专利名称：一种簕杜鹃的化学诱变育种方法
技术领域：
本发明涉及园艺木、藤本植物育种领域，特别是簕杜鹃的化学诱变育种领域。
技术背景
簕杜鹃(Bougainvillea spp.)为紫茉莉科(Nyetaginaceae)宝巾属植物，又名宝巾、三角梅、九重葛、叶子花等，原产于热带美洲，19世纪传入欧洲，后经美国和日本传入东南亚各国。20世纪50年代开始在我国南方大量引进种植，簕杜鹃以其苞片色彩的变化多端而富于观赏性，在中国南方的诸多大城市已经成为绿化的主要品种之一，是重要的园林观赏植物。
诱变育种技术在观赏植物品种改良上有独特的作用，是对育种手段不足的一种有益补充，它可以诱发基因突变，产生自然界原来没有的或一般常规方法无法获得的新类型、 新性状、新基因，能够打破基因连锁，提高重组率，在DNA水平上，诱变育种往往会导致比同源和异源转基因更大的转变。
诱变育种技术主要可分为辐照诱变和化学诱变两种形式。辐照诱变主要是选择利用各种射线(如Co6tl-Y射线)在一定剂量水平上对生物活体材料进行照射，造成生物细胞内染色体水平的畸变，如倒位、缺失等形成突变。其特点是对染色体伤害较大，因此致死突变较多，这是早期诱变技术的主流形式。化学诱变则通过一定浓度范围的化学诱变剂(如甲基磺酸乙酯、叠氮化钠等)对活体材料进行涂抹、注射、浸泡等处理方式造成生物细胞内 DNA的损伤和错误修复等，产生突变体。具备易操作，剂量率易控制，对基因组损伤小，突变率高等特点，是现今广为流行的一种育种方式。
国内绝大部分簕杜鹃品种都不能收获种子，因而都是利用插条进行扦插繁殖(无性繁殖)，不能像有性世代那样进行杂交而创造出新品种，这给簕杜鹃的育种工作带来一定难度。物理诱变的方法存在处理成本高、长途运输影响扦插条成活率等不足之处。
酶是具有生物催化作用的一类活性物质，同一属、种不同品种间存在着不同形式的同工酶。同工酶作为基因表达的直接产物，可以直接反映出品种之间的基因差异，通过同工酶电泳技术显示同工酶的不同谱带，可用于物种之间、同一物种不同种群之间的遗传差异鉴定、遗传多样性研究及物种起源进化等领域(王中仁，植物等位酶分析[M].北京科学出版社，1996)，现已广泛应用于观赏植物的品种鉴定研究。过氧化物酶(POD)是一种能利用双氧水氧化供氢体的同工酶，对双氧水的需求非常专一，在高等植物中广泛而大量存在着，具有明显的种属、组织和发育阶段特异性，在一定程度上反映植物的系统发生。由于过氧化物酶同工酶是基因表达的产物，因此对其酶谱的分析能够很好地判断基因的存在及其表达规律，能够从分子水平上揭示物种的遗传基础。发明内容
为了解决簕杜鹃常规育种工作中存在的育种途径少、育种效率低等问题，本发明提供一种简单而高效的化学诱变育种方法。本发明具有处理成本低廉、方法简便容易操作及突变频率高等明显优势。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是
一种簕杜鹃的化学诱变育种法，其特征在于，包括如下步骤
取材选择深红色花系的母本，冬季取材；所述取材选取一年生向阳的簕杜鹃枝条，剪成10 12cm左右的扦插条，每个扦插条留2 4个芽。所述扦插条的生物学顶端用固体蜡封闭，下端削成楔形待用。
材料诱变处理将准备好的材料全部浸入诱变剂处理液中，密封放置在黑暗处，浸泡一定时间，保持一定的温度；所述诱变剂为妝队。所述妝队为1-lOmmol/L。所述材料诱变处理中，浸入诱变剂处理液中的材料，浸泡时间为Mh，处理温度为25°C。
诱变材料的扦插浸泡后的材料用流水冲洗，随即扦插在温室的育苗床中，控制温湿度，保持一定的日光照射；所述诱变材料的扦插中浸泡后的材料用流水冲洗45min，扦插后的温度控制在25-30°C，空气湿度保持在60%以上，2000LUX的日光照射。
