专利名称：苏云金杆菌固体发酵工艺及其在农业中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属微生物，植物保护和土壤肥料领域。特别涉及苏云金芽胞杆菌菌株利用玉米芯作为基质的固体发酵工艺及其在玉米秸杆促腐中的应用。
背景技术：
农作物秸杆是自然界中存在最丰富的一类可再生资源，我国年产各种农作物秸杆约5.7亿U占世界秸杆总产量的20 % 30 % (毕于运，2008)，因此，农作物秸杆的循环利用，引起了广泛关注。玉米秸杆是我国北方旱作区的主要秸杆之一，其还田再利用是目前较为普遍的农艺措施，也是一项培肥地力和增产增效的农艺措施。随着秸杆还田实行少耕、免耕面积的不断扩大，玉米秸杆直接粉碎还田等农艺措施的使用，自然情况下，秸杆腐解慢的问题则成为了影响·下茬作物产量的关键问题。在我国小麦-玉米轮作区，由于还田的玉米秸杆腐解时间较长，一方面，秸杆还田致使土壤变得过于松透，大孔隙过多，播种后土壤与种子不能紧密接触，影响小麦种子发芽，到冬季又易造成小麦冻害；另一方面，也为鞘翅目害虫蛴螬等地下害虫在土壤中长时间存活提供了十分有利的孳生场所，这些未经腐熟的秸杆都是蛴螬良好的饲料，十分利于蛴螬的繁殖与生长，甚至导致蛴螬爆发(臧冬初等，2010)，给小麦生产又带来潜在危害，影响小麦高产稳产。因此，目前急需一种能促进秸杆快速腐解，同时又对根部蛴螬等地下害虫有效的材料和方法。目前已发现多种芽胞杆菌具有纤维素分解能力，筛选秸杆腐解效果好的芽胞杆菌已成为产纤维素酶微生物的一个重要方向(顿宝庆等，2008)。芽胞杆菌的优势主要表现在以下方面:一方面，芽胞杆菌制剂在休眠期产生芽胞，芽胞具有耐受高温和具有良好的贮存性能；另一方面，由于芽胞杆菌繁殖快，易于发酵，利于工业化生产。但是，目前发现的分解纤维素芽胞杆菌均未涉及对蛴螬的防治效果，因此，急需一种能够实现促进秸杆腐解，又可以持续控制地下害虫蛴螬，降低农药残留，实现秸杆促腐、保苗、增产的芽胞杆菌。
发明内容
有鉴于此，本发明提供苏云金杆菌固体发酵工艺及其在农业中的新应用。该苏云金芽胞杆菌的保藏编号为CGMCC N0.5437。该苏云金杆菌能够实现促进玉米秸杆腐解，同时持续控制地下害虫蛴螬的目的，在降低农药残留的同时，实现小麦的增产，增收。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案:
本发明提供了一株苏云金芽胞杆菌，其保藏编号为CGMCC N0.5437。该菌株经Bt杀虫蛋白cry基因鉴定，存在对蛴螬有毒性的cry8Ea基因。本发明还提供了保藏编号为CGMCC N0.5437的苏云金芽胞杆菌高效分解秸杆菌株的获得，所述秸杆为玉米秸杆，筛选方法采用水解圈测定和纤维素酶酶活测定。利用温度筛选法(65°C水浴20min)对分离到的58株Bt菌株进行秸杆分解能力的筛选，具体方法采用Hart T D的水解圈测定法。将获得的菌株分别转接于玉米秸杆粉替代羧甲基纤维素钠(CMC-Na)的鉴别培养基平板上培养24h，刚果红染色培养好的平板，染色30min后，倒出染色液，再用NaCl洗涤15min，每菌株重复4次，测量水解圈直径，保藏编号为CGMCC N0.5437的苏云金芽胞杆菌Bt HBl菌平均水解圈直径为(1.8±0.06) cm，水解能力最强。将保藏编号为CGMCC N0.5437的苏云金芽胞杆菌Bt HBl菌分别接种到玉米秸杆粉替代羧甲基纤维素钠(CMC-Na)鉴别培养基上，在30°C，200rpm震荡培养24 h，按照DNS法分别测定菌株的内切型葡聚糖酶(CMC酶)、滤纸酶(FPA酶)、和半纤维素酶的酶活，在玉米秸杆培养基上测得CMC酶酶活和FPA酶酶活分别达34.599U和27.396U，半纤维素酶酶活41.839U。再次证明该菌株对玉米秸杆有腐解作用。本发明还提供了一种菌肥，其包括保藏编号为CGMCC N0.5437的苏云金芽胞杆菌及肥料中可接受的佐剂。其对大黑鳃金龟二龄幼虫7d的胃毒活性，LC5tl为6.43X IO6Cells/mL，毒力回归方程为y=4.1909x+21.467。作为优选，所述苏云金芽胞杆菌的含量彡109CFU/g。本发明还提供了上述菌肥的发酵工艺，包括如下步骤:
