专利名称：植物表达贻贝粘合蛋白Mefp-5的方法
技术领域：
本发明涉及一种使植物表达贻贝粘合蛋白Mefp-5的方法，属于植物基因工程技术领域。
背景技术：
贻贝足丝盘分泌的贻贝粘合蛋白质(Mussel Adhesive ftOtein)在湿性环境中任何类型的物质表面上(如金属、木材、玻璃、矿物、骨骼等)具极强粘合性，如与岩石、 船体等牢固连接。目前认为贻贝粘合蛋白质的强粘合性主要是贻贝足丝蛋白 edulis footprotein，Mefp)中含高浓度的特殊氨基酸3，4_ 二羟基苯丙氨酸(3，4 -dihydroxyphenyl alanine, DOPA)可与蛋白质等极性聚合物间形成很强的氢键结合，DOPA 的苯酚基团具有很强的金属络合能力，可以在水中材料表面能形成不可逆的有机金属络合物。Mefp分泌时为液态，能在水下很快固化形成具有粘附能力的附着基，Mefp含有酪氨酸翻译后修饰的D0PA，实现粘合蛋白分子内部的交联，使粘合蛋白质固化并具有防水粘合强度高的优异性能。研究贻贝粘合蛋白质的生物分布和氨基酸组成发现，Mefp具有多个串联起来的寡肽重复单元，且DOPA含量较高，通过交联和络合将大量铁离子变为坚韧而致密的涂层，其中Mefp-5的DOPA的含量最高，每4个氨基酸中含有超过1个的D0PA，摩尔分数达到30%，主要分布在足丝的附着基上。Mefp-5含有74个残基，其超过三分之一的是翻译后被羟基化或磷酸化修饰过，其中酪氨酸羟基化作用转变为D0PA，或丝氨酸磷酸化作用转变为0-磷酸丝氨酸，对钙亲和力很强，从而使Mefp-5的粘接能力最强。天然贻贝粘合蛋白在湿性条件下优良的粘接强度，作为一种生物防腐剂和粘合剂，不会造成环境污染，在生物安全性和相容性方面具有化学合成的粘合剂无可替代的优势，因此在医用方面有极大的应用价值。这些已经被类似的从I eWh提取的粘附蛋白的细胞和组织粘附剂CELL-TAK (美国BD Bioscienee公司)开始应用与临床；从I edulis 中提取粘附蛋白用于猪皮粘接的研究报道进一步证实。贻贝粘合蛋白正常情况下依靠贻贝分泌产生，呈液态，可以直接从海洋贻贝足部提取获得，但是天然贻贝分泌的液态蛋白量极少，在短时间内会发生固化，而且提取成本很高，使得贻贝粘合蛋白的材料来源非常短缺。近年来，人们开始尝试通过基因工程的手段获得具有天然修饰的贻贝粘合蛋白特性的基因工程产物的粘合蛋白。已有研究重组融合贻贝粘合蛋白可以有效凝聚在金属材料 (如钛)表面促进成骨细胞的增殖，得到的重组粘合蛋白材料类似并优于天然粘合剂。Inoue 等最早克隆到了贻贝粘合蛋白的cDNA (召iW Bull, 1994，186:349)，Waite等将粘合蛋白的cDNA转入大肠杆菌U/w # 7 Jcat/5bi, 1999，18:301)，郑昕等将粘合蛋白的cDNA转入巴斯德毕赤酵母(大连轻工业学院学报，2002，21 :100-102)，但均未表达出具有粘接活性的蛋白。Jos印h等将粘合蛋白基因Mefp-3在酵母07炒hciis)中通过融合表达得到蛋白，初步表明了 Mefp-3在真核表达系统中的自组装能力和其在粘合剂的形成过禾呈中白勺作用(/7TOiei/ Expression and Purification， 2008, 57 (1) :57 - 62)。 Dong等首次将Mefp-3，5的基因在大肠杆菌表达出粘接活性的蛋白，粘接力可达500nN，但表达
