳回收4006 bp的片段，用Taq DNA聚合酶加“A”尾后，TA克隆进T载体pUC19-T (TaKaRa,日本)，转化大肠杆菌XLl-Blue感受态细胞，Amp抗性重组子经PCR 扩增筛选，引物为5，-gtagccatggcgtcaccggaaagagagtg-3，(位于AtCAOl基因启动子的下游)和引物5，-gtaacgccagggttttccca_3，(位于LacZ下游)，PCR反应条件为94°C预变性 3 min，94°C变性 20 sec，52°C退火 20 sec，72°C延伸 1 min 20 sec，35 个循环，最后 72°C 延伸10 min，电泳检测得到预期1303 bp大小的产物；经测序证实克隆到预期的目的基因。 因此，得阳性克隆PVCT1263。用引物5，- tggcagggaaactcacgaaggaaga-3，(位于 AtHOSlO 基因启动子上游)禾口 5’ 一 tcacccgtaatataccgtcccttg-3’ (位于 AtHOSlO 基因终止子下S, )、PrimStar HS DNA 聚合酶(TaKaRa，日本)从拟南芥生态型 Co 1 umb ia Urabidopsis thaliana L. Ecotype Columbia)基因组DNA中扩增带有启动子和终止子的AtHOSlO全长基因，PCR反应条件为95°C预变性2 min，95°C变性10 sec，59°C退火20 sec，72°C延伸4 min，30个循环；72°C延伸10 min，电泳回收3453 bp的片段，克隆进平端载体pUCm-B (Sangon, Canada),转化大肠杆菌XLl-Blue感受态细胞，Amp抗性重组子经PCR扩增筛选，引物为 5，-catgggaagatcaccatgttgtga-3，(位于 AtCAOl 基因 CDS 的上游)和引物 5，-atacgactcactatagggc-3，(为载体上的T7引物)，PCR反应条件为94°C预变性3 min, 94°C 变性 20 sec，52°C退火 20 sec，72°C延伸 2 min 30 sec，；35 个循环，最后 72°C延伸 10 min, 电泳检测得到预期3076 bp大小的产物；经测序证实克隆到预期的目的基因。因此，得阳性克隆 PVCT1341。用BstEII酶切载体pVCT2099，Klenow fragment酶补平末端后再用Ml I切，电泳回收回收8261bp,弃1546bp ；用EcoR I酶切载体pVCTU98，Klenow fragment酶补平末端后再用Ml I切，电泳回收4555 bp,弃沈53 bp ；将两个片段用T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌XLl-Blue感受态细胞，得Kan抗性重组子，用引物5’_ccgagaaatgttggatcttgt gttggtg-3，位于 AtHEMAl 基因编码区上游)禾口弓丨物 5‘-ggagacgtgacagcaaaatgatgcacatgg -3，(位于AtHEMAl基因终止子下游)进行PCR扩增，PCR反应条件为94°C预变性3 min, 94°C变性20 sec，6rC退火20 sec，72°C延伸1 min，；35个循环，最后72°C延伸10 min，得 1002 bp预期大小产物；酶切结果显示，Sal I为单位点，BamH I切出观92 bp和10251 bp 大小的带，Sal I和EcoR I切出1257bp和11886 bp大小的带，均为预期目的条带。因此， 得阳性克隆PVCT2298。pVCT2298鉴定结果见图5-1、图5-2、图5-3、图5-4。用SalI 和 EcoRI 酶切载体 pVCT2^8，电泳回收 11559bp,弃 1257bp 片段；用同样的酶消化载体PVCT1263，回收4049 bp,弃沈53 bp ；将两个片段用 T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌XLl-Blue感受态细胞，得Kan抗性重组子，用引物 5，- gcacctatacttccttctttacagcctcc _3，(位于 AtHEMAl 基因中)禾口弓 | 物 5，-ccgagaaatgttggatcttgtgttggtg -3，(位于 AtCAOl 基因中)进行 PCR 扩增，PCR 反应条件为94°C预变性3 min，94°C变性20 sec，61°C退火20 sec，72°C延伸2 min，；35个循环，最后 72°C延伸 10 