步骤1:挑取保藏编号为CGMCC N0.5437的苏云金芽胞杆菌置于LB液体培养基中，于30 37°C、200 220 rpm培养10 16h，得第一培养物；
步骤2:将所述第一培养物按5 10 %的接菌量转接于LB液体培养基中，于30 37 0C >200 220 rpm培养20 28h，得第二培养物。步骤3:将第二培养物做为固态摇瓶发酵的种子液，按8 12%的接菌量转接至固态摇瓶发酵培养基中，摇匀后30 37°C培养120 168 h，即得；所述固态摇瓶发酵培养基包括:玉米芯粉28 32重 量份，水68 72重量份，CaCO3 0.05重量份，K2HPO4 0.075重量份，MgSO4 0.035重量份。作为优选，上述菌肥的施用量为75 150kg/公顷。本发明还提供了一株苏云金杆菌菌株及其在玉米秸杆促腐中的应用，该苏云金芽胞杆菌的保藏编号为CGMCC N0.5437。包含保藏编号为CGMCC N0.5437的苏云金芽胞杆菌的菌肥在盆栽试验和田间生产中的应用。在盆栽试验中，通过设置不同的秸杆干粉用量、土壤质量和保藏编号为CGMCCN0.5437菌的固体发酵产物之间的不同比例，筛选经济有效的配比，以确定在花盆中的最优使用配比和使用方法。通过试验确定为I kg 土壤,加入玉米稻杆干粉4 5 g,包含保藏编号为CGMCC N0.5437的苏云金芽胞杆菌菌肥I 3 g，然后浇水，使土壤含水量为20% 25%为宜。10 d时，在添加苏云金芽胞杆菌菌肥的处理组，玉米秸杆干粉的腐解率在51.6% 55.3%之间，而对照组腐解率在35.4% 39.2%之间，能够快速腐解玉米秸杆，且秸杆腐解率随时间的延长而提高。在田间，通过调查每亩玉米秸杆质量，设置不同发酵液用量和土壤含水量，筛选经济有效的使用方法。通过试验确定为:在玉米收获后立即将玉米秸杆粉碎，翻耕，通过浇水或其他方法保持土壤相对湿度在65% 80%之间，将包含保藏编号为CGMCC N0.5437的苏云金芽胞杆菌的菌肥每667m2喷洒5 10kg，立即耕翻或者旋耕，使粉碎后的玉米秸杆和耕层土壤混匀，10 d时腐解率达到41.6% 57.8%。30 d时腐解率达到65.2% 77.5%，腐解率随时间的延长而提高。出苗率增加8.2 16.8%，实现了快速腐解秸杆保苗的目的。本发明涉及该菌肥利用保藏编号为CGMCC N0.5437的苏云金杆菌用玉米芯粉发酵得到，菌株分离自土壤，玉米芯材料不造成环境污染，不影响土壤环境自身平衡，有利于土壤自净；且其芽胞含量高、用量少，且无毒无致病性，对人畜安全，生产成本低；玉米秸杆的快速腐解能够改善土壤的理化性质，为作物生长提供合适的土壤环境，减轻死苗、冻害及病虫害给作物带来的危害。对于秸杆的高效利用及后茬作物小麦的生产具有保苗增产作用。生物保藏说明
分类命名:苏云金芽胞杆菌，Bacillus thuringiensis HBl菌株于2011年11月3日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC N0.5437。