and Environmental Microbiology， 2004，70: 3352-9 -,Prog, 2005，21:965-970)；其与六聚His的融合表达的Mefp-5对细胞贴壁效果更好，但存在产率低、纯化量低和纯化后不溶解等种种缺陷。植物基因工程获得贻贝粘合蛋白，可以克服原核表达系统的缺陷(如完成外源蛋白修饰和正确折叠困难)，植物表达系统在规模化生产、安全性和生产成本方面比传统的细菌、动物细胞和转基因动物系统均具有较大优势，如植物系统表达蛋白所需成本仅为原核表达系统的1/50。
发明内容
本发明的目的是提供一种使植物表达贻贝粘合蛋白Mefp-5的方法，为从植物中得到贻贝粘合蛋白材料来源提供一条新的途径，推动植物基因工程及医用粘合剂应用的深入研究。
本发明实现过程如下
一种使植物表达贻贝粘合蛋白Mefp-5的方法，其特征在于包括如下步骤
(1)植物转化受体的获得；
(2)构建粘合蛋白基因基因的植物表达载体；
(3)采用农杆菌介导法将基因转入烟草，获得转基因植株。上述步骤(1)中，使用烟草种子接种在MS培养基得到无菌苗，无菌苗叶片切块在MS分化培养基上分化不定芽，不定芽接种在MS生根培养基中生根，建立烟草离体再生体系，再生的烟草植株作为基因转化受体；所述的MS分化培养基为MS培养基+1. 5mg/L 6-BA ；MS生根培养基组成为MS培养基+0. 2mg/L NAA。上述步骤(2)包括以下步骤
(A)利用PCR方法克隆粘合蛋白基因Mefp-5，测序鉴定；
(B)粘合蛋白基因Mefp-5上游连接CaMV35S启动子，下游连接NOS终止子后，形成的连接产物CaMV35S-Mefp-5-N0S插入载体pCAMBIA 1300的多克隆位点构建植物表达载体，命 SSpMF ；
(C)采用冻融法将pMF和命名为pMFck的对照pCAMBIA1300导入农杆菌LBA4404中， 用于植物的遗传转化。上述步骤(3)包括以下步骤
(A)烟草叶片切块经农杆菌感染后，培养于MS筛选培养基中，诱导不定芽的分化；
(B)筛选培养基上进行抗性筛选培养40 50d，得到假定烟草转基因小苗；
(C)对转化烟草pMF、pMFck及其未转基因的亲本对照CK株系进行PCR、RT-PCR扩增， 证明Mefp-5在烟草基因组DNA中的整合和表达，得到可表达粘合蛋白基因的转基因烟草。所述步骤(A)中农杆菌感染条件为烟草外植体预培养2d，农杆菌浓度0D_=0. 6， 浸染20min，不附加诱导剂乙酰丁香酮。烟草叶片切块为4周龄。筛选培养基为MS分化培养基+ 30mg/L潮霉素+ 300mg/L头孢霉素。本发明的优点和积极效果
4本发明粘合蛋白基因Mefp-5的转化在细胞水平上进行，提高了获得转基因植株的遗传稳定性，有效避免嵌合基因植株的产生；构建的Mefp-5植物表达载体有双子叶植物喜好的启动子和终止子，适用于双子叶植物的遗传操作；本发明获得带有Mefp-5基因植株，表达粘合蛋白Mefp-5，为优质蛋白类粘合剂一贻贝粘合蛋白的材料来源提供一条生物技术新途径。
图1为受体外植体“秦烟95”的离体再生体系；
A无菌苗的叶片切片；B叶片切块边缘膨大，产生不定芽；C不定芽形成丛生苗；D丛生小苗生根；
图2为基因的测序结果；A反向测序结果B正向测序结果； 图3为含Mefp基因的植物表达载体pMF ； 图4为pMF的酶切验证； 图5为培养、筛选得到转基因植株；
A叶片切口处开始分化；B Hyp抗性不定芽(绿色)；C绿色Hyp抗性苗，白色非转化苗；D Hyp抗性小苗生根生根；E移栽成活的pMF转基因再生植株； 图6为转基因植株的分子检测；
A Hyp基因的PCR分析；B Mefp-5基因的PCR分析；C Mefp-5基因的RT-PCR分析； P—质粒阳性对照；M_Marker ；CK—未转基因烟草植株；广6—pMF转基因株系； ① ④一pMFck转基因株。