突变株的选择种植50 60天后，通过与对照进行对比，选择存活的叶色突变性状，进行连续扦插繁殖，直至叶色突变性状保持稳定；
确定新品系确定叶色突变性状遗传稳定的突变株为新品系。所述确定叶色突变性状遗传稳定的突变株为新品系的具体方法为对表型较为稳定的变异株进行同工酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，比较对照和变异株同工酶的酶谱，排除潜在的嵌合体，确定变异株表型性状遗传的稳定性，筛选出新品系。
利用化学诱变剂叠氮化钠(NaN3)对簕杜鹃的扦插条进行浸泡处理，通过化学诱变产生变异株，然后利用连续扦插分离目的性状的方式，创造出有利于目的性状生长的时间和空间，即通过连续的世代选择而获得遗传稳定的品系，达到化学诱变育种改良簕杜鹃品种的目的。
对选定的簕杜鹃母本扦插条进行确定浓度的化学诱变剂处理，通过连续扦插和世代选择分离叶色突变性状植株，最终选育出符合观赏特性的育种中间材料。
其具体步骤如下
(1)取材选择一年生向阳的簕杜鹃母本枝条，剪成10 12cm左右的扦插条，每个扦插条留2 4个营养芽。扦插条的生物学顶端用固体蜡封闭，下端削成楔形待用。
(2)缓冲液和诱变液的配制12g KH2PO4溶于IL蒸馏水中，然后用H3PO4调节pH 值至3. 0即为缓冲液；取不同体积数的lmol/L的NaN3原液溶于上述缓冲液，配制成1 IOmmol/L各浓度水平的诱变液。
(3)材料的诱变处理和扦插将上述材料全部浸入各浓度水平的诱变液中，密封黑暗中处理Mh，处理温度25°C ；将经过诱变处理的材料置于流水中冲洗30 45min，立即进行扦插，扦插基质为泥炭土珍珠岩=1 1，控制温度在25 30°C，空气湿度保持在 60%以上，保持2000LUX的日光照射。
(4)表型突变株选择与连续扦插繁殖在扦插后50 60日，比较对照(未被诱变处理)和诱变株在叶色性状上的不同，选定突变的叶色性状。选择好目的性状后，即可开始连续扦插繁殖，其作用在于分离叶色突变性状。连续扦插繁殖的具体实施方式
为选择突变株初生枝的基部(VM1R)作为扦插条进行继代繁殖(VM2R),栽培措施同上；选择VM2代的初生枝(仍旧保留目的性状)基部作为扦插条进行继代繁殖(VM3R),如此继代繁殖，直至叶色突变性状保持稳定。
实际育种工作中，兼顾成活数和突变率的变化，同时根据自己的育种目标，可以确定适宜比例的诱变剂浓度。选定目的性状后，即可进行分离性状的连续扦插繁殖。
对簕杜鹃不同母本的繁殖材料进行化学诱变处理(按照本文提供的方法)都可以实现叶色遗传变异(通过大量、反复的试验得以证明)，在实际操作中，可根据不同母本的繁殖材料调整处理剂量以达到取得目标优良变异单株的满意效果。
(5) VM3代后变异株的蛋白质指纹图谱检测对表型较为稳定的变异株进行同工酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，比较对照和变异株同工酶(如过氧化物酶)的酶谱情况，排除潜在的嵌合体，确定变异株叶色突变性状遗传的稳定性，筛选出新品系。
本发明化学诱变利用高效的化学诱变剂进行处理，可以获得较多的叶色突变，并且处理成本低，可以就地处理和栽培，简单易行容易操作。
采用本方案能收到如下显著效果
1、一次性可以就地处理大批母本材料，相对大大增加了变异株的基数。处理成本十分低廉，且能够有效的缩短育种周期。
2、通过连续扦插的无性繁殖方式，保证突变体的生长具有竞争性，有利于克服嵌合体的产生，获得稳定均一的变异植株。