具体实施例方式以下叙述本发明的实施例。应该说明的是，这些实施例对本发明只有说明作用，没有限制作用。本发明公开了一株苏云金芽胞杆菌菌株及其在玉米秸杆促腐中的应用，特别需要指出的是，尽管在实施例中详尽描述了保藏编号为CGMCC N0.5437菌株在玉米秸杆促腐中的应用，然而这并不意味着本发明的Bt HBl只限于对玉米秸杆的分解能力及在上述体系中的应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本发明提供了一株苏云金芽胞杆菌，其保藏编号为CGMCC N0.5437。该菌株经Bt杀虫蛋白cry基因鉴定，存在对蛴螬有毒性的cry8Ea基因。本发明还提供了保藏编号为CGMCC N0.5437的苏云金芽胞杆菌高效分解秸杆菌株的获得，所述秸杆为玉米秸杆，筛选方法采用水解圈测定和纤维素酶酶活测定。利用温度筛选法(65°C水浴20min)对分离到的58株Bt菌株进行秸杆分解能力的筛选，具体方法采用Hart T D的水解圈测定法。将获得的菌株分别转接于玉米秸杆粉替代羧甲基纤维素钠(CMC-Na)的鉴别培养基平板上培养24h，刚果红染色培养好的平板，染色30min后，倒出染色液，再用NaCl洗涤15min，每菌株重复4次，测量水解圈直径，保藏编号为CGMCC N0.5437的苏云金芽胞杆菌Bt HBl菌平均水解圈直径为(1.8±0.06) cm，水解能力最强。将保藏编号为CGMCC N0.5437的苏云金芽胞杆菌Bt HBl菌分别接种到玉米秸杆粉替代羧甲基纤维素钠(CMC-Na)鉴别培养基上，在30°C，200rpm震荡培养24 h，按照DNS法分别测定菌株的内切型葡聚糖酶(CMC酶)、滤纸酶(FPA酶)、和半纤维素酶的酶活，在玉米秸杆培养基上测得CMC酶酶活和FPA酶酶活分别达34.599U和27.396U，半纤维素酶酶活41.839U。再次证明该菌株对玉米秸杆有腐解作用。本发明还提供了一种菌肥，其包括保藏编号为CGMCC N0.5437的苏云金芽胞杆菌及肥料中可接受的佐剂。其对大黑鳃金龟二龄幼虫7d的胃毒活性，LC5tl为6.43X IO6Cells/mL，毒力回归方程为y=4.1909x+21.467。作为优选， 所述苏云金芽胞杆菌的含量彡109CFU/g。本发明还提供了上述菌肥的发酵工艺，包括如下步骤:步骤1:挑取保藏编号为CGMCC N0.5437的苏云金芽胞杆菌置于LB液体培养基中，于30 37°C、200 220 rpm培养12 16h，得第一培养物；
步骤2:将所述第一培养物按5 10 %的接菌量转接于LB液体培养基中，于30 37 0C >200 220 rpm培养22 26h，得第二培养物。步骤3:将第二培养物做为固态摇瓶发酵的种子液，按8 12%的接菌量转接至固态摇瓶发酵培养基中，摇匀后30 37°C培养120 160 h，即得；所述固态摇瓶发酵培养基包括:玉米芯粉28 32重量份，水68 72重量份，CaCO3 0.05重量份，K2HPO4 0.075重量份，MgSO4 0.035重量份。作为优选，上述菌肥的施用量为75 150kg/公顷。 本发明还提供了一株苏云金杆菌菌株及其在玉米秸杆促腐中的应用，该苏云金芽胞杆菌的保藏编号为CGMCC N0.5437。包含保藏编号为CGMCC N0.5437的苏云金芽胞杆菌的菌肥在盆栽试验和田间生产中的应用。在盆栽试验中，通过设置不同的秸杆干粉用量、土壤质量和保藏编号为CGMCCN0.5437菌的固体发酵产物之间的不同比例，筛选经济有效的配比，以确定在花盆中的最优使用配比和使用方法。通过试验确定为I kg 土壤,加入玉米稻杆干粉4 5 g,包含保藏编号为CGMCC N0.5437的苏云金芽胞杆菌菌肥I 3 g，然后浇水，使土壤含水量为20% 25%为宜。10 d时，在添加苏云金芽胞杆菌菌肥的处理组，玉米秸杆干粉的腐解率在51.6% 55.3%之间，而对照组腐解率在35.4% 39.2%之间，能够快速腐解玉米秸杆，且秸杆腐解率随时间的延长而提高。在田间，通过调查每 亩玉米秸杆质量，设置不同发酵液用量和土壤含水量，筛选经济有效的使用方法。