具体实施例方式以下通过实施例进一步描述本发明。本发明使用的缩略语对应的中文名称如下
本发明使用的MS基本培养基按手册通用方法配制，组成与含量如下大量元素 NH4NO3 1650mg/L, KNO3 1900 mg/L, CaCl2 · 2H20 440 mg/L, MgSO4 · 7H20 370mg/L, KH2PO4 1700mg/L ；微量元素:KI 0. 83 mg/L, H3BO3 6. 2 mg/L, MnSO4 · 4H20 22. 3 mg/L, ZnSO4 · 7H20 8. 6 mg/L, Na2Mn04 · 2H20 0. 25 mg/L, CuSO4 · 5H20 0. 025 mg/L, CoCl2 · 6H20 0. 025mg/L, FeSO4 ·7Η20 (27. 8)mg/L +Na2-EDTA ·2Η20 (27. 3)mg/L ；有机成分肌醇 100mg/L，烟酸 0.5 mg/L，盐酸吡哆醇(维生素 )0.5 mg/L，盐酸硫胺素(维生素&) 0. 5mg/L，甘氨酸2 mg/L。本发明使用的培养基组成如下
MS培养基组成为MS基本培养基+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂，pH为5. 8 ； MS分化培养基组成为MS培养基+1. 5mg/L 6-BA, pH为5. 8 ； MS生根培养基组成为MS培养基+0. 2mg/L NAA, pH为5. 8 ；
MS筛选培养基组成为MS分化培养基+ 30mg/L潮霉素(Hyg)+ 300mg/L头孢霉素 (Cef)，pH 为 5.8。YEB基本培养基组成为牛肉浸膏5 g/L，酵母浸膏1 g/L，蛋白胨5 g/L，蔗糖5 g/ L，0. 002 mmol/L MgSO4. 7H20 ；
YEB液体培养基组成为YEB基本培养基，附加lOOyg/mL链霉素(Str. ),50yg/mL卡那霉素，ρΗ7· 2 ；
实施例1转基因受体植物烟草的高效再生体系确立
本发明所用烟草品种为“秦烟95”，常规MS培养基萌发产生无菌苗。以无菌苗的叶片 (图1Α)为外植体，在25士2°C，光照强度为30 50 mol · πΓ2 · s—1，16h/8h光/暗培养条件下，叶片切块在MS分化培养基上诱导出芽(图1 B)，形成丛生苗(图1 C)，分化率为100%。 将高2cm左右的不定芽转到MS生根培养基7d后即诱导生根(图1 D)。本发明建立的烟草离体再生体系分化率高、再生快，适合作为基因转化受体。实施例2粘合蛋白基因克隆和植物表达载体构建
本发明所用目的基因为粘合蛋白基因根据GenBank中粘合蛋白基因ife/pi 序列，设计引物利用PCR克隆粘合蛋白基因ife//7i，连接到T载体后，测序鉴定(图2)。将序列正确的基因经BamHI和Mil酶切回收，同时回收经EcoRI和BamHI 酶切的CaMV35S启动子片段、SalI和I^stI酶切的NOS终止子片段，连接酶进行连接后，插入植物双元表达载体pCAMBIA 1300多克隆位点EcoRI和I3StI之间，以得到串联CaMV35S_ Mefp-^-NOS的植物表达载体，命名为pMF (图3)，转化子质粒DNA，进行酶切鉴定(图4)。采用液氮速冻5 min，37°C水浴热激2 min，复苏培养2小时的冻融方法将重组质粒导入农杆菌LBA4404的感受态细胞中，用于植物的遗传转化。同时采用冻融法将 pCAMBIA 1300导入农杆菌LBA4404中，用作后期植物遗传转化的阴性对照，命名为pMFck (不含基因)。实施例3转基因烟草的获得