min，得 2195 bp 预期大小产物；用引物 5，-ttccgcttcctcgctcactga-3，(位于 ColEl 下游)和引物 5’ - gtagccatggcgtcaccggaaagagagtg-3’ (位于 AtCAOl 基因启动子的下游)进行PCR扩增，PCR反应条件为94°C预变性3 min, 94°C变性20 sec, 58°C退火 20 sec，72°C延伸2 min，35个循环，最后72°C延伸10 min，得2123 bp预期大小产物；酶切结果显示，SmaI 切出 3296 bp,5272 bp 和 7367bp 大小的带，SacI 切出 1586 bp,2184 bp、 4787 bp和7347 bp，均为预期目的带。因此，得阳性克隆pVCT2299。构建过程及结果见图 6-1、图 6-2。实施例3验证有益效果
有益效果效果1此双元载体带有一个m35S: :npt II m: :T35s基因， m35S: :npt II m: :T35s基因具有原核和植物双重表达特性，既能使大肠杆菌、农杆菌获得卡拉霉素抗性，又能使转基因植物获得卡拉霉素抗性。实验数据载体 pVCT2076、pVCT2077、pVCT2078、pVCT2098，以及 pVCT2098 的衍生载体 pVCT2099、 PVCT2298和pVCT2299等，能在大肠杆菌中得到克隆，表明m35S: :npt II m: :T35s基因能赋予大肠杆菌Kan抗性，而且PCR扩增和测序证实为m35S: :npt II m: :T35s基因(结果参载体构建部分)。而PVCT2298和pVCT2299导入根癌农杆菌中能赋予农杆菌Kan抗性，证实 m35S: :npt II m: :T35s 基因具有原核抗性。另外，pVCT2072、pVCT2298 和 pVCT2299 经农杆菌介导转化烟草，均得到Kan抗性植株，表明该基因能赋予植物Kan抗性。以pVCT2299为例，将pVCT2299的质粒DNA经冻融法转化根癌农杆菌EHA105感受态细胞，转化后将菌液移到含Kan (50mg/L)、Rif (100mg/L)*Mr (100mg/L)的YEB抗性平板上筛选，得到了抗性克隆。用引物5，- gcacctatacttccttctttacagcctcc -3，(位于 AtHEMAl 基因中)禾口弓I 物 5，_ ccgagaaatgttggatcttgtgttggtg _3，(位于 AtCAOl 基因中)进行PCR扩增检测，PCR反应条件为94°C预变性3 min，94°C变性20 sec,61 °C 退火20 sec，72°C延伸2 min，35个循环，最后72°C延伸10 min，得2195 bp预期大小产物(图示结果同PVCT2299载体构建)，表明得到了阳性克隆农杆菌/pVCT2^9。用农杆菌 ^^(^2299和常规的叶盘法转化于附加2.5 mg/L BA的MS固体培养基上预培养2天得烟草叶片外植体，共培养2天后，在附加300 mg/L羧苄青霉素和2. 5 mg/L BA的MS固体培养基上抑菌培养7天，转入附加150 mg/L卡那霉素(Kan)、300 mg/L羧苄青霉素和 2.5 mg/L BA的MS固体培养基进行分化和筛选培养，得到的Kan抗性烟草植株经PCR扩增鉴定，引物采用5，-catgagcgaaaccctataggaacc _3，(位于T35s终止子中)和引物5，-ccaatacgcaaaccgcctct-3，(位于ColEl的下游)进行PCR扩增检测，PCR反应条件为94°C 预变性 3 min，94°C变性 20 sec，55°C退火 20 sec，72°C延伸 1 min 30 sec，;35 个循环，最后72°C延伸10 min,得1562 bp预期大小产物，表明12个单株中有#2、#3、#4、#5、#6、#12 单株为nptΠι 基因的PCR阳性植株；该阳性植株再用引物5 ’ -gcacctatacttccttctttacag cctcc -3，(位于 AtHEMAl 基因中)禾口弓丨物 5，- ccgagaaatgttggatcttgtgttggtg _3，(位于AtCAOl基因中)进行PCR扩增检测，PCR反应条件为94°C预变性3 min，94°C变性20 sec，61°C退火 20 sec，72°C延伸 2 min，；35 个循环，最后 72°C延伸 10 min，得 2195 bp 预期大小产物，证实目的基因整合进了烟草基因组，也证实m35S::npt II m: 基因具有真核表达特性，能赋予植物Kan抗性。结果见图7。有益效果2此双元载体的T-DNA整合进植物基因组后具有亚克隆整合位点旁侧的植物染色体DNA的特性，便于获取外源基因整合位点的旁侧序列。实验数据