通过试验确定为:在玉米收获后立即将玉米秸杆粉碎，翻耕，通过浇水或其他方法保持土壤相对湿度在65% 80%之间，将包含保藏编号为CGMCC N0.5437的苏云金芽胞杆菌的菌肥每667m2喷洒5 10kg，立即耕翻或者旋耕，使粉碎后的玉米秸杆和耕层土壤混匀，10 d时腐解率达到41.6% 57.8%，30 d时腐解率达到65.2% 77.5%，且腐解率随时间的延长而提高。出苗率增加8.2 16.8%，实现了快速腐解秸杆保苗的目的。本发明涉及该菌肥利用保藏编号为CGMCC N0.5437的苏云金杆菌用玉米芯粉发酵得到，菌株分离自土壤，玉米芯材料不造成环境污染，不影响土壤环境自身平衡，有利于土壤自净；且其芽胞含量高、用量少，且无毒无致病性，对人畜安全，对于秸杆的高效利用及后茬作物小麦的生产具有保苗增产作用。本发明提供的苏云金芽胞杆菌菌株、菌肥中所用试剂均可由市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明:
实施例1.高效分解纤维素Bt菌株筛选
对利用温度筛选法(65°C水浴20min)得到的58株Bt菌株进行高效分解纤维素菌株的筛选。采用Hart T D (Hart T D，2002)的水解圈测定法。将获得的菌株分别转接于玉米秸杆粉替代羧甲基纤维素钠(CMC-Na)鉴别培养基平板上培养24h，然后用刚果红染色培养好的平板，染色30min后，倒出染色液，再用NaCl洗涤15min，每菌株重复4次，测量水解圈直径，比较各菌株的水解能力。结果如表I所示，其中保藏编号为CGMCC N0.5437的苏云金杆菌Bt HBl对玉米稻杆的分解能力最强,水解圈直径达到(1.8±0.06) cm。实施例2.高效分解纤维素Bt菌株酶活分析将Bt HBl菌株分别接种到秸杆替代羧甲基纤维素钠(CMC-Na)鉴别培养基上，在30°C，200rpm震荡培养72 h，按照DNS法分别测定菌株的内切型葡聚糖酶(CMC)、滤纸酶(FPA)、半纤维素酶的酶活。在玉米秸杆培养基上测得CMC酶酶活和FPA酶酶活分别达34.599U和27.396U，半纤维素酶酶活41.839U。再次证明该菌株对玉米秸杆有腐解作用。实施例3.Bt HBl菌基因型及杀虫活性鉴定
参考苏旭东等方法(苏旭东，2005)对保藏编号为CGMCC N0.5437的苏云金芽胞杆菌BtHBl菌株的杀虫cry基因进行crjd-9基因型鉴定，进行PCR分析及序列测定；结果表明，其存在crySEa基因，将该菌培养至胞晶分离，血球计数板计数，用无菌水连续稀释I X IO8 lX103cells/mL六个浓度，加入到均匀一致的土豆块中，以5-7日龄大黑鳃金龟幼虫作为供试虫种，每个处理接虫10头，重复四次，以同处理灭菌水为空白对照，，每天检查死亡情况，计算校正死亡率与LC5tl及毒力回归方程。其对大黑鳃金龟二龄幼虫7d的胃毒活性，LC5tl为
6.43X 106cells/mL，毒力回归方程为 y=4.1909x+21.467，毒性高 实施例4菌肥的发酵工艺
挑取LB平皿上的苏云金芽胞杆菌单菌落放在3mL的LB液体培养基中，置30°C、220rpm恒温摇床下培养16h,获得第一培养物；
将第一培养物按1%的接菌量转接在LB液体培养基中，置于30°C、220rpm恒温摇床下培养28h，获得第二培养物；
将第二培养物做为固态摇瓶发酵的种子液，按12%转接至固态摇瓶发酵培养基中，摇匀后30°C培养168h ;该菌肥的固态摇瓶发酵培养基为:玉米芯粉28重量份，水72重量份，CaCO3 0.05 重量份，K2HPO4 0.075 重量份，MgSO4 0.035 重量份。晾干阴干，装袋。实施例5菌肥的发酵工艺
挑取LB平皿上的苏云金芽胞杆菌单菌落放在3mL的LB液体培养基中，置37°C、200rpm恒温摇床下培养10小时，获得第一培养物；
将第一培养物按10%的接菌量转接在LB液体培养基中，置于37°C、200rpm恒温摇床下培养20小时，获得第二培养物；