对照烟草(CK)叶片在附加不同潮霉素浓度梯度(5、10、20、30、40、50mg/L)的MS分化培养基培养，根据不定芽分化及存活情况，确定转化受体叶片对选择剂潮霉素的敏感性为 30mg/Lo以4周龄的烟草叶片切块(5mmX5mm)预培养0，1，2，3和4天后，进行含pMF和 pMFck植物表达载体的农杆菌转化浸染，浸染时采用不同农杆菌浓度(0D_=0. 2、0. 4、0. 6、 0. 8、1.0)，不同浸染时间(10、15、20、25和30min)，不同诱导物乙酰丁香酮(AS)浓度(0、10、 20、30、40mg/L)，然后经共培养和筛选培养，统计烟草抗性不定芽和白化苗发生率以获得农杆菌转化优化的程序。转化程序为预培养2d，农杆菌浓度为0D_=0. 6，浸染20min，不附加诱导剂AS转化效果最好，pMF和pMFck农杆菌转化的抗性发生率分别为56. 3%和51. 7%。预培养2d的烟草叶片用OD6tltl = 0.6的农杆菌菌液感染20min，置于MS分化培养基上共培养。5d后转化的烟草外植体转入MS筛选培养基上除菌并诱导抗性不定芽。选择培养3d时，外植体边缘开始形成不定芽(图5 A)，但这些不定芽中的绝大多数在MS筛选培养基上继代培养过程中逐渐白化，仅少数可以分化出再生苗(图5 B);随着在筛选培养基上继代次数的增多，抗性再生苗仍呈现绿色(图5 C)。所有处理在25士2°C、光照强度为30 50mol · πΓ2 · s—1的培养室内进行16h/ !光/暗培养，2周转接一次，连续继代培养。待再生绿苗生长到1 2cm高时，将其从母体上切下，随即插入附加30mg/L潮霉素的MS生根培养基上诱导生根(图5 D)。获得假定的外源粘合蛋白Mefp-5基因转化烟草再生植株。以常规CTAB法提取假定的转基因植株基因组DNA，Trizol法提取RNA，根据Hyg、 Mefp-5基因序列设计合成PCR引物，分别对转化烟草pMF (编号1 6)、pMFck (编号① ④)及其未转基因的亲本对照(CK)株系进行场叉截1//7-5基因的PCR、以及ife//7-5基因的RT-PCR分子生物学检测。其中Hyg基因PCR引物上游为5，_AGC TGC GCC GAT GGT TTC TAC AA-3，，下游为 5，-ATC GCC TCG CTC CAG TCA ATG-3，，扩增片段长度为 509bp，扩增程序设定为94°C，预变性5min ;94°C，变性50 s ;60. 5°C，退火40 s;72°C，延伸30 s ；循环30 次；72°C，延伸 8min。4°C，保温。基因 PCR 及 RT-PCR 引物(MF)上游为 5，-CAA AGG TGG TTA TTA CCC-3，，下游为 5，-AAC TGT ACC ACC TCC ATA-3，，扩增片段长度为 210bp，扩增程序设定为 94°C，预变性 5 min;94°C，l min ；56°C,30 s;72°C，30 s ；循环 30 次；72°C， 延伸5 min。4 °C，保温。转基因烟草中办穿基因的PCR扩增(图6 A)与Mefp-5基因PCR 和RT-PCR扩增(图6 B、图6 C)，分别可以检测到预期的目的条带(509bp、210bp和210bp)， 表明目的基因在烟草基因组中整合并表达，阳性转基因植株是可表达粘合蛋白基因的烟草。 将鉴定后的阳性转基因烟草小苗继代扩繁，小苗高6 8cm时，打开培养瓶盖子， 25士2°C、光照强度为30 50mol · m_2 · s—1的培养室内16h/8h光/暗培养2 3天，随后于室温适应1 2天正常炼苗后，移栽至花盆土中成活(图5 E)。