PVCT2299经农杆菌介导转化烟草，获得的Kan抗性植株经PCR鉴定后，采用CTAB法提取基因组DNA0用CloEl至LB之间没有的限制酶EcoR I.Sac I和BamH I分别单独酶切， 酶切产物直接用jM DNA连接酶连接，转化大肠杆菌XLl-Blue感受态细胞，得Kan抗性重组子，PCR检测有m35S: :npt II m: :T35s基因的阳性克隆，表明该克隆必定是由源自pVCT2299 的LB端的亚克隆片段连接上了一段烟草染色体DNA ；测序得到的序列见SEQ ID. NO. 2。网上序列比对结果显示，该序列与烟草M14对应序列有91%的相似性。对比结果如图8。该结果表明载体PVCT2299的T-DNA整合进烟草基因组后的亚克隆后，能携带一段整合位点的染色体DNA序列。如果再采用染色体PCR步移的方法，则可以得到转基因整合位点两端的旁侧序列。载体pVCT2299的T-DNA整合进烟草基因组后的亚克隆流程如图9。有益效果3此双元载体较小，可在T-DNA区插入更长或更多的外源基因。实验数据
所述载体PVCT2098由pCAMBIA1302改造而来，前者大小为8578 bp，后者为1(^49 bp。 如果以ColEl复制子的承载能力为20 kb,则pVCT2098能装载11422 bp的外源基因序列， 比 pCAMBIA1302 多装载 1971 bp 的 DNA。所述载体pVCT2299中含有AtHEMAl和AtCAOl两个基因，约有15600 bp。如果这两个基因采用与PVCT2299构建完全相同的方法和流程整合进pCAMBIA1302后，将得到17579 bp 的假定载体 pCAM-HEMA-CAO。可见 15608 bp 大小的 pVCT2299 具有比 pCAM-HEMA-CAO 更多的插入外源DNA的空间。如图10所见。潮霉素原核抗性基因与新霉素磷酸转移酶原核表达基因具有相似的结构和功能， 因此也适用上述构建方式并能达到相同的有益效果。
权利要求
1.一种双元载体，带有T-DNA结构，T-DNA结构中带有抗性基因和抗性基因的启动元件和终止元件；其特征是所述T-DNA结构中带有一个复制子ColEl，所述抗性基因为原核抗性基因，且所述启动元件和终止元件分别为真核启动子和终止子；所述原核抗性基因位于真核启动子和终止子之间、紧邻T-DNA的LB端；T-DNA外侧没有原核抗性基因和ColEl复制子。
2.如权利要求1所述双元载体，其特征在于所述原核抗性基因为新霉素磷酸转移酶原核表达基因(npt II m基因)或者潮霉素原核抗性基因。
3.如权利要求1或2所述双元载体，其特征在于所述真核启动子为modifiedCaMV 35S 启动子，所述真核终止子为CaMV 35S终止子。
4.如权利要求1、2或3所述双元载体，其特征是所述复制子ColEl在T-DNA内侧，且紧邻所述抗性基因真核启动子。
5.如权利要求1所述双元载体，其特征在于所述载体具有如图1的结构。
6.如权利要求1所述双元载体，其特征在于所述载体具有如SEQID. 1所示的序列。
7.如权利要求5所述双元载体，其特征在于所述载体具有如SEQID. NO. 1所示的序列， 且编码氨基酸序列包括SEQ ID. NO. 15和SEQ ID. NO. 16所示的序列。
8.如权利要求1或2所述双元载体，其特征在于所述载体具有如图2的结构。
9.如权利要求1或2所述双元载体，其特征在于所述载体具有如图3的结构。
10.如权利要求1 9任一项所述的植物双元表达载体在转基因烟草中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种双元载体，其T-DNA内侧带有原核抗性基因，且上下游分别为真核启动子和终止子；抗性基因紧邻LB；带有一个复制子ColE1；T-DNA外侧没有原核抗性基因和ColE1复制子。此载体的抗性基因具有原核和植物双重表达特性，既能使多种细菌获得抗性，又能使转基因植物获得抗性。且本载体的T-DNA整合进植物基因组后具有亚克隆整合位点旁侧的植物染色体DNA的特性，便于获取外源基因整合位点的旁侧序列。另外，本载体较小，可在T-DNA区插入更长或更多的外源基因。
文档编号A01H5/00GK102492720SQ201110406339
公开日2012年6月13日 申请日期2011年12月8日 优先权日2011年12月8日
发明者万发香, 张兴国, 李翠萍, 杜小兵, 苏承刚, 陈吉裕 申请人:西南大学