将第二培养物做为固态摇瓶发酵的种子液，按8%转接至固态摇瓶发酵培养基中，摇匀后37°C培养120h ;该菌肥的固态摇瓶发酵培养基为:玉米芯粉32重量份，水68重量份，CaCO3 0.05 重量份，K2HPO4 0.075 重量份，MgSO4 0.035 重量份。晾干，阴干，装袋。实施例6 Bt HBl菌肥在盆栽中腐解玉米秸杆的方法
盆栽试验中，在装有1.5kg 土的花盆中，均匀混入8.0g玉米秸杆干粉和包含保藏编号为CGMCC N0.5437的苏云金芽胞杆菌菌肥3 5g，然后浇水保湿，使土壤含水量为20% 25%为宜。10 d时，玉米秸杆干粉的腐解率在51.6% 55.3%之间，而对照组腐解率在35.4% 39.2%之间，且稻杆腐解率随时间的延长而提闻。实施例7 Bt HBl菌肥在玉米秸杆还田地块促进玉米秸杆腐解的方法 玉米收获后，将玉米秸杆粉碎，使粉碎的秸杆均匀平铺在土表，浇水或保持土壤湿度使土壤相对湿度在65% 80%之间，将包含保藏编号为CGMCC N0.5437的苏云金芽胞杆菌的菌肥每667m2喷洒5 10kg，立即耕翻或者旋耕，使粉碎后的玉米秸杆和耕层土壤混匀，10 d时腐解率达到41.6% 57.8%。且腐解率随时间的延长而提高。出苗率增加8.2 16.8%，实现了快速腐解秸杆保苗的目的。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.苏云金芽孢杆菌(保藏编号为CGMCCN0.5437)在农业中的应用；所述应用为在玉米秸杆促腐中的作用；所述秸杆为干粉或湿秸杆。
2.一种菌肥，其特征在于，其包括保藏编号为CGMCC N0.5437的苏云金芽孢杆菌及肥料中可接受的佐剂。
3.根据权利要求3所述菌肥，其特征在于，所述苏云金芽孢杆菌的含量>IO9 CFU/g。
4.根据权利要求3或4所述菌肥的固态摇瓶发酵工艺，其特征在于:包括如下步骤: 步骤1:挑取保藏编号为CGMCC N0.5437的苏云金芽孢杆菌置于LB液体培养基中，于30 37°C、200 220 rpm培养10 16h，得第一培养物； 步骤2:将所述第一培养物按5 10 %的接菌量转接于LB液体培养基中，于30 370C >200 220 rpm培养20 28h，得第二培养物； 步骤3:将第二培养物做为固态摇瓶发酵的种子液，按8 12%的接菌量转接至固态摇瓶发酵培养基中，摇勻后于30 37°C培养120 168 h后即得；所述固态摇瓶发酵培养基包括:玉米芯粉28 32重量份，水68 72重量份，CaCO3 0.05重量份，K2HPO4 0.075重量份，MgSO4 0.035重量份。
5.根据权利要求3、4或5任一项所述菌肥，其特征在于，其施用量为75 150kg/公顷。
全文摘要
本发明属于微生物、土壤肥料和植物保护技术领域。秸秆还田是一项培肥地力和增产增效的农艺措施。秸秆在土壤中腐解时间长将造成土壤空隙大，容易形成死苗、冻害、蛴螬等地下害虫孳生等生产问题。本发明提供一种以玉米芯为主要原料，包含保藏编号为CGMCCNo.5437苏云金杆菌的菌肥在盆栽实验及秸秆还田土壤中的应用方法。盆栽试验中添加菌肥的处理组，玉米秸秆干粉10d的腐解率在51.6%～55.3%之间，在田间，鲜秸秆10d时腐解率达到41.6%～57.8%之间，小麦出苗率增加8.2～16.8%，实现了快速腐解秸秆，对后茬作物小麦的生产也具有保苗增产作用。同时，该菌肥来源于土壤，不污染环境，生产成本低。
文档编号C05F11/08GK103159511SQ20111042075
公开日2013年6月19日 申请日期2011年12月16日 优先权日2011年12月16日
发明者陆秀君, 刘文菊, 耿丽平, 郭巍, 刘云飞, 杨军玉, 李瑞军, 陶晡, 李静, 刘廷辉 申请人:河北农业大学