权利要求
1.一种使植物表达贻贝粘合蛋白Mefp-5的方法，其特征在于包括如下步骤(1)植物转化受体的获得；(2)构建粘合蛋白基因Mefp-5基因的植物表达载体；(3)采用农杆菌介导法将Mefp-5基因转入烟草，获得转基因植株。
2.根据权利要求1所述使植物表达贻贝粘合蛋白Mefp-5的方法，其特征在于步骤 (1)中，使用烟草种子接种在MS培养基得到无菌苗，无菌苗叶片切块在MS分化培养基上分化不定芽，不定芽接种在MS生根培养基中生根，建立烟草离体再生体系，再生的烟草植株作为基因转化受体。
3.根据权利要求2所述使植物表达贻贝粘合蛋白Mefp-5的方法，其特征在于所述的MS分化培养基为MS培养基+1. 5mg/L 6-BA ；MS生根培养基组成为MS培养基+0. 2mg/L NAA。
4.根据权利要求1所述使植物表达贻贝粘合蛋白Mefp-5的方法，其特征在于步骤(2) 包括以下步骤(A)利用PCR方法克隆粘合蛋白基因Mefp-5，测序鉴定；(B)粘合蛋白基因Mefp-5上游连接CaMV35S启动子，下游连接NOS终止子后，形成的连接产物CaMV35S- Mefp-5-NOS插入载体pCAMBIA 1300的多克隆位点构建植物表达载体，命 SSpMF ；(C)采用冻融法将pMF和命名为pMFck的对照pCAMBIA1300导入农杆菌LBA4404中， 用于植物的遗传转化。
5.根据权利要求1所述使植物表达贻贝粘合蛋白Mefp-5的方法，其特征在于步骤(3) 包括以下步骤(A)烟草叶片切块经农杆菌感染后，培养于MS筛选培养基中，诱导不定芽的分化；(B)筛选培养基上进行抗性筛选培养40 50d，得到假定烟草转基因小苗；(C)对转化烟草pMF、pMFck及其未转基因的亲本对照CK株系进行PCR、RT-PCR扩增， 证明Mefp-5在烟草基因组DNA中的整合和表达，得到可表达粘合蛋白基因的转基因烟草。
6.根据权利要求5所述使植物表达贻贝粘合蛋白Mefp-5的方法，其特征在于所述的烟草叶片切块为4周龄。
7.根据权利要求5所述使植物表达贻贝粘合蛋白Mefp-5的方法，其特征在于所述的筛选培养基为MS分化培养基+ 30mg/L潮霉素+ 300mg/L头孢霉素。
8.根据权利要求5所述使植物表达贻贝粘合蛋白Mefp-5的方法，其特征在于步骤(A) 中农杆菌感染条件为烟草外植体预培养2d，农杆菌浓度0D_=0. 6，浸染20min，不附加诱导剂乙酰丁香酮。
全文摘要
本发明公开了一种使植物表达贻贝粘合蛋白Mefp-5的方法，包括如下步骤(1)植物转化受体的获得；(2)构建粘合蛋白基因Mefp-5基因的植物表达载体；(3)采用农杆菌介导法将Mefp-5基因转入烟草，获得转基因植株。本发明粘合蛋白基因Mefp-5的转化在细胞水平上进行，提高了获得转基因植株的遗传稳定性，有效避免嵌合基因植株的产生；构建的Mefp-5植物表达载体有双子叶植物喜好的启动子和终止子，适用于双子叶植物的遗传操作；本发明获得带有Mefp-5基因植株，表达粘合蛋白Mefp-5，为优质蛋白类粘合剂--贻贝粘合蛋白的材料来源提供一条生物技术新途径。
文档编号A01H5/00GK102433357SQ20111042989
公开日2012年5月2日 申请日期2011年12月21日 优先权日2011年12月21日
发明者李立文, 步怀宇, 王英娟, 赵宇玮 申请人:西北大学