3、采用NaN3对簕杜鹃母本扦插条进行诱变，能够获得较高频率的叶色突变(半致死剂量的突变频率达到70. 37% )，且变异谱较广，有利于提高簕杜鹃品种的观赏性。
图1是分离目的性状的连续扦插繁殖法示意图。
图2是叶色变异材料(VM3)代的蛋白质指纹图谱。CK为对照，BN1-9为变异株。
图3A是对照，图;3B和图3C是遗传稳定的突变株BN6和BN7植株叶片情况。
具体实施方式
本发明采用如下具体实施方式
，以下实施例旨在说明本发明，而不是对本发明做限制。如无特别说明，均为常规方法(参考徐冠仁主编的《植物诱变育种学》，1996，第一版， 中国农业出版社和周延清等主编的《生物遗传标记与应用》，2008，第一版，化学工业出版社)。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
(1)取材在深圳市中科院仙湖植物园科普实验园的试验苗圃中取一年生向阳的普通单瓣紫花簕杜鹃(Bougainvillea glabra choisy cv.)枝条，剪成10 12cm左右的扦插条，每个扦插条留2 4个营养芽。扦插条的生物学顶端用固体蜡封闭，下端削成楔形待用。
(2)缓冲液的配制取12g KH2PO4溶于IL蒸馏水中，用H3PO4调节pH值至3. 0。
(3) NaN3处理液的配制取1 IOml NaN3原液(lmol/L)溶于IL上述缓冲液中， 分别配成1. 25,2. 5,5. 0,10. Ommol/L共四个浓度水平的NaN3处理液。
(4)材料诱变处理将准备好的材料全部浸入上述不同水平浓度的NaN3处理液中，密封放置在黑暗处，浸泡Mh。
(5)诱变材料的扦插浸泡后的材料用流水冲洗45min，随即扦插在温室的育苗床中，温度控制在25°C (25°C 30°C均可)，湿度保持在60%以上，保持2000Lux的日光照射。
(6)突变株的表型选择和连续扦插繁殖55天(50 60天均可)后，选择叶色发生变异(本试验例中所选目的性状)的扦插条进行移栽种植，重点观察叶色有变异的植株。具体成活株数和突变率见表一(以叶色变异为例)，存活率(％ )=存活数/母本扦插数X 100 %，突变频率(％ )=表型变异数/扦插条成活数X 100 %。表一为NaN3各浓度水平植株成活率及叶色变异数统计，可知，随着诱变液浓度(剂量)的提高，成活数降低，但表型变异率却提高了，因此在实际育种工作中，兼顾成活数和变异率的变化，同时根据自己的育种目标，可以确定适宜比例的诱变剂浓度。从表一看出，本发明优选诱变剂浓度为5. Ommol/ L。选定叶色变异性状后，即可进行分离性状的连续扦插繁殖。连续扦插繁殖的方式选择突变株初生枝的基部(VM1R)作为扦插条进行继代繁殖(VM2R)；选择M2代的初生枝(仍旧保留目的性状)基部作为扦插条进行继代繁殖(VM3代)，如此继代繁殖，直至目的性状保持稳定。具体操作流程见图1。
(7)VM3代后变异株的蛋白质指纹图谱检测对表型较为稳定的变异株进行同工酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。具体步骤采用BIO-RAD公司的ftOteau II xi cell垂直板电泳仪，过氧化物酶和酯酶的凝胶板制备参照周延清等的方法。点样(样品的制作方法: 取对照和供试变异株的幼嫩叶片各0. lg，加0. 05mol/L的Tris-Hcl (pH8. 8)缓冲液冰浴研磨，经6000r/min离心15min，取上清液，加入同体积的40%蔗糖，_20°C保存备用。)完毕后接通电源，初始电压100V，0.证后加至200V。当溴酚蓝指示剂移至距分离胶底部Icm时， 关闭电源停止电泳。过氧化物酶染色参照周延清等的方法，采用醋酸-联苯胺染色法(周延清等，生物遗传标记与应用[M].北京化学工业出版社，2008)。
从VM3代中选择叶色变异较为稳定的9株变异株进行分析，比较对照和变异株过氧化物酶同工酶特征带出现的情况，并进行统计，确定变异株目的性状遗传是否稳定，排除嵌合体的可能。试验结果见图2，图2表明，本试验例所选9株变异株，7株(Bm-BN5，和 BN8-BN9)均为嵌合体，2株(BN6和BN7)为实际发生变异的植株。图中鱼尾箭头即BN6所示为缺失特征带，另一箭头即BN7所示为新增特征带，说明BN6和BN7均发生了变异，是新品系，可进一步培育成品种。实际发生变异的BN6和BN7的图片资料见图3，BN6叶面表现较为均勻的缺绿状态，叶斑点浅黄色，特点是主要叶脉不缺绿；BN7叶面则呈不规则的大块黄斑，且分布不均勻，在斑块区域的叶脉颜色与斑块颜色一致。
表一
权利要求
1.一种簕杜鹃的化学诱变育种法，其特征在于，包括如下步骤取材选择深红色花系的母本，冬季取材；材料诱变处理将准备好的材料全部浸入诱变剂处理液中，密封放置在黑暗处，浸泡一定时间，保持一定的温度；诱变材料的扦插浸泡后的材料用流水冲洗，随即扦插在温室的育苗床中，控制温湿度，保持一定的日光照射；突变株的选择种植50 60天后，通过与对照进行对比，选择存活的叶色突变性状，进行连续扦插繁殖，直至叶色突变性状保持稳定；确定新品系确定叶色突变性状遗传稳定的突变株为新品系。
2.权利要求1所述的簕杜鹃的化学诱变育种法，其特征在于，所述取材选取一年生向阳的簕杜鹃枝条，剪成10 12cm左右的扦插条，每个扦插条留2 4个芽。
3.权利要求2所述的簕杜鹃的化学诱变育种法，其特征在于，所述扦插条的生物学顶端用固体蜡封闭，下端削成楔形待用。
4.权利要求1所述的簕杜鹃的化学诱变育种法，其特征在于，所述诱变剂为NaR。
5.权利要求4所述的簕杜鹃的化学诱变育种法，其特征在于，所述Ni^3浓度为 1-lOmmol/Lo
6.权利要求1所述的簕杜鹃的化学诱变育种法，其特征在于，所述材料诱变处理中，浸入诱变剂处理液中的材料，浸泡时间为Mh，处理温度为25°C。
7.权利要求1所述的簕杜鹃的化学诱变育种法，其特征在于，所述诱变材料的扦插中浸泡后的材料用流水冲洗45min，扦插后的温度控制在25-30 °C，空气湿度保持在60 %以上，2000LUX的日光照射。
8.权利要求1所述的簕杜鹃的化学诱变育种法，其特征在于，所述确定叶色变异性状遗传稳定的突变株为新品系的具体方法为对表型较为稳定的变异株进行同工酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，比较对照和突变株同工酶的酶谱，排除潜在的嵌合体，确定变异株目的性状遗传的稳定性，筛选出新品系。
全文摘要
一种簕杜鹃的化学诱变育种法，本发明涉及木、藤本植物的无性繁殖和化学诱变育种领域。采用叠氮化钠NaN3对簕杜鹃的扦插条进行处理，利用连续扦插繁殖，创造出有利于叶色突变体生长的时间和空间，通过世代选择而获得遗传稳定的具有观赏价值的新品系，达到化学诱变育种的目的。该技术方案能一次性就地处理大批母本材料，相对大大增加了变异株的基数，突变频率高，且处理成本相对低廉，能够有效的缩短育种周期。利用连续扦插的繁殖方式，保证叶色突变体的生长具有竞争性，有利于克服嵌合体的产生，获得稳定均一的变异植株。该方案能够获得较高频率的突变，且变异谱较广，有利于簕杜鹃品种的改良。
文档编号A01H1/06GK102499071SQ20111042027
公开日2012年6月20日 申请日期2011年12月15日 优先权日2011年12月15日
发明者刘伟, 陈庭 申请人:深圳市仙湖植物园管理处